агенты для кровяного депо для диагностики с помощью ядерного магнитного резонанса

Формула изобретения

Диагностический агент, содержащий хелатированные комплексы ионов двух-трех-валентных парамагнитных металлов, выбранных из группы, состоящей из Fe⁽²⁺⁾, Fe⁽³⁺⁾, Сu ⁽²⁺⁾, Cr⁽³⁺⁾, Gd⁽³⁺⁾, Eu ⁽³⁺⁾, Dy⁽³⁺⁾, Yb⁽³⁺⁾ или Мn⁽²⁺⁾ с соединениями формулы (I), а также с их солями физиологически совместимых органических оснований, выбранных из первичных, вторичных, третичных аминов, или основных аминокислот, или неорганических оснований, катионами которых являются натрий, калий, магний, кальций или их смеси:

X-L-Y (I)

где Х представляет остаток полиаминокарбоксильного лиганда или его производного, выбранный из группы, состоящей из этилендиаминотетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPA), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), 1,4,7,10-тетрааза-циклододекан-1,4,7-триуксусной кислоты (DO3A), [10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусной кислоты (HPDO3A), 4-карбокси-5,8,11-трис(карбокси-метил)-1-фенил-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-овой кислоты (BОРТА);

Y представляет производное желчной кислоты, выбранное из группы, состоящей из остатков холевой, хенодезоксихолевой, дезоксихолевой, урсодезоксихолевой, литохолевой кислот:

как таковых, а также в виде функционированных по положениям, содержащим гидроксильную группу как реакционноспособную группу, независимо от стереохимии конечных продуктов, причем указанное производное включает также конъюгат кислотной группы в положении 24 с таурином и глицином;

L представляет цепь, связанную с любым положением X, необязательно включающую одну из карбоксильных групп, которая таким образом превращается в амидную группу, и с С-3, С-7, С-12 положениями Y, и имеет следующую формулу (II):

где m представляет целое число от 1 до 10, где для значений больше 1 А может иметь различные значения,

А представлено следующей формулой (III):

n и q могут быть 0 или 1, но они не могут одновременно быть нулем,

р может принимать значения в интервале от 0 до 10,

Z представляет атом кислорода или -NR-группу, в которой R представляет атом водорода или (C₁-C ₅)алкильную группу, незамещенную или замещенную -СООН-группой,

для получения диагностических композиций для ЯМР-томографии кровеносной системы организмов человека и животных.

2. Диагностический агент по п.1, где комплексы образованы с ионами гадолиния или марганца.

3. Диагностический агент по п.1, где в формуле (I) соединительные цепи L имеют формулы (IIIa) и (IIIb):

4. Диагностический агент по пп.1-3, где Z представляет атом кислорода, а L при этом образуется за счет гидроксильных групп, присутствующих в 3, 7, 12 положениях, независимо от стереохимии конечных продуктов.

5. Диагностический агент по п.3, где остаток Х выбран из группы, состоящей из EDTA, DTPA, DOTA, DO3A, BОРТА; L выбран из группы, состоящей из (IIIa) и (IIIb) и Y выбран из группы, состоящей из остатков холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, литохолевой кислот как они есть или таких, в которых одна или более из гидроксильных групп были превращены в кетогруппы, связанные с L аминогруппой в положении 3, причем кислотная группа в положении 24 присутствует как таковая или как производное таурина или глицина; комплексы указанных соединений образованы с ионами гадолиния или марганца и катионы подходящих для нейтрализации органических оснований выбраны из группы, состоящей из этаноламина, диэтаноламина, морфолина, глюкамина, N-метилглюкамина, N,N-диметилглюкамина, или катионы неорганических оснований выбраны из группы, состоящей из натрия, калия, магния, кальция или их смесей.

6. Диагностический агент по п.5, образованный соединением общей формулы (IV)

где в формуле (I) остаток Х представляет DTPA, замещенную в центральной цепи, и где R₁ представляет атом водорода или -СООН-группу, Y выбран из группы, состоящей из остатков холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, литохолевой кислот,

L представлен структурной формулой (III).

7. Диагностический агент по п.6, образованный соединением общей формулы (IVa)

где Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV),

L представляет структурную формулу (IIIa) и (IIIb).

8. Диагностический агент по п.7, где соединение общей формулы (IVa) выбрано из группы, состоящей из

[3((S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты;

N²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3, 5)-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина;

N²-биc[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3, 5, 7, 12)-7,12-дигидрокси-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина;

[3(S), 5, 7]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(R), 5, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(RS), 5, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(RS), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидрокси-холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[[5-[бис[2-[бис(карбокси-метил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

9. Диагностический агент по п.6, образованный соединением общей формулы (IVb)

где Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV),

L представляет структурную формулу (IIIa).

10. Диагностический агент по п.9, где соединение общей формулы (IVb) выбрано из группы, состоящей из

(3, 5, 7, 12)-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

(3, 5)-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]холан-24-овой кислоты;

(3, 5, 7, 12)-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

(3, 5, 7, 12)-3-[[6-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-1-оксогексил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

11. Диагностический агент по п.5, образованный соединением общей формулы (V)

где в общей формуле (I) остаток Х представляет DTPA,

Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV),

L представляет структурную формулу (IIIa).

12. Диагностический агент по п.11, где соединение общей формулы (V) выбрано из группы, состоящей из

(3, 5, 7, 12)-3-[[N-[N-[2-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]этил]-N-(карбоксиметил)глицил]глицил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

18-[[(3, 5, 7, 12)-23-карбокси-7,12-гидрокси-24-норхолан-3-ил]амино]-3,6,9-трис(карбоксиметил)-11,18-диоксо-3,6,9,12-тетраазаоктадекановой кислоты.

13. Диагностический агент по п.5, образованный соединением общей формулы (VI)

где в общей формуле (I) остаток Х представлен DO3A,

Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV),

L выбран из формул (IIIa) и (IIIb).

14. Диагностический агент по п.11, где соединением является 10-[3-[[(3, 5, 7, 12)-23-карбокси-7,12-дигидрокси-24-норхолан-3-ил]окси]-2-гидрокси-пропил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусной кислотой.

15. Диагностический агент по п.5, образованный соединением общей формулы (VII)

где в общей формуле (I) остаток Х представляет EDTA,

Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV),

L представляет группу формулы (III).

16. Диагностический агент по п.15, где соединение общей формулы (VII) выбрано из группы, состоящей из

[3(S), 5, 12]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[[5-[[2-[бис (карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[2-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 12]-3-[[4-[[2-[[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[[2-[[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты.

17. Диагностический агент по п.1-16, где хелатные комплексные соли образованы с натрием и N-метилглюкамином.

18. Промежуточное соединение общей формулы (IVa)

где Y выбран из остатков холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, литохолевой кислот как таковых или таких, в которых одна или более гидроксильных групп были превращены в кетогруппы, связанные с L аминогруппой в положении 3, и кислотная группа в положении 24 присутствует как таковая или в виде ее тауринового или глицинового производного; причем комплексы указанных соединений образованы с ионами гадолиния или марганца и катионы оснований, подходящих для нейтрализации, выбраны из группы, состоящей из этаноламина, диэтаноламина, морфолина, глюкамина, N-метилглюкамина, N,N-диметилглюкамина, или из группы, состоящей из неорганических оснований, катионами которых являются натрий, калий, магний и кальций,

L имеет структурную формулу (IIIa) и (IIIb)

где m представляет целое число от 1 до 10,

за исключением [3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбокси-метил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты и [3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

19. Промежуточное соединение по п.18, выбранное из группы, состоящей из

[3(S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты;

[3(3), 5, 7]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты;

N²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3, 5)-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина;

N²-биc[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3, 5, 7, 12)-7,12-дигидрокси-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина;

[3(S), 5, 7]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(R), 5, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(RS), 5, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(RS), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидрокси-холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты.

20. Промежуточное соединение общей формулы (IVb)

где Y принимает значения, указанные в п.18,

L принимает значения, соответствующие формуле (IIIa), как определено в п.18,

за исключением (3, 5, 7, 12)-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты и (3, 5, 7, 12)-3-[[6-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-1-оксогексил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

21. Промежуточное соединение по п.20, выбранное из группы, состоящей из

(3, 5, 7, 12)-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

(3, 5)]-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]холан-24-овой кислоты.

22. Промежуточное соединение общей формулы (VII)

где Y принимает значения, указанные в п.18,

L обозначает формулу (III) как определено в п.1.

23. Промежуточное соединение по п.22, выбранное из группы, состоящей из

[3(S), 5, 12]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[[5-[[2-[бис (карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[2-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты;

[3(S), 5, 12]-3-[[4-[[2-[[бис (карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты;

[3(S), 5]-3-[[4-[[2-[[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты.

24. Контрастографическая диагностическая фармацевтическая композиция, включающая, по крайней мере, один из диагностических агентов по пп.1-17 или его соль по пп.1 и 4.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, включающая, кроме того, не более 5 мольных % хелатного комплекса в виде соли кальция или магния и/или физиологически приемлемого буфера, выбранного из трометамола и глицилглицина.

26. Способ получения соединений формулы (IV) в соответствии со следующей схемой:

где R₄ представляет аминозащитную группу,

R₅ представляет неразветвленный или разветвленный C₁-С₁₀ алкил или арил,

R₂ и R₃ независимо представляют атом водорода;

указанный способ отличается тем, что в исходный пирролидон вводят защитные группы R₄ и R₅, способные отщепляться в различных условиях, после чего действием амина формулы R-NH ₂, где R представляет Y, проводят реакцию трансамидирования полученного защищенного соединения, позволяющую сохранить стереохимию по хиральному центру, соседнему с атомом азота исходного пирролидона, после чего продукт трансамидирования вводят в реакцию с соединением формулы

с удалением защитной группы R₄ и образованием соответствующего N,N-дизамещенного аминопроизводного и далее, если необходимо, удаляют защитные группы, присутствующие во фрагменте R, для получения конечного продукта.

27. Способ по п.26 получения соединений

[3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты и [3(S), 5, 7, 12]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбокси-метил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому использованию комплексов ионов металлов конъюгатов желчных кислот с молекулами, обладающими хелатирующей активностью, в качестве контрастных агентов для применения в способах диагностики, известных как “ЯМР-томография”, в частности в качестве агентов для кровяного депо.

Комплексы, образованные хелатирующими агентами и подходящими металлами, уже используют в качестве контрастных агентов в следующих способах диагностики: томографии с помощью рентгеновских лучей, томографии с помощью ядерного магнитного резонанса (M.R.I.) (ЯМР-томография) и сцинтиграфии.

В частности, в медицинской диагностике, использующей ЯМР-томографию (M.R.I.), признанную мощным способом диагностики в клинической практике (Stark, D.D., Bradley, W.G., Jr., Eds. "Magnetic Resonance Imaging" The C.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri (USA), 1988), применяют, главным образом, парамагнитные фармацевтические композиции, предпочтительно содержащие хелатные комплексы ионов двух-трехвалентных парамагнитных металлов с полиаминополикарбоксильными лигандами и/или их производными или аналогами.

Изображения, полученные, по существу, за счет ЯМР-сигнала протонов воды, являются результатом сложных взаимосвязей между различными параметрами, такими как плотность протонов и время релаксации T₁ и Т₂. Усиления контраста можно достичь за счет введения экзогенных химических веществ, которые значительно изменяют резонансные характеристики соседних протонов воды (см. Lauffer, R.B. Chem. Rev. 1987, 87, 901).

Парамагнитные контрастные агенты, используемые для ЯМР-томографии, изменяют время релаксации протонов воды, присутствующей в тканях, в которых указанные контрастные агенты сконцентрированы, и поэтому они усиливают контраст между различными тканями, или между здоровой и больной тканью.

Парамагнитные комплексы гадолиния были целью исследований, публикаций и патентов благодаря своей высокой способности уменьшать время релаксации протонов соседних молекул воды в результате диполярных взаимодействий.

Некоторые из них представлены в клинической практике в качестве M.R.I. контрастных агентов:

Gd-DTPA, гадолиниевого комплекса N-метилглюкаминовой соли диэтилентриаминопентауксусной кислоты, MAGNEVIST®; Gd-DOTA, гадолиниевого комплекса N-метилглюкаминовой соли 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты, DOTAREM®; Gd-HPDO3A, гадолиниевый комплекс [10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусной кислоты, PROHANCE®; Gd-DTPA-BMA, гадолиниевый комплекс бис(метиламида) диэтилентриаминопентауксусной кислоты, OMNISCAN®.

Перечисленные выше контрастные агенты коммерчески доступны и предназначены для широкого использования. На деле, после введения для получения M.R.I. указанные контрастные агенты диффундируют в крови и во внеклеточных зонах различных частей тела, прежде чем они выводятся. Поэтому в этом плане они аналогичны иодированным соединениям, которые используют в медицине для диагностики с помощью рентгеновских лучей.

В настоящее время медицинские работники нуждаются в таких контрастных агентах, которые предназначены для исследования конкретных органов, или для томографии кровеносной системы, которую нельзя качественно определить с помощью продуктов, коммерчески доступных в настоящее время. Первоначальный подход для получения последних состоит в ковалентном связывании контрастного агента с макромолекулами, такими как белки, или в заключении их внутрь стабильных агрегатов молекул, таких как липосомы, или в использовании так называемых суперпарамагнитных частиц.

Так, например, гадолиниевый комплекс диэтилентриаминопентауксусной кислоты (Gd-DTPA) связывали с человеческим альбумином (HSA), полилизином или декстраном (Oksendal A.N. et al., J. Magn. Reson. Imaging, 157, 1993; Rocklage S.M., "Contrast Agents", Magn. Res. Imaging, Mosby Year Book, 372-437, 1992) для уменьшения или даже прекращения диффузии из крови во внеклеточную жидкость, обеспечивая тем самым более длительное пребывание агента в кровеносной системе. Такой подход, хотя и позволял достичь нужного эффекта, страдает от непозволительных побочных эффектов, так как сам агент выводится при этом с трудом.

Другой подход состоит в использовании суперпарамагнитных частиц, покрытых полиэтиленгликолями или углеводородами для уменьшения захвата их в печени эндотелиальным ретикулумом или в других системах (Tilcock С., Biochim. Biophys. Acta, 77, 1993; Bogdanoy A.A. et al., Radiology, 701, 1993), тем самым увеличивая длительность пребывания этих агентов в крови. В этом случае также наблюдаются вышеуказанные эффекты, а также возникают проблемы, связанные с высокой стоимостью производства.

Поэтому до сих пор существует необходимость в эффективном агенте для кровяного депо, который обладал бы низкой токсичностью и отличался бы разумной ценой.

Настоящее изобретение относится к новому использованию в качестве агентов для кровяного депо специально выбранных соединений, которые уже были ранее раскрыты заявителем в международной патентной заявке WO-A-95/32741, полученных в результате конъюгации желчной кислоты с хелатирующим агентом, которые способны образовывать хелатные комплексы с ионами парамагнитных двух-трехвалентных металлов, а также к новым соединениям, к способу их получения и к использованию их в качестве агентов для кровяного депо.

Указанные соединения демонстрируют хорошую гепатобилиарную экскрецию (см. Anelli P.L. et al., Acta Radiologica, 38, 125, 1997), что делает их многообещающими контрастными агентами для визуализации гепатобилиарной системы.

Неожиданно было обнаружено, что специфический класс указанных соединений остается в сосудистой системе достаточно длительное время, что дает возможность использовать их в качестве контрастных агентов для томографии сосудистой системы, в частности коронарной системы.

Этот эффект можно четко наблюдать в тестах in vivo на животных (таких как кролики и обезьяны). Постоянство нахождения этих соединений в сосудистой системе, действительно, можно немедленно выявить при построении диаграммы значений времени релаксации протонов (1/T₁) в образцах крови животного, отобранных с соответствующими временными интервалами после введения контрастного агента.

Так как комплексы Gd (III) являются парамагнитными, высокие значения 1/T₁ являются доказательством наличия в крови высоких концентраций контрастного агента.

Различие между обычным внеклеточным контрастным агентом и агентом кровяного депо хорошо показано в статье Lauffer et al., Radiology, 529, 1998, где приводятся кривые для T₁ в крови как функция времени, прошедшего после введения контрастного агента.

В частности, комплексы настоящего изобретения при введении, например, кроликам в дозе, сравнимой с разумным коэффициентом безопасности, способны вызвать изменения в скоростях релаксации (определяемых как 1/T₁) в крови более чем 5 сек^-1 через 10 минут после введения, и таким образом являются многообещающими соединениями для использования в качестве контрастных агентов для томографии кровеносной системы.

Было обнаружено, что этот тип эффекта нельзя полностью отнести за счет присутствия желчных кислот, но он зависит от химического строения комплексов. По-видимому, в действительности хелатирующий фрагмент должен предпочтительно связываться со стероидальным скелетом связью в положениях 3, 7 или 12 желчной кислоты.

Действительно, было доказано, что любая связь между хелатирующим фрагментом и желчной кислотой, включающая карбоксильную группу в положении 24, приводит к образованию комплексов, отличающихся неудовлетворительным постоянством в сосудистой системе.

Поэтому целью настоящего изобретения является использование в качестве агентов для кровяного депо комплексов соединений общей формулы (I) с ионами парамагнитных двух-трехвалентных металлов, выбранных из группы, состоящей из Fe⁽²⁺⁾, Fe⁽³⁺⁾ , Cu⁽²⁺⁾, Cr⁽³⁺⁾, Gd⁽³⁺⁾ , Eu⁽³⁺⁾, Dy⁽³⁺⁾, Yb⁽³⁺⁾ или Мn⁽²⁺⁾,

X-L-Y (I),

где

X представляет остаток полиаминополикарбоксильного лиганда или его производного, выбранного из группы, состоящей из:

этилендиаминотетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPA), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусной кислоты (DО3А), [10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусной кислоты (HPDO3A), 4-карбокси-5,8,11-трис(карбоксиметил)-1-фенил-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-овой кислоты (BОРТА);

Y представляет производное желчной кислоты, выбранное из группы, состоящей из остатков холевой, хенодезоксихолевой, дезоксихолевой, урсодезоксихолевой, литохолевой кислот,

как таковых, а также как функционированных по положениям, содержащим гидроксильную группу в качестве реакционноспособной группы, независимо от стереохимии конечных продуктов, причем указанное производное включает также конъюгат кислотной группы в положении 24 с таурином и глицином;

L представляет цепь, связанную с любым положением X, необязательно включающую одну из карбоксильных групп, которая таким образом превращается в амидную группу, и с С-3, С-7, С-12 положениями Y, и имеет следующую формулу (II):

где

m представляет целое число от 1 до 10, где для значений больше 1 А может иметь различные значения,

А представлен следующей формулой (III):

n и q могут быть 0 или 1, но они не могут одновременно быть нулем,

р может принимать значения в интервале от 0 до 10

Z представляет атом кислорода или -NR группу,

где

R представляет атом водорода или (C₁-C ₅) алкильную группу, незамещенную или замещенную -СООН группой.

Наиболее предпочтительными соединениями являются те, в которых пространственные цепи L имеют следующие общие формулы (IIIa) и (IIIb).

Предпочтительны также структуры, в которых Z представляет атом кислорода, а L при этом образуется за счет гидроксильных групп, присутствующих в 3, 7, 12 положениях, независимо от стереохимии конечных продуктов.

Особенно предпочтительны соединения формулы (I), в которых остаток Х выбирают из группы, состоящей из: EDTA, DTPA, DOTA, DО3А, BОРТА; L выбирают из группы, состоящей из (IIIa), (IIIb).

Y предпочтительно выбирают из группы, состоящей из остатков холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, литохолевой кислот, связанных с L через аминогруппу в 3-положении, и кислотная группа в положении 24 присутствует, как таковая или в виде ее тауринового или глицинового производного.

Y можно также функционировать различным образом, например превращая одну или более гидроксильных групп в кетогруппы.

Особенно предпочтительными комплексами с ионами парамагнитных металлов, указанных выше, являются комплексы с гадолинием или с марганцем.

Предпочтительны соединения общей формулы (IV), в которых в общей формуле (I) остаток Х представляет DTPA, замещенный по центральной цепи, и где R₁ представляет атом водорода или -СООН группу,

где Y выбирают из группы, состоящей из остатков холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, литохолевой кислот, a L представлено формулой (III).

Особенно предпочтительны соединения общей формулы (IVa):

где R₁ представляет -СООН группу, а Y принимает указанные выше для соединений общей формулы (IV) значения, и L представлено формулами (IIIa) или (IIIb).

Следующими целями настоящего изобретения являются новые соединения, принадлежащие к классу соединений общей формулы (IVa), а также способы их получения;

[3 (S),

5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овая кислота

[3 (S),

5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овая кислота

[3 (S),5 ,

7 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S),

5 ]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овая кислота

[3 (S),

5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 ,

7 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овая кислота

N²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 , 7 , 12 )-7,12-дигидрокси-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамин

N²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 )-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамин

[3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (R), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (RS), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (RS), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овая кислота

Другие соединения, принадлежащие к этому классу, комплексы которых с гадолинием раскрыты в патентной заявке WO-А-95/32741, представлены далее:

[3 (3), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино] этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота;

Предпочтительны также соединения общей формулы (IVb), которые также являются DTPA производными, замещенными в центральном положении,

где Y принимает указанные выше для соединений формулы (IV) значения, a L принимает значения, соответствующие формуле (IIIa).

Далее настоящее изобретение относится к следующим новым соединениям, которые принадлежат к классу соединений общей формулы (IVb), а также к способу их получения:

(3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

(3 , 5 -3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]холан-24-овая кислота

Другие соединения, принадлежащие к этому классу, комплексы которых с гадолинием были раскрыты в патентной заявке WO-A-95/32741, представлены далее:

(3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

(3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[6-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-1-оксогексил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

Особенно предпочтительны также соединения общей формулы (V), в которых в общей формуле (I) остаток Х представляет DTPA, Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV), и L представлен формулой (IIIa).

Другие соединения, принадлежащие этому классу, комплексы которых с гадолинием были раскрыты в патентной заявке WO-A-95/32741, представлены далее:

(3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[N-[N-[2-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]этил]-N-(карбоксиметил)глицил]глицил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

18-[[(3 , 5 , 7 , 12 )-23-карбокси-7,12-гидрокси-24-норхолан-3-ил]амино]-3,6,9-трис(карбоксиметил)-11,18-диоксо-3,6,9,12-тетраазаоктадекановая кислота

Предпочтительны также соединения формулы (VI), в которой в формуле (I) остаток Х представлен DО3А, Y принимает значения, указанные выше для соединений общей формулы (IV), и L выбирают из соединений, соответствующих формулам (IIIa) и (IIIb).

Среди соединений формулы (VI) особенно предпочтительна 10-[3-[[(3 , 5 , 7 , 12 )-23-карбокси-7,12-дигидрокси-24-норхолан-3-ил]окси]-2-гидроксипропил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, комплекс которой с гадолинием был раскрыт в патентной заявке WO-A-95/32741.

Аналогично предпочтительны соединения общей формулы (VII), в которых в формуле (I) остаток Х представлен EDTA, Y принимает значения, указанные выше для соединений формулы (IV), a L соответствует формуле (III).

Особенно предпочтительны комплексы соединений формулы (VII) с марганцем

Среди соединений формулы (VII) особенно предпочтительны следующие:

[3 (S), 5 , 12 ]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овая кислота

[3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

[3 (S), 5 ]-3-[[4-[[2-[[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овая кислота

Соединения общей формулы (I) можно получить способом конвергентного синтеза, который включает:

1) синтез функционированного лиганда, т.е. лиганда, способного координировать один ион парамагнитного металла, при этом оставаясь стабильно связанным с желчной кислотой за счет подходящей функциональной группы;

2) синтез функционированной желчной кислоты;

3) реакцию сочетания двух различных синтонов;

4) удаление любой защитной группы;

5) образование комплекса с ионом парамагнитного металла; подробно проиллюстрирован в вышеуказанной патентной заявке WO-А-95/32741.

Некоторые из предпочтительных способов получения лигандов настоящего изобретения включают образование амидной связи между двумя синтонами, причем один из них является предшественником хелатообразующей системы парамагнитного иона (Синтон А), а другой является предшественником остатка желчной кислоты, содержащейся в конечном комплексе (Синтон В).

Описываемые далее способы не следует рассматривать как ограничивающие способы получения соединений настоящего изобретения.

Амидную связь можно создать:

a) осуществляя взаимодействие синтонов А, содержащих карбоксильную функцию, с синтоном В, содержащим первичную или вторичную аминофункцию;

b) осуществляя взаимодействие синтонов А, содержащих первичную или вторичную аминофункцию, с синтоном В, содержащим карбоксильную функцию;

c) осуществляя взаимодействие DTPA диангидрида (коммерчески доступный продукт) с синтоном В, содержащим первичную или вторичную аминофункцию.

Перечень некоторых синтонов А и В, используемых в способе настоящего изобретения, представлен в следующей таблице.

Естественно, что используемые синтоны должны быть хорошо защищены по тем группам, которые могли бы стать источником нежелательных реакций в условиях, которые используют для создания амидной связи. После образования амидной связи между двумя синтонами можно предусмотреть одну или более из стадий удаления защитных групп для сохранения групп исходных.

В качестве альтернативы способам такого типа, хелатирующую субъединицу можно ввести в результате многостадийных реакций, исходя из производного желчной кислоты, как в случае синтеза соединений, раскрытых в примере 3 экспериментального раздела, что иллюстрируется на схеме 1.

Схема 1

Настоящее изобретение относится также к новому способу, проиллюстрированному на следующей схеме 2:

Схема 2

где

R₄ представляет аминозащитную группу;

R₅ представляет разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀ алкил или арил,

R₂ и R₃ представляют независимо атом водорода, разветвленный или неразветвленный C₁-C₂₀ алкил, незамещенный или замещенный арильными группами, или указанные группы образуют С₃-С₁₀ цикл;

причем в этом способе используется реакция трансамидирования, что позволяет сохранить стереохимию по хиральному центру, соседнему с атомом азота исходного пирролидинона, и получить вторичный амид. Объединенный выбор групп R₄ и R₅ важен в том плане, что расщепление должно происходить в различных условиях. Возможными примерами R₄ являются карбоксибензилокси (Cbz) группы, а примерами R₅ являются метильная или трет-бутильная группы.

Данный способ обычно используют для получения -амидов глутамовой кислоты, и он очень полезен и выгоден для получения соединений настоящего изобретения, в частности -амидов глутамовой кислоты с 3-аминопроизводными остатков Y, как определено выше. В действительности он позволяет получить конечное соединение, избегая использование дорогостоящих конденсирующих агентов для образования -амидо связи между глутамовой кислотой и соответствующим амином.

Примером применения этого совершенно нового способа является синтез [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты, обычный способ получения которой представлен в примере 4 экспериментального раздела, тогда как альтернативный способ представлен в примере 5, и полная схема синтеза представлена далее на схеме 3.

Схема 3

Аналогично получают производное холевой кислоты, уже описанное в патентной заявке WO-95/32741, [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овую кислоту.

Ионами металлов, способными образовывать комплекс с хелатирующими агентами общей формулы (I) являются двухвалентные или трехвалентные ионы элементов, выбранные из группы, состоящей из Fe⁽²⁺⁾, Fe⁽³⁺⁾, Cu⁽²⁺⁾, Cr ⁽³⁺⁾, Gd⁽³⁺⁾, Eu⁽³⁺⁾, Dy ⁽³⁺⁾, Yb⁽³⁺⁾ или Мn⁽²⁺⁾.

Что касается диагностического использования новых хелатных комплексов настоящего изобретения, то их можно использовать в качестве контрастных агентов, особенно для применения в качестве агентов для кровяного депо для диагностики с помощью ЯМР-томографии.

Комплексы получают обычно в соответствии со способом, в котором оксид или подходящую соль парамагнитного металла, растворенную в воде или суспендированную в водно-спиртовом растворе, добавляют к водному или водно-спиртовому раствору хелатирующего агента при перемешивании и, при необходимости, нагревают умеренно или до температуры кипения, до завершения реакции. Если комплекс нерастворим в реакционном растворителе, его можно отфильтровать. Если он растворим, его можно выделить, выпаривая растворитель до получения остатка, например, с помощью сушки распылением.

В том случае, если полученный комплекс все еще содержит свободные кислотные группы, его превращают в нейтральную соль реакцией с органическим или неорганическим основанием, которые образуют физиологически совместимые катионы в растворах.

Для получения таких нейтральных солей достаточное количество основания можно добавить к комплексам, содержащим свободные кислотные группы, в водном растворе или суспензии до нейтральности. Полученный раствор можно обычным образом выпарить, или подходящий растворитель можно добавить для кристаллизации соли комплекса.

Предпочтительные неорганические катионы, пригодные для получения солей хелатных комплексов настоящего изобретения, включают, в частности, ионы щелочных или щелочноземельных металлов, таких как калий, натрий, кальций, магний, и их смеси. Особенно предпочтителен ион натрия.

Предпочтительные катионы, полученные из органических оснований, пригодные для вышеуказанных целей, включают (наряду с другими) катионы первичных, вторичных и третичных аминов, таких как этаноламин, диэтаноламин, морфолин, глюкамин, N-метилглюкамин, N,N-диметилглюкамин, причем наиболее предпочтителен N-метилглюкамин.

Предпочтительные катионы, полученные из аминокислот, включают, например, катионы таурина, глицина, лизина, аргинина или орнитина.

Альтернатива этому способу состоит в получении композиций для инъекций без выделения соли комплекса. В этом случае конечный раствор обязательно не должен содержать свободных ионов металла, которые токсичны для организма.

Это можно проверить титрованием, например, с цветными индикаторами, такими как ксиленол оранжевый. Можно также предусмотреть стадию очистки соли комплекса.

В такого типа способе хелатирующий агент, соль или оксид металла, и любые солеобразующие основания подвергают взаимодействию в стехиометрических отношениях в воде для инъекций, затем, после завершения реакции, пирогены отфильтровывают и продукт распределяют в подходящие контейнеры, а затем осуществляют термическую стерилизацию.

Фармацевтические композиции для инъекций обычно получают, растворяя активный ингредиент, полученный, как указано выше, и эксципиенты в воде необходимой степени чистоты с фармакологической точки зрения, с тем, чтобы получить фармацевтическую композицию, пригодную для энтерального или парентерального введения, в молярных концентрациях в интервале от 0,01 до 1,0. Полученный контрастный агент соответствующим образом стерилизуют.

Контрастные агенты вводят в зависимости от диагностических требований в дозах от 0,01 до 0,3 ммоль/кг массы тела.

В принципе дозы для парентерального введения находятся в интервале от 0,001 до около 1,0 ммоль/кг массы тела. Предпочтительные дозы для парентерального введения находятся в интервале от 0,01 до около 0,5 ммоль/кг массы тела.

Дозы для энтерального введения обычно находятся в интервале от 0,5 до около 10 ммоль/кг массы тела, предпочтительно от около 1,0 до около 10 ммоль/кг массы тела.

Новые композиции настоящего изобретения демонстрируют хорошую переносимость; более того, их растворимость в воде является дополнительной важной особенностью, которая делает их особенно подходящими для использования в ядерном магнитном резонансе.

Диагностические композиции настоящего изобретения используют обычным образом. Композиции можно вводить пациенту, обычно теплокровному животному, как системно, так и поверхностно в орган или ткань, которые предстоит визуализировать с использованием ядерного магнитного резонанса.

Схемы анализов и аппаратуру можно найти в работах, таких как Stark, D.D., Bradley, W.G., Magnetic Resonance Imaging, Mosby Year Book, St. Louis, Mo, 1992.

Используемые условия экспериментов будут проиллюстрированы подробно в экспериментальном разделе.

Экспериментальный раздел

ПРИМЕР 1

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир [3 (S), 5 ]-3-[[5-(1,1-диметилэтокси)-4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-1,5-диоксопентил]амино]холан-24-овой кислоты

3,6 г метилового эфира (3 , 5 )-3-аминохолан-24-овой кислоты (полученного аналогично способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 5) (9,24 ммоль), 8,5 г трет-бутилового эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (полученного, как описано в WO-A-95/32741: пример 15) (11,39 ммоль) и 1,64 г диэтилцианофосфоната (9,39 ммоль) растворяют в 160 мл ДМФ. Раствор охлаждают до 0° С, по каплям добавляют 1,28 мл Et₃N (9,24 ммоль) и реакционную смесь оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Спустя 1 час раствор упаривают при пониженном давлении, остаток смешивают с EtOAc, промывают 5% NаНСО₃, а затем рассолом. Органическую фазу выделяют, сушат над Na₂SO₄, а затем выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая 9,5 г нужного продукта (8,50 ммоль).

Выход: 92%

K.F.: 3,47%

Элементный анализ	C	H	N
% вычислено:	66,63	9,74	5,01
% найдено: a	67,42	10,08	5,07

^а после сушки при 120° С в вакууме

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck Элюент = 4:6 EtOAc/н-гексан

Детектирование: 0,5% КМnO₄ в 1 М NaOH R_f=0,46

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир [3 (S), 5 ]-3-[[4-карбокси-4-[бис[2-[бис(карбоксиэтил)амино]этил]амино]-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты

К перемешиваемому раствору 9,3 г соединения, полученного на стадии А) (8,32 ммоль), в 50 мл СН₂Сl₂ добавляют 5,1 мл СF₃СООН (66,6 ммоль); спустя 10 мин при температуре 0-5° С раствор выпаривают. Остаток помещают в 50 мл СF₃СООН и спустя 24 часа при комнатной температуре добавляют еще 30 мл СF₃СООН для завершения реакции. Через 5 часов реакционную смесь выпаривают и остаток обрабатывают CH₂Cl₂, выпаривая каждый раз растворитель при пониженном давлении до получения порошка. Твердый продукт промывают H₂O, фильтруют и сушат, получая нужный продукт (6,9 г; 8,24 ммоль).

Выход 99%. Т. пл: 205° С

K.F.: 7,78%

Элементный анализ	C	H	N
% вычислено:	60,27	8,18	6,69
% найдено: a	59,28	8,11	6,68

^а после сушки при 120° С в вакууме

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент=6:4:1 СНСl₃/МеОН/25% NH₄OH.

Детектирование: 0,5% КМnО₄ в 1 М NaOH R_f =0,28

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овая кислота

К суспензии 6,14 г соединения, полученного на стадии В) (7,33 ммоль), в 50 мл H₂O добавляют 50 мл 1 М NaOH (50 ммоль), поддерживая значение рН 13 с помощью pH-stat аппарата. Через 2 часа при комнатной температуре реакционную смесь подкисляют (рН 0,5) добавлением 12 М НСl, получая суспензию, которую фильтруют, промывают H₂O и сушат с получением нужного продукта (5,64 г; 6,85 ммоль).

Выход: 93%. Т. пл.: 205° С

K.F.: 9,02%

Элементный анализ	C	H	N	Cl, Na
% вычислено:	59,84	8,08	6,81
% найдено: a	59,56	8,15	6,80	<0,1

^а после сушки при 120° С в вакууме

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент=6:4:1 СНСl₃/МеОН/25% NH₄OH

Детектирование: 0,5% КМnO₄ в 1 М NaOH R_f =0,25

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты (1:3)

4,53 г соединения, полученного на стадии С) (5,5 ммоль), суспендируют в 50 мл Н₂O и солюбилизируют 10 мл 2 М водного раствора меглумина (20 ммоль), получая раствор при рН 6,8. После этого в течение 1 часа добавляют 11 мл 0,5 М водного раствора GdСl₃ (5,5 ммоль), поддерживая значение рН 6,8 добавлением 6,5 мл 2 М водного раствора меглумина (13 ммоль). За ходом реакции следят с помощью капиллярного электрофореза. Через 2 часа раствор фильтруют через мембрану Millipore®, фильтруют через нанофильтр и выпаривают. Остаток сушат, получая нужное соединение (6,15 г; 4,17 ммоль).

Выход: 76%. Т пл.: 220° С

K.F.: 8,44%

СЕ (капиллярный электрофорез) анализ: 100% (площадь %)

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Нижеследующие соединения и соответствующие комплексы гадолиния получают аналогичным образом:

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 7 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3);

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3(S), 5 ]-3-[2-[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты (1:3);

ПРИМЕР 2

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир (3 , 5 )-3-азидо-12-оксохолан-24-овой кислоты

12,5 мл реагента Джонса [33,3 ммоль Cr (VI)] добавляют по каплям к раствору 17,8 г метилового сложного эфира (3 , 5 , 12 )-3-азидо-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (41,1 ммоль) (полученного аналогично способу, описанному для метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3-азидо-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты в WO-A-95/32741: пример 5) в ацетоне (600 мл) в течение 90 минут при комнатной температуре. Через 20 часов смесь фильтруют и раствор выпаривают. Остаток растворяют в СНСl₃ (400 мл) и раствор промывают насыщенным водным NаНСО₃, затем Н₂О. Раствор сушат и выпаривают, получая сырой продукт, который кристаллизуют из 96% EtOH с получением 14,1 г нужного продукта (32,9 ммоль).

Выход: 84%. Т.пл.: 153° С

K.F.:<0,1%

[ ]²⁰_D=+83,25 (с 2,1, СНСl₃)

Элементный анализ	C	H	N
% вычислено:	69,90	9,15	9,78
% найдено:	69,98	9,32	9,69

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 8:2 н-гексан /EtOAc

Детектирование: 0,5% КМnO₄ в 1 М NaOH R_f=0,43

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир (3 , 5 )-3-амино-12-оксохолан-24-овой кислоты

Раствор 16,4 г соединения А) (38,2 ммоль) в ТГФ (130 мл) гидрируют в присутствии 5% Pd/C (1,6 г) при комнатной температуре и давлении 40 бар в течение 15 час в автоклаве Парра®. Реакционную смесь фильтруют (бумага и мембрана FH 0,5 мкм Millipore®) и упаривают. Сырой остаток очищают с помощью флэш-хроматографии, получая 11,8 г нужного продукта (29,2 ммоль).

Выход: 77%. Т.пл.:129-130° С

K.F.: 1,04%

[ ]²⁰_D=+87,8 (с 2,02, СНСl₃)

Элементный анализ	C	H	N
% вычислено:	74,40	10,24	3,47
% найдено:	72,72	10,00	3,35

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 95:5 MeOH/Et₃N

Детектирование: 0,5% KMnO₄ в 1 M NaOH R_f=0,31

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Метиловый эфир [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-(1,1-диметилэтокси)-1,5-диоксопентил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты

Раствор DCC (6,24 г, 30,3 ммоль) в CH₂ Cl₂ (25 мл) добавляют по каплям в течение 30 минут к раствору 1-(1,1-диметилэтилового) эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (полученного как описано в WO-A-95/32741: пример 15) (21,5 г; 28,9 ммоль), соединения В) (11,1 г, 27,5 ммоль) и НОВТ (1-гидроксибензотриазол) (3,72 г; 27,5 ммоль) в CH₂ Cl₂ (300 мл) при 0° С в атмосфере азота. Смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры. Через 21 час реакционную смесь фильтруют и раствор промывают насыщенным водным раствором NаНСО₃, затем Н₂О и затем выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая 24,5 г нужного продукта (21,7 ммоль).

Выход: 79%

[ ]²⁰_D=+12,17 (c 2,07, СНСl₃)

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 1:1 EtOAc/н-гексан

Детектирование: 0,5% КМnO ₄ в 1 М NaOH R_f=0,45

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овая кислота

80 мл ТФУ (трифторуксусная кислота) (1,0 моль) добавляют по каплям к раствору 23,8 г соединения, полученного на стадии С) (21,0 ммоль), в CH₂Cl₂ (50 мл) при 0° С в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, затем через 2 часа выпаривают. Остаток помещают в ТФУ (100 мл; 1,3 моль) и раствор перемешивают еще 24 часа. Затем реакционную смесь выпаривают, добавляют CH ₂Cl₂ и снова выпаривают. Сырой остаток растворяют в 150 мл 1 М NaOH, охлаждая на бане со льдом, и раствор затем перемешивают в течение 15 час (рН 10) при комнатной температуре. Доводят рН реакционной смеси до 13 добавлением 3,30 мл 30% NaOH и через 4 часа фильтруют через мембрану Millipore® (HAS 0,45 мкм). Фильтрат подкисляют 12,5 мл 30% НСl и 19 мл 1 М НСl до рН 1,60. Осадок отфильтровывают, промывают Н₂О и сушат, получая 15,8 г нужного продукта (18,9 ммоль).

Выход 90%. Т.пл. 172-175° С

K.F.: 1,98%

[ ]²⁰_D=+43,54 (с 2,02, 1 М NaOH)

ВЭЖХ: 97% (площадь, %)

Неподвижная фаза:	Zorbax ECLIPSE XDB-C8 3,5 мкм; 150× 4,6 мм
Температура:	40° С
Подвижная фаза:	градиентное элюирование
	А=0,017 М Н3 РO4, 0,3 мМ EDTA в Н2 О
	В=СН3СN
Градиент:	мин		%А		%В
	0		85		15
	40		65		35
	50		65		35
Скорость потока:	1,5 мл/мин
Детектирование (УФ):			210 нм
Элементный анализ	С	Н		N	Сl	Na
% вычислено	58,84	7,71		6,69
% найдено	56,57	7,68		6,37	0,25	0,18

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 5:4:2 СНСl₃/МеОН/25% NH₄ OH

Детектирование: 0,5% КМnО₄ в 1 М NaOH R _f=0,28

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Е) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты (1:3)

49,0 мл 0,918 М водного раствора меглумина (45,0 ммоль) добавляют по каплям к суспензии 14,0 г соединения, полученного на стадии D) (16,7 ммоль), в Н₂О (100 мл) при комнатной температуре, получая прозрачный раствор (рН 6,5). К нему добавляют по каплям 31,6 мл 0,503 М водного раствора GdCl₃ (15,9 ммоль), поддерживая рН 6,5 добавлением 55,7 мл 0,918 М водного раствора меглумина (51,1 ммоль) с помощью pH-stat. В конце добавления смесь фильтруют через мембрану Millipore® (HAWP 0,45 мкм), пропускают через нанофильтр, рН доводят до 7,0 добавлением 0,100 мл 0,918 М водного раствора меглумина (0,092 ммоль) и выпаривают. Остаток сушат, получая 22,0 г нужного продукта (14,0 ммоль).

Выход 84%. Т.пл. 100-105° С

K.F.: 5,06%

ВЭЖХ анализ: 97% (площадь, %)

Неподвижная фаза: HYPURITY Elite C18 5 мкм; 250× 4,6 мм колонка Hypersil;

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 3

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 , 5 , 7 , 12 ]-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:2)

А) Метиловый эфир [3 , 5 , 7 , 12 ]-3-[[[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты

24,8 г метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[(аминоацетил)амино]-1,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (полученного по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 5) (51,9 ммоль) суспендируют в перемешиваемом растворе 38,7 г 1,1-диметилэтилового эфира N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (полученного по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15) (110 ммоль) в 390 мл СН₃СN. Добавление 245 мл 2М фосфатного буфера рН 8 приводит к получению двухфазного раствора, который интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 144 часов. Органическую фазу выделяют и выпаривают, оставшееся масло растворяют в 250 мл CH₂Cl₂. Раствор промывают Н₂O, сушат (Na₂SO₄) и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии (элюент=95:5 CHCl₃/СН₃ОН), получая нужный продукт (24,8 г; 24,3 ммоль).

Выход; 47%

[ ]²⁰_D=+9,45 (с 1,5, СНСl₃)

Элементный анализ	C	H	N
% вычислено:	64,68	9,47	5,49
% найдено:	64,55	9,44	5,46

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 88:12 СНСl₃/МеОН

Детектирование: 0,5% КМnО₄ в 1 М NaOH R_f=0,57

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

318 мл 2 М водного раствора LiOH (636 ммоль) добавляют по каплям за 15 минут к раствору соединения, полученного на стадии А) (21,6 г, 21,1 ммоль), в 310 мл EtOH. Через 23 часа EtOH выпаривают и реакционную смесь перемешивают еще 2 часа. Раствор по каплям добавляют в 255 мл 2,6 М НСl и доводят рН до 1,4 30% NaOH. Через 1,5 часа осадок отфильтровывают, промывают 300 мл 0,1 М НСl и сушат, получая нужный продукт (13,1 г; 16,7 ммоль).

С) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:2)

11,3 г соединения, полученного на стадии В) (13,8 ммоль), суспендируют в 40 мл H₂O и растворяют добавлением 44,7 мл 1 М водного раствора меглумина (44,7 ммоль) вплоть до рН 6. К смеси добавляют по каплям 13,7 мл 1 М водного раствора GdCl₃ (13,7 ммоль) в течение 1 часа, поддерживая рН 6,5 добавлением 73,5 мл 1 М водного раствора меглумина (73,5 ммоль). Осуществляют нанофильтрацию реакционной смеси и доводят рН до 6,8 добавлением 0,3 мл 0,1 М меглумина. После выпаривания и сушки получают нужный продукт (17,2 г; 12,9 ммоль).

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 4

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-(1,1-диметилэтокси) -1, 5-диоксопентил] амино] -12-гидроксихолан-24-овой кислоты

Триэтиламин (2,23 г; 22 ммоль) добавляют к раствору 8,93 г метилового эфира (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (полученного аналогично производному холевой кислоты, описанному в WO-A-95/32741: пример 5) (22 ммоль), 16,41 г 1-(1,1-диметилэтилового) сложного эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (полученного как описано в WO-A-95/32741: пример 15) (22 ммоль) и 3,91 г диэтилцианофосфоната (24 ммоль) в 300 мл ДМФ при 0° С. Через 1,5 часа при 0° С и 18 часов при комнатной температуре реакционную смесь выпаривают и остаток растворяют в EtOAc. Раствор промывают насыщенным водным раствором NаНСО₃ и H₂O, сушат (Na₂SO ₄) и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (20,67 г; 18,2 ммоль).

Выход: 83%

[ ]²⁰_D=-6,75 (с 2,0, СНСl₃)

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	65,69	9,60	4,94
% найдено:	66,54	9,95	4,99

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 1:1 н-гексан/EtOAc R_f=0,09

Детектирование: Се(SO₄)₂· 4H₂ O (0,18%) и (NH₄)₆Мо₇O₂₄ · 4Н₂O (3,83%) в 10% H₂ SO₄

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³ С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) [3 (S), 5 , 12 )-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

Соединение, полученное на стадии А) (19,72 г; 17,4 ммоль), растворяют в 105 мл СF₃СО₂Н при комнатной температуре. Через 26 часов раствор выпаривают и остаток обрабатывают Н₂О; твердую часть отфильтровывают, промывают Н₂О и частично сушат в вакууме. Полученное промежуточное соединение суспендируют в Н₂О и растворяют 1 М NaOH до рН 13. Через 5 часов при комнатной температуре по каплям добавляют 0,5 М НСl в раствор вплоть до рН 1,4. Через 15 часов при комнатной температуре осадок отфильтровывают, промывают Н₂О и сушат, получая сырой продукт, который очищают хроматографически на колонке со смолой Amberlite® XAD 1600 с получением нужного продукта (9,92 г; 11,8 ммоль).

Выход: 68%. Т.пл.: 184° С (с разложением)

Комплексометрический титр (0,1 М GdCl ₃): 99,3%

Кислотный титр (0,1 н NaOH): 99,8%

[ ]²⁰ (с 2,0; 1 М NaOH)

(нм)	589		578		546		436		405		365
[ ]	+23,61		+24,59		+27,90		+46,67		+55,61		+71,40
Элементный анализ		С		Н		N
% вычислено:		58,70		7,93		6,68
% найдено:		58,22		8,16		6,59		Н2О		0,70%

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 5:4:2 СНСl₃/МеОН/25% NH₄ OH R_f=0,13

Детектирование: Се(SO₄ )₂· 4H₂O (0,18%) и (NH ₄)₆Мо₇O₂₄· 4Н₂O (3,83%) в 10% Н₂SO₄

Спектры ¹H-ЯMP, ¹³C-ЯMP, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 12 )-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение, полученное на стадии В) (8,39 г; 10 ммоль), суспендируют в Н₂O (30 мл) и растворяют добавлением 1 М водного раствора меглумина (36,5 мл; 36,5 ммоль) вплоть до рН 6. К смеси добавляют по каплям 1,025 М водный раствор GdCl₃ (9,85 мл; 10,1 ммоль) в течение 1 часа, поддерживая рН 6 добавлением 1 М водного раствора меглумина (19,3 мл; 19,3 ммоль). Осуществляют нанофильтрацию раствора и рН доводят до 7,0 1 М водным раствором меглумина. После выпаривания и сушки получают нужный продукт (8,57 г; 5,4 ммоль).

Выход: 54%. Т.пл.: 150-166° С (170° С разлож.)

Элементный анализ	С	Н	N	Gd
% вычислено:	47,17	7,28	6,21	9,96
% найдено:	43,40	7,31	5, 68	9,31	Н2O 7,14%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) Аналогично соединению, полученному на стадии С), получают комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 )-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение, полученное на стадии В) (26,92 г; 32,08 ммоль), суспендируют в Н₂О (100 мл) и растворяют добавлением 2 М NaOH (56 мл; 112 ммоль) до рН 6. К смеси добавляют по каплям 0,512 М водный раствор GdCl₃ (58,2 мл; 29,77 ммоль) в течение 3 часов, поддерживая рН 6 добавлением 2 М NaOH (28,95 мл; 57,9 ммоль). Доводят рН раствора до 6,7 добавлением 2 М NaOH (4 мл, 8 ммоль) и осуществляют нанофильтрацию раствора. После сушки вымораживанием получают нужный продукт (29,86 г, 28,2 ммоль).

Выход: 88%. Т.пл.: >300° С

Элементный анализ	С	Н	N	Gd	Na
% вычислено:	46,49	5,71	5,29	14,85	6,51
% найдено:	43,98	6,34	4,92	13,86	6,61	Н2О 4,63%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 5

Альтернативный способ получения [3 (S), 5 , 12 )-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты в соответствии со схемой 3

А) 2-метил-1-(фенилметиловый) диэфир (S)-5-оксо-1,2-пирролидинкарбоновой кислоты

7,1 г СН₃I (50 ммоль) добавляют к раствору 6,58 г 1-(фенилметилового) эфира (S)-5-оксо-1,2-пирролидинкарбоновой кислоты (25 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (3,55 г; 27,5 ммоль) в CH₂ Cl₂ (33 мл) и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 6,5 часов. После охлаждения до комнатной температуры и разбавления CH₂Cl₂ (50 мл) реакционную смесь промывают Н₂О, 2% водным Nа ₂СО₃, 0,2 М НСl и Н₂O. После сушки над Na₂SO₄ и выпаривания получают нужный продукт (6,8 г; 24,5 ммоль).

Выход: 98%

ВЭЖХ анализ: 98/5% (площадь, %)

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[5-метокси-1,5-диоксо-4-[[(фенилметокси)карбонил]амино]пентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

8,92 г метилового эфира (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (полученного аналогично производному холевой кислоты, описанному в WO-A-95/32741: пример 5) (22 ммоль) добавляют к раствору соединения А) (6,1 г; 22 ммоль) в диоксане (55 мл) и полученную смесь нагревают до 50° С в течение 24 часов, затем до 105° С в течение 29 часов. Растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток очищают с помощью флэш-хроматографии (градиентное элюирование EtOAc/н-гексан) с последующей кристаллизацией из смеси 1:1 EtOAc/н-гексан, получая нужный продукт (11,2 г; 16,4 ммоль).

Выход: 75%. Т.пл.: 140° С.

ВЭЖХ анализ: 99,2% (площадь, %)

Неподвижная фаза:		Lichrosorb RP-Select В 5 мкм; 250× 4 мм колонка Merck KGaA
Температура:		45° C
Подвижная фаза:		градиентное элюирование
		А=0,017 М Н3 РO4 в воде
		В=СН3СN
Градиент:	мин		% А	%В
	0		65	35
	25		15	85
	30		15	85

Скорость потока: 1 мл/мин

Детектирование (УФ): 210 нм

[ ]²⁰ =(с 2,01; СНСl₃)

(нм)	589		578	546	365
[ ]	+24,14		+25,13	+28,51	+73,81
Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	68,70	8,43	4,11
% найдено:	69,36	8,72	4,13

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: EtOAc

Детектирование: Се(SO₄) ₂· 4H₂O (0,2%) и (NH ₄)₆Мо₇O₂₄· 4Н₂O (3,8%) в 10% Н₂SO₄ R _f=0,11

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

1 г 5% Pd/C добавляют к раствору соединения В) (10,4 г; 15,3 ммоль) в МеОН (100 мл); суспензию перемешивают в течение 3,5 часов в атмосфере водорода (поглощено Н₂ : 348 мл; 15,5 ммоль) при комнатной температуре. После фильтрования через фильтр Millipore® FH (0,45 мкм) раствор выпаривают при пониженном давлении, получая остаток, который растворяют в СН ₃СN (60 мл). Добавляют 2 М водный (рН 8) фосфатный буфер (60 мл), затем раствор 1,1-диметилэтилового эфира N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (полученного по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15) (11,86 г; 33,7 ммоль) в СН₃СN (15 мл) добавляют по каплям в течение 10 мин при комнатной температуре. Смесь перемешивают в течение 39 часов. После разделения органическую фазу выпаривают при пониженном давлении и остаток растворяют в AcOEt (200 мл). Раствор промывают Н₂О, сушат (Na₂SO ₄) и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии (градиентное элюирование EtOAc/н-гексан), получая нужный продукт (11,36 г; 10,4 ммоль).

Выход: 68%. Т.пл.: 55-58° С

ВЭЖХ анализ: 100% (площадь, %)

[ ]²⁰ =(с 2,01; СНСl₃)

(нм)	589	578		546		365
[ ]	-6,97	-7,41		-8,61		-32,89
Элементный анализ			С		Н		N
% вычислено:			64,93		9,42		5,13
% найдено:			65,06		9,36		5,11

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: EtOAc

Детектирование: Се(SO₄) ₂· 4Н₂O (0,2%) и (NH ₄)₆Мо₇O₂₄· 4Н₂O (3,8%) в 10% Н₂SO₄ R _f=0,45

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) [3 (S), 5 , 12 )-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

К раствору соединения С) (8,5 г; 7,8 ммоль) в диоксане (50 мл) добавляют 2 М водный раствор LiOH (117 мл; 234 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 72 часов, затем подкисляют до рН 6, медленно добавляя 37% НСl. Раствор концентрируют до 50 г, упаривая при пониженном давлении, и разбавляют Н₂О (40 мл). Раствор подкисляют до рН 2,5 добавлением 37% НСl, нагревают до 50-55° С и при интенсивном перемешивании очень медленно подкисляют до рН 1,3, добавляя 2 н. НСl. Через 5 мин гетерогенную смесь оставляют для медленного охлаждения до комнатной температуры при перемешивании на 15 часов. Осадок отфильтровывают, промывают H₂O и сушат, получая нужный продукт (5,92 г; 7 ммоль).

Выход: 90%. Т.пл.: 180-198° С.

ВЭЖХ анализ: 99,9% (площадь, %)

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 6

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:2)

A) N-[[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]ацетил]глицин

6,5 г глицилглицина (49,3 ммоль) суспендируют в 100 мл смеси 1:1 H₂O/EtOH и растворяют при рН 10, добавляя 10 М NaOH (4,8 мл). К этому добавляют по каплям 1,1-диметилэтиловый эфир N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (42 г; 110,9 ммоль) в 40 мл EtOH в течение 2 часов, поддерживая рН 10,5 добавлением 10 М NaOH (5,8 мл). Раствор быстро превращается в эмульсию, которую растворяют через 2,5 часа добавлением 10 М NaOH. Через 22 часа растворитель выпаривают, смесь разбавляют водой и экстрагируют СН₂Сl₂. Органическую фазу промывают Н₂О, сушат и выпаривают, получая остаток, который очищают с помощью флэш-хроматографии. Остаток растворяют в воде, доводят рН до 4,5 добавлением 1 М НСl и раствор экстрагируют хлороформом. Органическую фазу промывают Н₂O, сушат и выпаривают, получая 13 г нужного продукта (19,3 ммоль).

Выход: 39%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	56,95	8, 66	8,30
% найдено:	56, 67	8, 68	8,30

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 6:3:1 СНСl₃/МеОН/25% NH₄ OH

R_f=0,65

Детектирование: 1% KMnO ₄ в 1 М NaOH

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³ С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[[[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты

2,8 мл TEA (триэтаноламин) (20,2 ммоль) добавляют по каплям за 5 мин к раствору, содержащему 13,6 г соединения, полученного на стадии А) (20,2 ммоль), 8,52 г метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3-амино-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (20,2 ммоль) и DEPC (3,4 мл; 22,2 ммоль) в ДМФ (290 мл), перемешиваемому при 0° С. Через 1 час реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и раствор перемешивают в течение 6,5 часов. Добавляют 0,3 мл DEPC (2 ммоль) и раствор перемешивают еще 15,5 часов. ДМФ выпаривают, остаток растворяют в EtOAc, промывают водным NаНСО₃ и наконец сушат. После очистки с помощью флэш-хроматографии получают 13,7 г нужного продукта (12,7 ммоль).

Выход: 63%.

[ ]²⁰D=+5,26 (с 1,5; СНСl₃)

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	63,48	9,25	6,49
% найдено:	63,22	9,40	6,40

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[[[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

12,85 г соединения, полученного на стадии В) (12 ммоль), растворяют в ТФУ (210 мл), перемешиваемой при -5/0° С. Через 16 часов ТФУ выпаривают, получая остаток, который растворяют в 90 мл 0,8 М NaOH при рН 13 и перемешивают при комнатной температуре в течение 15 час. Раствор концентрируют до 50 мл, прикапывают в 105 мл 0,6 М НСl и перемешивают в течение 2 час. Твердую часть отфильтровывают, промывают 0,1 М НСl и сушат, получая сырой продукт, который очищают с помощью флэш-хроматографии. Фракции, содержащие нужное соединение в форме соли, выпаривают, получая остаток, который растворяют в воде, и прикапывают в 1 М НСl, поддерживая рН 1,45. Осадок отфильтровывают, промывают 0,1 М НСl и сушат, получая 2,6 г нужного продукта (3,1 ммоль).

Выход: 26%. Т.пл.: 120-125° С.

ВЭЖХ анализ: 98% (площадь, %)

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[[[[[бис[2-[бис[2-(карбоксиметил)амино]этил]амино]ацетил]амино]ацетил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:2)

2,59 г соединения, полученного на стадии С) (3,08 ммоль), суспендируют в воде (20 мл) и растворяют, добавляя 1 М водный раствор меглумина (3,08 мл, 3,08 ммоль) до рН 5. К смеси добавляют Gd₂O₃ (0,501 г; 2,77 ммоль), нагревая до 50° С. Через 1 час добавляют 1 М меглумин (2,8 мл; 2,8 ммоль) для растворения осадка. Через 24 часа реакционную смесь фильтруют и доводят рН до 6,8 добавлением 1 М водного меглумина (0,4 мл). После выпаривания и сушки получают 4,2 г (3,00 ммоль) нужного продукта.

Выход: 99%. Т.пл.: 209-213° С (с разложением)

ВЭЖХ анализ: 99,7% (площадь, %)

Свободный лиганд:	<0,1%	(0,001 GdCl3)
Элементный анализ	С	H	N	Gd
% вычислено:	46,84	6,99	7,08	11,36
% найдено:	44,01	7,35	6,68	10,39	Н2O 4,95

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 7

Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овой кислоты (1:4)

А) Метиловый эфир (3 , 5 )-3-[[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]холан-24-овой кислоты

40 г метилового эфира (3 , 5 )-3-аминохолан-24-овой кислоты (полученного ранее в примере 1) (103 ммоль) суспендируют в ДМФ (1,0 л) при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляют триэтиламин (13,0 г; 129 ммоль), затем к реакционной смеси добавляют по каплям раствор 1,1-диметилэтилового эфира бромуксусной кислоты (24,0 г; 123 ммоль) в ДМФ (30 мл) в течение 1 часа до растворения. Через 3 дня смесь концентрируют и разбавляют 4% водным раствором NаНСО₃. Полученную суспензию фильтруют, осадок промывают Н₂O и сушат, получая 33,7 г (66,9 ммоль) нужного продукта.

Выход: 65%. Т.пл.: 62-64° С

[ ]²⁰D=+23,55 (с 1,96, МеОН)

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	73,91	10,60	2,78
% найдено:	74,67	10,85	2,78	H2O<0,1

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 7:3 н-гексан/EtOAc R_f=0,31

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-(1,1-диметилэтокси)-1,5-диоксопентил][2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]холан-24-овой кислоты

Диизопропилэтиламин (19,5 г; 151 ммоль) добавляют по каплям за 20 минут к раствору соединения А) (33,0 г; 65,5 ммоль), 1-(1,1-диметилэтилового) эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (полученного как описано в WO-A-95/32741: пример 15) (53,8 г; 72,1 ммоль) и гексафторфосфата (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония (ВОР) (40,6 г; 91,8 ммоль) в ДМФ (400 мл), перемешиваемому при комнатной температуре в атмосфере азота. Через 2 дня реакционную смесь концентрируют и поглощают EtOAc. Раствор промывают Н ₂O, сушат (Na₂SO₄) и выпаривают.Сырой продукт дважды очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (38,7 г; 31,4 ммоль).

Выход: 48%

[ ]²⁰D=-54,50 (с 2,51, СНСl₃)

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 7:3 н-гексан/EtOAc R_f=0,22

Спектры ¹ H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овая кислота

В раствор соединения, полученного на стадии В) (38,7 г; 31,4 ммоль), в EtOH (350 мл), перемешиваемый при комнатной температуре, по каплям добавляют 500 мл 2 М раствора LiOH в течение 1 часа. Через 16 часов реакционную смесь концентрируют до 500 мл и снова добавляют 2 М раствор LiOH (350 мл), нагревая до 50° С. Через 24 часа реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют по каплям в 320 мл 6 М НСl, интенсивно перемешивая при 5° С. рН полученной суспензии доводят до 1,0, добавляя 55 мл 2 М NaOH. Твердую часть отфильтровывают, промывают 0,1 М НСl и сушат. Сырой продукт суспендируют в Н₂О и солюбилизируют добавлением 1 М раствора NaOH, затем основной раствор добавляют по каплям в 0,5 М раствор НСl. Осадок отфильтровывают, промывают 0,05 М НСl, Н₂О и сушат, получая 23,5 г нужного продукта (26,7 ммоль).

Выход: 85%. Т.пл.: 178-182° С

[ ]⁴⁰⁵₂₀=+24,10 (с 1,49, 1 М NaOH)

ВЭЖХ анализ: 100% (площадь, %)

Неподвижная фаза:		Hypurity Elite C-18 5 мкм; колонка 250× 4,6 мм
Температура:		40° С
Подвижная фаза:		градиентное элюирование
		А=0,01 М КН 2РO4, 0,3 мМ EDTA в воде
		В=СН3СN
Градиент:	мин		% А	%В
	0		95	5
	40		65	35
	50		65	35

Скорость потока: 1 мл/мин

Детектирование (УФ): 210 нм

Элементный анализ	С	Н	N	Na	Сl
% вычислено:	58,62	7,78	6,36
% найдено:	57,71	8,07	6,20	0,13	0,55	Н2O<0,1

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) Комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил](карбоксиметил)амино]холан-24-овой кислоты (1:4)

К суспензии соединения, полученного на стадии С) (12,9 г; 14,6 ммоль), в Н₂О (100 мл) добавляют 1 М водный раствор меглумина (72,0 мл; 72,0 ммоль) при комнатной температуре до получения прозрачного раствора с рН 6,2. К смеси добавляют по каплям 0,393 М водный раствор GdCl₃ (37,2 мл; 14,6 ммоль), поддерживая рН 6,2 добавлением 1 М водного раствора меглумина (30,0 мл; 30,0 ммоль) с помощью pH-stat. В конце добавлений реакционную смесь фильтруют через бумагу, затем через мембрану Millipore® (HAWP 0,45 мкм), осуществляют нанофильтрацию раствора, доводят рН до 7,0, добавляя 1 М водный раствор меглумина (0,20 мл; 0,20 ммоль), и выпаривают. Твердую часть сушат, получая нужный продукт (24,0 г; 13,2 ммоль).

Выход: 91%. Т.пл.: 90-92° С

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 8

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (R), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

В соответствии со схемой 3 и экспериментальным способом примера 5 1-(фенилметиловый) эфир (R)-5-оксо-1,2-пирролидинкарбоновой кислоты (коммерчески доступный продукт) эстерифицируют метилиодидом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и полученный таким образом (R) метиловый эфир подвергают взаимодействию с метиловым эфиром (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (полученным аналогично производному холевой кислоты, описанному в WO-A-95/32741: пример 5), получая метиловый эфир [3 (R), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты. После удаления (H₂/Pd) Cbz защитной группы и алкилирования 1,1-диметилэтиловым эфиром N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (полученным по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15) в CH₃CN/фосфатном буфере рН 8, получают гекса (сложный эфир), который превращают (водный LiOH/диоксан) в соответствующую гексакислоту. Образуют комплекс последней по способу примера 4, пункт D), в результате чего получают нужный продукт с общим выходом 44%.

Т.пл.: >300° С

Элементный анализ	С	H	N	Gd	Na
% вычислено:	46,49	5,71	5,29	14,85	6,51
% найдено:	44,02	6,13	5,10	14,09	6,17
	H2O 4,50%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 9

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (RS), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение получают из метилового эфира (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (полученного аналогично производному холевой кислоты, описанному в WO-A-95/32741: пример 5), и 1-(1,1-диметилэтилового) эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-DL-глутамовой кислоты (полученного из DL-глутамовой кислоты, как описано в WO-A-95/32741: пример 15 для L-изомера) в соответствии со способом, подробно изложенным в примере 4. Продукт получают с общим выходом 61%.

Т.пл.: >300° С

ВЭЖХ анализ: 99% (площадь, %)

Неподвижная фаза:		Zorbax ECLIPSE XDB-C8 3,5 мкм; 150× 4,6 мм колонка Rockland Tecnologies, Inc.
Температура:		40° C
Подвижная фаза:		градиентное элюирование
		A=0,005 M KH2PO4, 0,005 М К2НРO4, 0,3
		мМ EDTA в воде
		В=CH3CN
Градиент:	мин		% А	%В
	0		90	10
	5		90	10
	20		50	50

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Детектирование (УФ): 210 нм

Хроматографический метод выявляет два пика, почти равные в процентном отношении, которые связаны с диастереоизомерами благодаря наличию RS стереоцентра в DTPA остатке.

Элементный анализ	С	Н	N	Gd	Na
% вычислено:	46,49	5,71	5,29	14,85	6,51
% найдено:	43,98	6,34	4,98	13,86	6,16
	Н2O 4,63%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 10

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Метиловый эфир (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

Метиловый эфир (3 , 5 , 12 )-3,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты подвергают взаимодействию в условиях Mitsunobu (Mitsunobu, О. Synthesis 1981, 1-28; Denike, J.K. et al. Chem. Phys. Lipids 1995, 77, 261-267) с трифенилфосфином, диэтилазодикарбоксилатом и муравьиной кислотой в ТГФ, получая сложный метиловый эфир (3 , 5 , 12 )-3-формилокси-12-гидроксихолан-24-овой кислоты. Удаляют защитные группы (MeOH/HCl) до метилового эфира (3 , 5 , 12 )-3,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты, который вводят в ряд реакций, описанных в WO-A-95/32741: пример 5) для получения производного холевой кислоты. Метиловый эфир (3 , 5 , 12 )-3-амино-12-гидроксихолан-24-овой кислоты получают с общим выходом 32%.

Т.пл.: 90-92° С

[ ]²⁰D=+53,46 (с 1,3, СН₃ОН)

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	74,03	10,69	3,44
% найдено:	74,20	10,99	3,26

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 9:1:0,15 СНСl₃/СН₃ОН/25% NH₄OH R_f=0,21

Спектры ¹ Н-ЯМР, ¹³C-ЯMP, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В соответствии с реакционной схемой 3 и экспериментальным способом, представленным в примере 5, 2-метил-1-(фенилметиловый) диэфир (S)-5-оксо-1,2-пирролидиндикарбоновой кислоты подвергают взаимодействию с соединением А). Полученный таким образом метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты гидрируют (Н₂/Рd) для удаления Cbz защитной группы. Последующее алкилирование 1,1-диметилэтиловым эфиром N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (полученным по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15) в СН₃ СN/фосфатном буфере рН 8, приводит к получению гекса(сложного эфира). Последний превращают (водный LiOH/диоксан) в гексакислоту, которую комплектуют по способу примера 4, пункт D), получая нужный продукт с полным выходом 33%.

Т.пл.: >300° С.

ВЭЖХ анализ 100% (площадь, %)

Элементный анализ	С	Н	N	Gd	Na
% вычислено:	46,49	5,71	5,29	14,85	6,51
% найдено:	42,04	6,37	4,76	13,28	5,91
	Н2O 9,79%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 11

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 , 7 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение получают из метилового эфира (3 , 5 , 7 )-3-амино-7-гидроксихолан-24-овой кислоты (полученного аналогично производному холевой кислоты, описанному в WO-A-95/32741: пример 5) и 1-(1,1-диметилэтилового) эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (полученного как описано в WO-A-95/32741: пример 15) по способу, подробно изложенному в примере 4. Продукт получают с общим 89% выходом.

Т.пл.: >300° С

Элементный анализ	С	Н	N	Gd	Na
% вычислено:	46,49	5,71	5,29	14,85	6,51
% найдено:	43,88	6,50	4,91	13,62	6,04
	Н2О 7,11%

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 12

[3 (RS), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил] амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

Соединение получают из метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 ]-3-амино-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (полученного, как описано в WO-A-95/32741: пример 5) и 1-(1,1-диметилэтилового) эфира N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-DL-глутамовой кислоты (полученного из DL-глутамовой кислоты, как описано в WO-A-95/32741: пример 15 для L-изомера) по способу, подробно изложенному в примере 4 для получения соединения В). Продукт получают с общим 65% выходом.

Т.пл.: 224° С (с разложением)

ВЭЖХ анализ: 97% (площадь, %)

Неподвижная фаза: Zorbax ECLIPSE XDB-C8 3,5 мкм; 150× 4,6 мм колонка Rockland Technologies, Inc.

Температура: 40° С

Подвижная фаза: градиентное элюирование

А=0,017 М Н₃РО ₄, 0,3 мМ EDTA в воде

В=СН₃СN

Градиент:	мин	% А	%В
	0	95	5
	40	65	35
	50	65	35

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Детектирование (УФ): 210 нм

Хроматографический метод выявляет два пика, в почти равном процентном отношении, которые связаны с диастереоизомерами благодаря наличию RS-стереоцентра у DTPA остатка.

Элементный анализ	С	Н	N	Li, Cl
% вычислено:	57,60	7,78	6,55
% найдено:	54,34	7,82	6,19	<0,1	H2O 5,12%

Спектры ИК, ЯМР и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 13

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[[[6-(1,1-диметилэтокси)-5-[бис[2-[бис(2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-6-оксогексил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты

Способ 1: Раствор бис(трихлорметил)карбоната (2,9 г; 9,7 ммоль) в безводном CH₂Cl₂ (40 мл) добавляют по каплям в атмосфере азота к раствору метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3,7,12-тригидроксихолан-24-овой кислоты (коммерческий продукт) (10,0 г; 23,7 ммоль) и пиридина (2,3 мл; 28,4 ммоль) в безводном СН₂Сl₂ (100 мл), охлажденном до 0° С. Смесь оставляют нагреваться и через 1 час при комнатной температуре раствор охлаждают снова до 0° С, добавляют N,N-диизопропилэтиламин (7,9 мл; 47,3 ммоль), затем добавляют по каплям раствор (1,1-диметилэтилового) эфира N²,N²-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-лизина (Anelli, P.L. et аl. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) (17,6 г; 23,7 ммоль) в безводном СН₂Сl₂ (50 мл). Раствор перемешивают 3 часа при комнатной температуре, затем промывают Н₂О (2× 100 мл), сушат над Na₂ SO₄ и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (14,8 г; 12,4 ммоль).

Выход: 52%.

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³ С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Способ 2: Раствор метилового эфира [3 , 5 , 7 , 12 ]-3-[(хлоркарбонил)окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (Janout, V., Lanier, M.; Regen, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 640) (6,1 г; 12,6 ммоль) в безводном CH₂Cl ₂ (150 мл) охлаждают до 0°С в атмосфере азота и затем добавляют N,N-диизопропилэтиламин (4,8 мл; 27,6 ммоль). Затем добавляют по каплям раствор (1,1-диметилэтилового) эфира N ²,N²-бис [2-[бис[2-(1, 1-диметилэтокси) -2-оксоэтил]амино] этил]-L-лизина (9,3 г; 12,6 ммоль) в безводном CH₂ Cl₂ (20 мл). Раствор перемешивают 3 часа при комнатной температуре, затем промывают Н₂О (2× 100 мл), сушат над Na₂SO₄ и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (11,9 г; 9,9 ммоль).

Выход: 79%.

Спектры ¹ H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овая кислота

2 М Водный раствор LiOH (141 мл) добавляют по каплям к раствору соединения А) (11,2 г; 9,4 ммоль) в 1,4-диоксане (141 мл) при комнатной температуре. Через 104 часа раствор концентрируют (150 мл) и добавляют по каплям к 2 М водному раствору НСl (175 мл): конечное значение рН 1,9. Осадок отфильтровывают, промывают Н₂О (5× 50 мл) и сушат в вакууме. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии. Полученную твердую часть растворяют в 10% воды. CH₃CN и рН доводят до 1, добавляя концентрированную НСl, затем раствор вводят в колонку со смолой Amberlite® XAD 1600 (250 мл) и элюируют градиентом СН₃ СN/Н₂O. Содержащие продукт фракции выпаривают, получая нужный продукт (4,3 г; 4,8 ммоль).

Выход: 51%. Т.пл.: 184-191° С

K.F.: 4,36%

[ ]²⁰_D=+19,5 (с 1, 1 М NaOH)

ВЭЖХ анализ: 97,3% (% площадь)

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение, полученное на стадии В) (4,7 г; 5,2 ммоль), суспендируют в Н₂О (100 мл) и растворяют, добавляя 1 М NaOH (10 мл) до рН 6,5. Добавляют раствор GdCl ₃ (1,9 г; 5,2 ммоль) в Н₂O (17 мл), поддерживая значение рН 6,5 добавлением 1 М NaOH (15,6 мл). Через 1 час при комнатной температуре раствор вводят в колонку со смолой Amberlite® XAD 16.00 (250 мл), элюируя градиентом СН₃СN/H ₂О. Содержащие продукт фракции выпаривают, получая нужный продукт (4,2 г; 3,8 ммоль).

Выход 72%. Т.пл.: >300° С

K.F.: 9,49%

[ ]²⁰_D=+2,63 (С 2, Н₂O)

ВЭЖХ анализ: 100% (% площадь) (тот же способ, что на стадии В)

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 14

Комплекс марганца с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-амино-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

3,4 г 5% Pd/C добавляют к раствору метилового эфира [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[5-метокси-1,5-диоксо-4-[[(фенилметокси)карбонил]амино]пентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (пример 5, продукт В) (34,14 г; 50 ммоль) в МеОН (340 мл). Суспензию перемешивают при комнатной температуре более 3,5 часов в атмосфере водорода. После фильтрования через фильтр Millipore® FH (0,45 мкм) раствор выпаривают досуха, получая нужный продукт (27,1 г; 49,3 ммоль).

Выход: 98,6%

Потеря в весе (50° С; высокий вакуум):<0,1%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	67,85	9,55	5,10
% найдено:	68,58	9,72	5,12

[ ]²⁰D=+36,61 (с 2,01, СНСl₃)

Кислотный титр (0,1 М НСl): 94,6%

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯMP, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил][2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

Соединение, полученное на стадии А) (16,0 г; 29,1 ммоль), и 1,1-диметилэтиловый эфир N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (13,3 г; 37,8 ммоль) (полученный по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15) растворяют в EtOAc (120 мл). После добавления 2 М фосфатного буфера рН 8 (120 мл) смесь интенсивно перемешивают в течение 2 часов, затем водную фазу заменяют свежим 2 М фосфатным буфером рН 8 (120 мл) и перемешивают еще 70 часов. Смесь нагревают до 40° С в течение 12 часов, охлаждают до комнатной температуры, разделяют и органическую фазу выпаривают, получая остаток, который растворяют в CH₂Cl₂ (150 мл), промывают водой (2× 100 мл), сушат над Na₂SO₄ и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (12,3 г; 15,0 ммоль).

Выход: 52%.

Элементный анализ	С	N	N
% вычислено:	65,90	9,46	5,12
% найдено:	65,99	9,72	5,03

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 1:1=EtOAc/н-гексан R_f=0,40

Детектирование: 1% КМnO₄ в 1 M NaOH

Спектры ¹H-ЯMP, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил][2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]-5-метокси-1,5-диоксопентил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

трет-Бутилбромацетат (3,9 г; 20,1 ммоль) добавляют по каплям к раствору соединения, полученного на стадии В) (11,0 г; 13,4 ммоль), и N,N-диизопропилэтиламина (3,5 мл; 20,1 ммоль) в СН₃СN. Смесь перемешивают при комнатной температуре 24 часа и затем добавляют еще N,N-диизопропилэтиламин (0,9 мл; 4,0 ммоль) и трет-бутилбромацетат (0,8 г; 4,0 ммоль). Смесь перемешивают еще 70 час, разделяют и органическую фазу выпаривают, получая остаток, который растворяют в CH₂Cl₂ (150 мл), промывают водой (2× 100 мл), сушат над Na₂ SO₄ и выпаривают. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (10,7 г; 11,5 ммоль).

Выход: 85%.

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	65,57	9,39	4,50
% найдено:	66,27	9,62	4,52

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 1:1=EtOAc/н-гексан R_f=0,46

Детектирование: 1% КМnO₄ в 1 M NaOH

Спектры ¹H-ЯMP, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

2 М водный раствор LiOH (120 мл) добавляют по каплям к раствору соединения, полученного на стадии С) (9,2 г; 9,8 ммоль), в 1,4-диоксане (120 мл) при комнатной температуре. Через 24 часа раствор концентрируют (100 мл) и добавляют по каплям к 2 М водной НСl (135 мл): конечное значение рН 1,9. Осадок отфильтровывают, промывают Н₂О (5× 50 мл) и сушат в вакууме, получая нужный продукт (7,3 г; 9,6 ммоль).

Выход: 98%. Т.пл.: 163-168° С

K.F.: 1,81%

[ ]²⁰_D=+29,03 (с 1, 1 М NaOH)

ВЭЖХ анализ: 100% (площадь %)

Неподвижная фаза: Zorbax Eclipse XDB-C8 3,5 мкм; 150× 4,6 мм; колонка заполнена Rockland Technologies Inc.;

Температура: 40° С;

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Е) Комплекс марганца с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение, полученное на стадии D) (5,3 г; 7,2 ммоль), суспендируют в Н₂O (250 мл) и растворяют, добавляя 1 М NaOH (36 мл) до рН 6,5. Добавляют раствор MnCl ₂· 4H₂O (1,4 г; 7,2 ммоль) в Н₂О (50 мл), поддерживая рН 6,5 добавлением 1 М NaOH (7,9 мл). Через 1 час при комнатной температуре раствор обессоливают, осуществляя нанофильтрацию, затем выпаривают, получая нужный продукт.

Выход: 98%. Т.пл.: >300° С

K.F.: 13,54%

[ ]²⁰D=+2,63 (с 2, H₂O)

СЕ анализ: 100%(площадь %)

Капилляр: кварцевое стекло 0,72 м × 50 мкм

Напряжение: 30 кВ

Буфер: 0,07 М борат, рН 9,3, 0,3 мМ EDTA

Температура: 25° С

Время остановки: 20 мин

Детектирование (УФ): 200 нм

Инжекция: гидродинамическая (50 мбар, 4 сек)

Концентрация образца: 1 мг/мл

Прибор: Hewlett Packard 3D НРСЕ

Временная схема предварительной подготовки
t (мин)	действие
2	промывка H2O
2	промывка 0,1 М NaOH
1	промывка Н2О
5	промывка буфером

Элементный анализ	С	Н	N	Mn	Na	Сl
% вычислено:	51,87	6,35	4,90	6,41	8,05
% найдено:	45,50	6,95	4,30	5,28	6,86	<0,1

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Тем же способом, исходя из соединения В) примера 2, получают гадолиниевый комплекс [3 (S), 5 ]-3-[[4-[[2-[[бис-(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-оксохолан-24-овой кислоты.

ПРИМЕР 15

Комплекс марганца с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир N²-[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-N ²-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]-N⁶ -[(фенилметокси)карбонил]-L-лизина

1,1-диметилэтиловый эфир N-(2-бромэтил)-N-[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]глицина (25,6 г; 72,55 ммоль) (полученный по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 15), растворенный в СН₃СN (25 мл), добавляют по каплям к раствору гидрохлорида метилового эфира N⁶ -[(фенилметокси) карбонил]-L-лизина (20 г; 60,46 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (12,64 мл; 72,55 ммоль) в СН₃СN (250 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре. Через 5 дней к раствору добавляют еще N,N-диизопропилэтиламин (17,7 мл; 101,6 ммоль) и трет-бутилбромацетат (18,8 г; 13,5 мл; 101,6 ммоль). Через 24 часа растворитель выпаривают и остаток обрабатывают Et₂O (200 мл). Смесь фильтруют, раствор промывают 0,1 М НСl (2× 100 мл), сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (13,03 г; 19,2 ммоль).

Выход: 32%

K.F.: <0,1%

[ ]²⁰D=-22,47 (с 1,93, СНСl₃)

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	61,83	8,45	6,18
% найдено:	61,70	8,52	5,84

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 3:7=EtOAc/н-гексан R_f=0,40

Детектирование: Се(SO₄)₂· 4Н₂ O (0,18%) и (NH₄)₆Мо₇O₂₄ · 4Н₂O (3,83%) в 10% H₂ SO₄

Спектры ¹Н-ЯМР, ¹³ С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Метиловый эфир (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[(хлоркарбонил)окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: ВСЕ ОПЕРАЦИИ СЛЕДУЕТ ВЫПОЛНЯТЬ В ХОРОШО ВЕНТИЛИРУЕМОМ ВЫТЯЖНОМ ШКАФУ

20% Раствор фосгена в толуоле (100 мл; 202,2 ммоль) добавляют по каплям к раствору метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (14,7 г; 36 ммоль) в безводном CH₂Cl₂ (350 мл), охлажденном до 0° С в атмосфере азота. Раствор перемешивают 3 часа при комнатной температуре, затем выпаривают (ОСТОРОЖНО), получая нужный продукт (15,2 г; 32,4 ммоль).

Выход: 90%.

Спектры ¹ H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Метиловый эфир [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[[[5-[[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил][2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]-6-метокси-6-оксогексил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты

5% Pd/C (1,3 г) добавляют к раствору соединения, полученного на стадии А) (12,3 г; 18,1 ммоль), в МеОН (120 мл), и суспензию перемешивают в течение 3 часов в атмосфере водорода при комнатной температуре. После фильтрования через фильтр Millipore® (FT 0,45 мкм) раствор выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт растворяют в безводном CH₂Cl₂ (20 мл) и добавляют по каплям к раствору соединения, полученного на стадии В) (8,7 г; 18,54 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (DIEA) (6,5 мл; 37,07 ммоль) в безводном CH₂Cl ₂ (200 мл) при 0° С и в атмосфере азота. Через 3 часа реакционную смесь промывают Н₂О (2× 100 мл), органическую фазу выделяют, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (8,6 г; 8,8 ммоль).

Выход: 49%.

K.F.:<0,1%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	65,07	9,38	4,30
% найдено:	65,67	9,52	4,24

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60 F 254 Merck

Элюент: 3:7=EtOAc/н-гексан R_f=0,30

Детектирование: Се(SO₄)₂· 4Н₂ O (0,18%) и (NH₄)₆Мо₇O₂₄ · 4Н₂O (3,83%) в 10% H₂ SO₄

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³ С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овая кислота

2 М LiOH (133 мл; 266 ммоль) добавляют к раствору соединения, полученного на стадии С) (8,5 г; 10,64 ммоль) в 1,4-диоксане (130 мл). Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре 24 часа, а затем нейтрализуют до рН 7, добавляя 2 N НСl (120 мл). Раствор концентрируют, выпаривая при пониженном давлении до половины объема и очень медленно подкисляют до рН 1,5 при интенсивном перемешивании, получая белый осадок, который отфильтровывают, промывают Н₂О (2× 100 мл) и сушат, получая нужный продукт (6,45 г; 8,13 ммоль).

Выход: 76%. Т.пл.: 188,9° С

K.F.: 1,44%

[ ]²⁰D=+35,47 (с 2,01, 1 M NaOH)

ВЭЖХ анализ: 96,8% (площадь %)

Неподвижная фаза: Zorbax Eclipse XDB-C8 3,5 мкм; 150× 4,6 мм колонка заполнена Rockland Technologies Inc.

Температура: 40° С;

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Е) Комплекс марганца с натриевой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]карбонил]окси]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

Соединение, полученное на стадии D) (5 г; 6,3 ммоль), суспендируют в Н₂О (50 мл) и растворяют, добавляя 1 М NaOH (18 мл; 18 ммоль). Добавляют 0,559 М водный раствор MnCl₂ (11,27 мл; 6,3 ммоль) более чем за 3 часа, поддерживая рН 6,5 посредством 1 М NaOH (7,8 мл). Доводят рН раствора до 6,8, добавляя 1 М NaOH (0,9 мл; 0,9 ммоль), фильтруют (НА мембрана 0,45 мкм Millipore®) и обессоливают нанофильтрацией. Раствор выпаривают и сушат, получая нужный продукт (5,45 г; 6,05 ммоль).

Выход: 96%. Т. пл.: >300° С

K.F.: 3,78%

[ ]²⁰_D=+2,74 (с 2, Н₂О)

СЕ анализ: 100% (площадь %)

Капилляр: кварцевое стекло 0,72 м × 50 мкм

Напряжение: 30 кВ

Буфер: 0,07 М борат, рН 9,3, 0,3 мМ EDTA

Температура: 25° С

Время остановки: 20 мин

Детектирование (УФ): 200 нм

Инжекция: гидродинамическая (50 мбар, 4 сек)

Концентрация образца: 1 мг/мл

Прибор: Hewlett Packard 3D НРСЕ

Временная схема предварительной подготовки
t (мин)	действие
2	промывка H 2O
2	промывка 0,1 М NaOH
1	промывка Н2О
5	промывка буфером
Элементный анализ		С	H	N	Mn	Na	Сl
% вычислено:		52,00	6,49	4,66	6,10	7,66
% найдено:		49,54	7,17	4,44	5,65	7,58	<0,1

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

ПРИМЕР 16

Комплекс гадолиния с натриевой солью N ²-биc-[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 , 7 , 12 )-7,12-дигидрокси-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина (1:3)

А) Фенилметиловый эфир [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-[1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-(1,1-диметилэтокси)-1,5-диоксопентил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты

1-(1,1-диметилэтиловый) эфир N,N-бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-глутамовой кислоты (Anelli, P. L. et al. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) (37 г; 50 ммоль), фенилметиловый эфир [3 , 5 , 7 , 12 ]-3-амино-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (Anelli, Р. L.; Lattuada, L.; Uggeri, F. Synth. Commun. 1998, 28, 109) (31 г; 55 ммоль) и диэтилцианофосфонат (коммерческий продукт) (9,6 г; 55 ммоль; 9,2 мл) растворяют в ДМФ (750 мл). Полученный раствор охлаждают до 0° C и по каплям добавляют Et₃N (7,3 мл). Через 1 час при комнатной температуре раствор выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в EtOAc (300 мл), промывают 5% водным NаНСО₃ (2× 200 мл) и затем рассолом (2× 200 мл). Органическую фазу выделяют, сушат над Na₂SO₄ и затем выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (36 г; 29 ммоль).

Выход 58%

K.F.: 0,98%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	65,64	9,21	4,57
% найдено:	66,31	9,20	4,51

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 2:8=EtOAc/н-гексан R_f=0,3

Детектирование: АсОН/конц. Н₂SO₄/п-анисовый альдегид=100:2:1

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) Триэтиламмониевая соль [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис[2-(1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]амино]-5-(1,1-диметилэтокси)-1,5-диоксопентил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты

5% Pd/C (3,6 г) добавляют к раствору соединения, полученного на стадии А) (36 г; 29,4 ммоль), в EtOH (1,5 л) и суспензию перемешивают в течение 3 часов в атмосфере водорода при комнатной температуре. После фильтрования (через фильтр Millipore® FT 0,45 мкм) раствор выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (22 г; 18 ммоль).

Выход 60%. Т.пл.: 58° С

K.F.: 1,34%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	65,07	9,86	5,66
% найдено:	64,34	10,07	5,48

ТСХ: Неподвижная фаза: пластина силикагеля 60F 254 Merck

Элюент: 1:5:95=Et₃N/MeOH/CH₂Cl ₂ R_f=0,33

Детектирование: АсОН/конц. Н ₂SO₄/п-анисовый альдегид=100:2:1

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) N²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 , 7 , 12 )-7,12-дигидрокси-24-охо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамин

Et₃N (1,2 г; 12 ммоль; 1,7 мл) добавляют по каплям к раствору соединения В) (12,5 г; 11 ммоль), 2-аминоэтансульфоновой кислоты (коммерческий продукт) (1,5 г; 12 ммоль) и диэтилцианофосфоната (коммерческий продукт) (2,1 г; 12 ммоль; 2 мл) в ДМФ (400 мл) при 0° С и в атмосфере азота. Через 20 мин реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают 3 часа. Раствор выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в диоксане (250 мл) и по каплям добавляют 0,5 М водную H ₂SO₄ (250 мл; 125 ммоль). Полученную смесь нагревают при 90° С в течение 2 часов. Доводят рН раствора с 1,4 до 7, добавляя 2 н. NaOH, и растворитель выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии. Продукт растворяют в Н₂О (250 мл) и 2 н. НСl (12,5 мл) и обессоливают, элюируя градиентом СН₃СN/Н ₂О через колонку со смолой Amberlite® XAD-16.00, получая нужный продукт (1,5 г; 1,6 ммоль).

Выход 14%. Т.пл.: >200° С

K.F.: 5,87%

Элементный анализ	С	Н	N	S
% вычислено:	53,68	7,44	7,28	3,33
% найдено:	50,34	7,71	6,64	2,99

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

D) Комплекс гадолиния с натриевой солью N²-биc[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 , 7 , 12 )-7,12-дигидрокси-24-охо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина (1:3)

Продукт С) (880 мг; 0,915 ммоль) растворяют в Н ₂O (50 мл) и 1 н. NaOH добавляют по каплям до достижения значения рН 6,8. Добавляют Gd₂O₃ (165 мг; 0,46 ммоль) и полученную суспензию нагревают при 50° С в течение 6 часов. Реакционную смесь отфильтровывают через аппарат Millipore® (НА фильтр 0,45 мкм) и полученный фильтрат вводят в колонку со слабой катионообменной смолой Dowex® CCR 3LB (Nа ⁺ форма, 20 мл). Элюат выпаривают при пониженном давлении и сушат, получая нужный продукт (1,00 г; 0,75 ммоль).

Выход 82%. Т.пл.:> 250° С

K.F.: 13,95%

ВЭЖХ анализ: 100% (площадь %)

Неподвижная фаза: Lichrospher 100 RP-8 5 мкм; 250× 4 мм колонка заполнена Merck KGaA

Температура: 40° С

Подвижная фаза: Изократическое элюирование предварительно смешанной подвижной фазой; 1 г н-октиламина добавляют к 300 мл ацетонитрила в смеси с 700 мл воды. Раствор буферируют до рН 6, добавляя Н₃РO₄

Скорость потока: 1 мл/мин

Детектирование (УФ): 200 нм

Элементный анализ	С	Н	N	S	Gd	Na
% вычислено:	43,78	5,54	5,92	2,71	13,30	5,83
% найдено:	36,82	6,04	5,11	2,18	10,64	5,35

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Аналогичным способом получают гадолиниевый комплекс N ²-бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]-N-[(3 , 5 )-24-оксо-24-[(2-сульфоэтил)амино]холан-3-ил]-L-глутамина.

ПРИМЕР 17

Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты (1:3)

А) Метиловый эфир [3 , 5 ]-3-(карбоксиметокси)холан-24-овой кислоты

Трифлат бензилгликолята (Williams, M.A.; Rapoport, H.J. Org. Chem. 1994, 59, 3616) (16,8 г; 56,3 ммоль) добавляют за промежуток времени более 15 минут к перемешиваемому раствору метилового эфира [3 , 5 ]-3-гидроксихолан-24-овой кислоты (Dayal, В. et al. Steroids, 1981, 37, 239) (20 г; 51,2 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (10 мл; 57,4 ммоль) в безводном СН₃СN (400 мл) при -20° С. Через 4 часа при -20° С смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают еще 4 часа. Растворитель выпаривают, а остаток распределяют между EtOAc (300 мл) и насыщенным NaHCO₃ (300 мл). Органическую фазу сушат над Na ₂SO₄ и выпаривают. Остаток растворяют в EtOH (200 мл), затем добавляют 5% Pd/C (3 г) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов в атмосфере водорода. После фильтрования через фильтр Millipore® FH (0,45 мкм) раствор выпаривают, а остаток очищают с помощью флэш-хроматографии, получая нужный продукт (14,2 г; 31,7 ммоль).

Выход: 62%

K.F.:<0,1

Элементный анализ	С	Н
% вычислено:	72,28	9,89
% найдено:	71,97	9,81

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

В) [3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овая кислота

(1,1-Диметилэтиловый) эфир N²,N ²-бис[2-[бис[2-[1,1-диметилэтокси)-2-оксоэтил]амино]этил]-L-лизина (Anelli, Р. L. et al. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) (18,56 г; 25 ммоль), соединение А) (11,2 г; 25 ммоль) и диэтилцианофосфонат (коммерческий продукт) (4,9 г; 28 ммоль) растворяют в ДМФ (300 мл). Полученный раствор охлаждают до 0° С и по каплям добавляют Et₃N (4 мл). Через 6 часов при комнатной температуре раствор выпаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в EtOAc (250 мл), промывают 5% водным NаНСО₃ (2× 100 мл) и затем рассолом (2× 100 мл). Органическую фазу выделяют, сушат над Na₂SO₄ и затем выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в диоксане (300 мл) и по каплям добавляют 0,5 М водную Н₂SO₄ (300 мл; 150 ммоль). Полученную смесь нагревают при 90° С в течение 2 часов. Доводят рН раствора до 7, добавляя 2 н. NaOH, и растворитель выпаривают при пониженном давлении. Сырой продукт очищают с помощью флэш-хроматографии. Продукт растворяют в Н₂О (300 мл) и 2 н. НСl (30 мл) и обессоливают, элюируя через колонку со смолой Amberlite® XAD-16.00 градиентом СН₃СН/Н₂О, с получением нужного продукта (9,03 г; 10,25 ммоль).

Выход 41%

K.F.: 2,78%

Элементный анализ	С	Н	N
% вычислено:	59,98	8,24	6,36
% найдено:	58,11	8,28	6,14

Спектры ¹H-ЯМР, ¹³С-ЯМР, ИК и МС соответствуют указанной структуре.

С) Комплекс гадолиния с натриевой солью [3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты (1:3)

Продукт В) (5 г; 5,67 ммоль) растворяют в Н₂О (200 мл), добавляя 1 н. NaOH до достижения рН 6,8. Добавляют Gd₂O₃ (1,03 г; 2,84 ммоль) и полученную суспензию нагревают при 50° С в течение 8 часов. Реакционную смесь фильтруют через аппарат Millipore® (НА 0,45 мкм фильтр) и фильтрат выпаривают при пониженном давлении, сушат, получая нужный продукт (5,74 г; 5,21 ммоль).

Выход 92%. Т.пл.: >250° С

K.F.: 5,81%

Элементный анализ	С	Н	N	Gd	Na
% вычислено:	47,99	6,04	5,09	14,28	6,26
% найдено:	45,09	6,15	4,77	13,39	5,81

Спектры ИК и МС соответствуют указанной структуре.

Аналогичным образом, исходя из соединения А) примера 15, получают гадолиниевый комплекс [3 (S), 5 ]-3-[2-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-2-оксоэтокси]холан-24-овой кислоты

Аналогичным образом, исходя из соединения А) примера 15 и метилового эфира (3 , 5 , 7 , 12 )-3-[(3-карбокси-1-оксопропил)амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (полученного по способу, раскрытому в WO-A-95/32741: пример 12), получают гадолиниевый комплекс [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[[5-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]-5-карбоксипентил]амино]-1,4-диоксобутил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты.

ПРИМЕР 18

Измерения скорости релаксации ( 1/T₁)

Эффективность соединений настоящего изобретения в качестве агентов для кровяного депо оценивают путем построения графиков скорости релаксации 1/T₁ в зависимости от времени, прошедшего после введения. Скорость релаксации протонов 1/T₁ образцов крови, полученных в заранее определенные моменты времени, измеряют при температуре 39° С на приборе Brucker Minispec PC120, используя трехпараметрические последовательности “inversion recovery”.

Соединение, полученное в примере 1, комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]холан-24-овой кислоты (1:3), вводят кроликам в дозе 0,1 ммоль/кг. На диаграмме (Фиг.1) представлен график скорости релаксации.

Соединение, полученное в примере 9 патентной заявки WO 95/32741, комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 , 5 , 7 , 12 ]-3-[[N-[N-[2-[[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил](карбоксиметил)амино]этил]-N-(карбоксиметил)глицил]глицил]амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:2), вводят кролику в дозе 0,1 ммоль/кг. На диаграмме (Фиг.2) представлен график скорости релаксации.

Соединение, полученное в примере 15 патентной заявки WO 95/32741, комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 7 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил] амино]-7,12-дигидроксихолан-24-овой кислоты (1:3), вводят кролику в дозе 0,1 ммоль/кг. На диаграмме (Фиг.3) представлен график скорости релаксации.

Соединение, полученное в примере 4, комплекс гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3), вводят обезьяне в дозе 0,05 ммоль/кг. На диаграмме (Фиг.4) представлен график скорости релаксации.

ПРИМЕР 19

0,3 М фармацевтическая композиция комплекса гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3)

31,775 кг комплекса гадолиния с 1-деокси-1-(метиламино)-D-глуцитоловой солью [3 (S), 5 , 12 ]-3-[[4-[бис[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]-4-карбокси-1-оксобутил]амино]-12-гидроксихолан-24-овой кислоты (1:3) (полученной по способу примера 4) и 100 г трометамолгидрохлорида растворяют в 100 л стерильной воды при комнатной температуре в фармацевтическом реакторе из нержавеющей стали. После растворения рН раствора доводят до 7,4, добавляя 1 М трометамол. Раствор фильтруют в стерильных условиях через фильтры диаметром 0,22 мм и распределяют в 20 мл ампулы, которые закрывают галогенобутиловыми пробками, герметизируют алюминиевыми кольцами и стерилизуют паром при Fo=18. ВЭЖХ показывает 0,294 М титр.

ПРИМЕР 20

Предварительно заполненные пластиковые шприцы, содержащие композицию примера 19.

Порции по 20 мл раствора, приготовленного в примере 19, помещают в CZ пластиковый шприц, кончик которого закрыт наконечником. Поршень вставляют под вакуумом, и предварительно заполненный шприц стерилизуют в автоклаве до величины Fo=18.