рекомбинантная плазмидная днк pa3gf, кодирующая полипептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pA3GF, кодирующая полипептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека с молекулярной массой 2,44 Md (3,693 т.п.о.), состоящая из EcoRI/HindIII - фрагмента плазмиды pTNF331 длиной 2,929 т.п.о., содержащего терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla -лактамазы и участок ori инициации репликации; KpnI/EcoRI - фрагмента этой же плазмиды размером 0,136 т.п.о., включающего промотор A3 из ранней области бактериофага Т7; KpnI/SalI фрагмента плазмиды pTEGFb размером 0,637 т.п.о., содержащего участок усилителя трансляции TREN и ген gcsf, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой формы ГКСФ и фланкированный сайтами рестрикции Clal и HindIII;

содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты:

EcoRI - 1 и 808, Kpn I - 136, Cla I - 227 и 771, PstI - 626 и 2945, HindIII - 352 и 764, Хbа1 190, 1292 и 1394.

2. Штамм бактерий Escherichia coli SGK25/pA3GF - продуцент полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую синтетический ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, промотор A3 из ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок - усилитель трансляции, обуславливающие биосинтез полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, а также штамм Escherichia coli - продуцент этого полипептида.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (ГКСФ) представляет собой гликопротеин массой около 19 кДа, относящийся к семейству -спиральных цитокинов и продуцируемый макрофагами, фибробластами и клетками эндотелия при соответствующей стимуляции. Он обладает широким спектром биологической активности и является одним из основных факторов гемопоэза. ГКСФ индуцирует дифференцировку клеток-предшественников в нейтрофилы, стимулирует пролиферацию нейтрофильных грану лоцитов и активность зрелых нейтрофилов [1-2]. В качестве медицинского препарата ГКСФ уменьшает продолжительность нейтропении после пересадки костного мозга при лейкозах и интенсивной химиотерапии онкологических заболеваний, способствует быстрому восстановлению гранулоцитов после облучения, а также повышает устойчивость к вирусным и инфекционным заболеваниям [3-5]. Эти свойства обусловливают широкое применение ГКСФ в терапии злокачественных опухолей и других заболеваний. Известны способы получения природного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека из клеточных линий, продуцирующих этот цитокин, а также рекомбинантного ГКСФ из клеток высших эукариот [6-8], однако выход целевого продукта при использовании этих способов чрезвычайно низок. Гораздо более эффективным способом получения ГКСФ является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных ДНК. Использование этого подхода позволяет создавать оптимальные условия для бактериальной экспрессии рекомбинантного гена, значительно удешевляет получение конечного продукта при полном сохранении его биологических свойств, так как известно, что полисахаридная цепь гликопротеида ГКСФ не является необходимой для его биологической активности [9]. Известны способы получения рекомбинантного ГКСФ микробиологическим индуцибельным синтезом в клетках Escherichia coli [10], однако использование дорогостоящих индукторов снижает технологичность процесса и увеличивает себестоимость конечного продукта.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [11]. Штамм E.coli SG20050 содержит рекомбинантную плазмидную ДНК pGGF8, кодирующую рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (рч-ГКСФ), экспрессия которого находится под контролем тандема триптофановых промоторов. Недостатком плазмиды pGGF8 и штамма на ее основе является недостаточно высокий выход конечного продукта - около 10% от суммарного клеточного белка. Это, по-видимому, объясняется недостаточно эффективным процессом транскрипции, так как промоторы триптофанового оперона не являются конститутивными и обеспечивают лишь условно конститутивный биосинтез при выращивании на богатой среде.

Технической задачей изобретения является увеличение уровня биосинтеза полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и создание более продуктивного штамма-продуцента.

Поставленная задача решается путем конструирования плазмиды pA3GF, обеспечивающей конститутивный синтез полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамма Escherichia coli SGK25/pA3GF, синтезирующего этот полипептид в количестве не ниже 25% от суммарного клеточного белка, что в 2,5 раза выше, чем в прототипе. Высокий конститутивный уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что плазмида pA3GF обладает высокой копийностью, содержит сильный конститутивный промотор A3 из ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок - усилитель трансляции (TREN) гена 10 бактериофага Т7.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pA3GF, кодирующая полипептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 2,44 Md (3,693 т.п.о.);

кодирует аминокислотную последовательность зрелого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека;

состоит из EcoRI/HindIII - фрагмента плазмиды pTNF331 [12] длиной 2,929 т.п.о., содержащего терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla -лактамазы и участок ori инициации репликации; Kpnl/ EcoRI - фрагмента этой же плазмиды размером 0,136 т.п.о., включающий промотор A3 из ранней области бактериофага Т7; KpnI/SalI фрагмента плазмиды pTEGFb [13] размером 0,637 т.п.о., содержащий участок усилителя трансляции TREN и ген gcsf, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой формы ГКСФ и фланкированный сайтами рестрикции ClaI и HindIII;

содержит: промотор A3 из ранней области бактериофага Т7, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, синтетический ген gcsf, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pA3GF клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты:

EcoRI - 1 и 808, Kpn 1-136, Cla I - 227 и 771, PstI - 626 и 2945, HindIII - 352 и 764, Xbal - 190, 1292 и 1394.

Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что ген gcsf находится под контролем сильного конститутивного промотора A3 из ранней области бактериофага Т7, а для усиления трансляции используется синтетический усилитель трансляции TREN, что в совокупности обеспечивает конститутивный биосинтез целевого белка с высоким выходом.

Для получения штамма-продуцента полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека компетентные клетки Escherichia coli штамма SGK 25 [14], созданного в ЗАО «Биокад» на основе штамма SG 20050 [15], трансформируют рекомбинантной плазмидой pA3GF.

Полученный штамм Escherichia coli SGK 25/ pA3GF характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, подвижные, размером 1×3-5 мкм, неспороносные.

Культуральные признаки. При росте на агаризованной LB-среде колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный; диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется равномерным помутнением среды.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки штамма подуцента могут расти в диапазоне температур 20-42°С, оптимум составляет 37°С. Наиболее благоприятные для роста значения рН находятся в интервале 6,8-7,2. При росте в аэробных условиях культура может усваивать азот как органических соединений (пептон, триптон, аминокислоты, дрожжевой экстракт), так и аммонийных солей. Углерод усваивается в форме углеводов, многоатомных спиртов (глицерин), аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы, а также к стрептомицину (25 мкг/мл) и тетрациклину (до 50 мкг/мл), связанную соответственно с наличием в хромосоме мутации rpsL и транспозона Tn10.

Способ, условия и состав среды для хранения штамма. LB-бульон с 15% глицерином, при температуре -70°С, в криовиалах.

Преимуществом заявляемого способа от прототипа является более высокий уровень биосинтеза целевого белка в результате использования более продуктивного штамма-продуцента и оптимизации условий его культивирования. Штамм Е. coli SGK25/pA3GF обеспечивает устойчивый конститутивный синтез полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве не менее 25% от суммарного клеточного белка. Это обуславливает высокую эффективность процесса получения полипептида, т.к. выход рекомбинантного полипептида в оптимальном режиме культивирования на LB среде составляет не менее 25 мг на литр культуры.

На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pA3GF, на фиг.2 - нуклеотидная последовательность гена ГКСФ с прилегающими регуляторными элементами, инициирующий и терминирующий кодоны выделены жирным шрифтом, подчеркнуты сайты рестриктаз: EcoRI, Kpn I, Hind III, PstI, Cla I; на фиг.3 - аминокислотная последовательность полипептида ГКСФ, кодируемого рекомбинантной плазмидой pA3GF; на фиг.4 - электрофореграмма лизатов клеток штамма-реципиента Е. coli SGK25 (дорожка 1), четырех произвольных клонов штамма-продуцента Е. coli SGK25/pA3GF (дорожки 2-5) в 12,5%-ном полиакриламидном геле (М - белковые маркеры молекулярной массы, kDa: 14,5; 21,5; 31,0; 45,0; 66,0; 97,4; стрелкой указан полипептид рч -ГКСФ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Конструирование промежуточной векторной плазмиды рА₃31, содержащей промотор A3

Исходным материалом для получения векторной конструкции рА ₃31 послужила плазмида pTNF331 [12], содержащая тандем промоторов А2А3. Для выщепления промотора А2 10 мкг pTNF331 [12] обрабатывают рестриктазами EcoRI и PstI по стандартной методике [16]. Продукты реакции разделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосы длиной 748 п.о.и 2938 п.о. вырезают, фрагменты экстрагируют из геля и повергают лигированию в 20 мкл реакционной смеси по стандартной методике. 5 мкл Реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом EcoRI и PstI. В результате получают векторную плазмиду рА₃ 31, содержащую промотор A3.

Пример 2. Конструирование экспрессионной плазмиды pA3GF

10 мкг Плазмиды pTEGFb [13] обрабатывают рестриктазой SaIl, по окончании реакции смесь прогревают 5 мин при 90°С для инактивации фермента и достраивают выступающие 3'-концы по стандартной методике в присутствии dNTP и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I [16]. ДНК из реакционной смеси осаждают этанолом и обрабатывают рестриктазой Kpn I. Фрагмент длиной 633 п.о., содержащий усилитель трансляции TREN и ген gcsf выделяют из агарозного геля. 5 мкг Промежуточной векторной плазмиды рА ₃31 обрабатывают рестриктазой HindIII, выступающие липкие концы достраивают, как описано выше, затем обрабатывают рестриктазой Kpn I и линеаризированную векторную часть выделяют из агарозного геля. Далее 2 мкг SaII-Kpn I-фрагмента, содержащего усилитель трансляции TREN и ген gcsf и 1 мкг линеанизированной векторной части лигируют в 20 мкл реакционной смеси по стандартной методике. 5 мкл Реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом ClaI, Kpn I и HindIII. Полученную в результате рекомбинантную плазмиду анализируют HaeIII, Kpn I, PstI и HindIII. Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва) как описано в руководстве [17]. В результате получают экспрессионную плазмиду pA3GF (фиг.1).

Пример 3. Получение штамма-продуцента полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека

Рекомбинантной плазмидной ДНК pA3GF трансформируют компетентные клетки Escherichia coli SGK 25 [14] и после выращивания рекомбинантных клонов на LB-агаре с ампициллином при 32°С получают штамм-продуцент полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

Пример 4. Определение продуктивности штамма - продуцента полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

Для определения продуктивности штамма E.coli SGK25/pA3GF клетки одного клона выращивают при 32°С в среде LB, в колбах с объемом среды 100 мл/колбу, на качалке при скорости вращения 100 об/мин в течение 16 часов. Рост оценивают по значению оптической плотности культуры при длине волны 560 нм. Пробы для анализа получают путем центрифугирования культуральной жидкости при 6000 об/мин в течение 5-10 мин.

Содержание рч-ГКСФ определяют по отношению к суммарному клеточному белку. Для этого клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8; 10% глицерина; 2,3% SDS; 5% меркаптоэтанола; 0,001% бромфенолового синего. Смесь нагревают 5 мин на кипящей водяной бане и охлаждают до комнатной температуры. Образцы объемом 5,8 и 15 мкл подвергают электрофорезу в 12,5% SDS-ПААГ. По окончании электрофореза гель прокрашивают при помощи кумасси R-250. После отмывки красителя гель сканируют и проводят математическую обработку результатов с помощью программы "Gel-Pro".

По полученным данным, культура достигает значений ОП 3,2-4,0 о.е., рекомбинантный ГКСФ составляет 25-30% от суммарного белка клетки (фиг.4).

Пример 5. Определение продуктивности штамма-продуцента полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека при оптимизации параметров культивирования.

Для определения продуктивности штамма E.coli SGK25/pA3GF используют клетки одного клона, хранящиеся в виде глицериновых стоков при минус 70°С. С целью повышения продуктивности штамма используют богатую комплексную среду (SB) в сочетании с оптимальным режимом аэрирования. Культивирование проводят в колбах, содержащих 40 мл среды и 100 мкг/мл ампициллина, на качалке при температуре 32°С и частоте вращения 150 об/мин в течение 17 часов. Рост оценивают по значению оптической плотности культуры при длине волны 560 нм, содержание рч-ГКСФ определяют по методу, описанному в примере 4.

По полученным данным, при оптимизации условий культивирования, ОП достигает значений 14,0-15,0 о.е., при этом, содержание рекомбинантного ГКСФ составляет (35-40)% от суммарного белка клетки.

Пример 6. Определение продуктивности штамма - продуцента полипептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека при масштабировании процесса культивирования.

Для определения продуктивности штамма E.coli SGK25/pA3GF проводят наработку биомассы в 75-литровом ферментере, с рабочим объемом среды 50 л. Посевной материал получают по следующей схеме: клетки одного клона (свежеполученного или хранящегося в Банке клеток при температуре минус 70°С инкубируют в 2-4 мл LB среды в течение 4 ч, после чего пересевают в колбы.

Для засева ферментера используют 1 л посевного материала, выращенного в колбах на LB среде с ампициллином в течение 7-8 ч при 32°С и 150 об/мин до поздней логарифмической фазы роста. Культивирование в ферментере проводят на LB среде с ампициллином (100 мкг/мл) при температуре 32°С, без рН статирования. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне 40 (±10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 80 до 190 об/мин и подачи воздуха от 10 до 14 л/мин.

Ферментацию заканчивают при переходе культуры в стационарную фазу роста, что соответствует значениям оптической плотности 3,0-3,5 о.е. ( =560 нм).

Содержание рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора определяют двумя способами.

1. По отношению к суммарному клеточному белку.

Рекомбинантный ГКСФ составляет не менее 30% от суммарного белка клетки.

2. По выходу рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Выход рч-ГКСФ составляет не менее 25 мг из 3 г биомассы, полученной с 1 л культуральной жидкости (КЖ).

Пример 7. Выделение и характеризация рекомбинантного полипептида колониестимулирующего фактора человека

Выделение и очистку рекомбинантного ГКСФ проводят по схеме, описанной ранее [18].

Выделенный рекомбинантный полипептид характеризуют двумя способами: по определению N-концевой аминокислотной последовательности и по специфической биологической активности рч-ГКСФ in vivo.

1. N-концевую аминокислотную последовательность определяют на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477А) фирмы Applied Biosystems (США). Идентификация ФТГ-аминокислот проводилась на анализаторе 120А РТН Analyzer фирмы Applied Biosystems (США). Препарат рекомбинантного ГКСФ имеет следующую структуру N-конца молекулы: Met+Thr ProLeuGly..., т.е. соответствует структуре N-конца природного ГКСФ человека с дополнительным метиониновьм остатком, не влияющим на его биологические свойства [7, 10].

2. Специфическую биологическую активность рч-ГКСФ определяют in vivo на мышах линии CBA/CaLac, которым через 24 часа после инъекции цитостатика вводят подкожно препарат субстанции рч-ГКСФ в дозе 125 мкг/кг, ежедневно в течение четырех дней.

Гемостимулирующая (гранулоцитопоэзстимулирующая) активность рч-ГКСФ составляла 840-1000% относительно контроля.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить рекомбинантный полипептид со структурой и свойствами, идентичными структуре и свойствам природного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека; биосинтез полипептида конститутивен и при этом уровень его синтеза составляет не менее 25% от суммарного клеточного белка за счет того, что ген ГКСФ находится под контролем сильного промотора A3 из ранней области бактериофага Т7 в составе высококопийной плазмиды, а трансляция белка увеличивается за счет синтетического усилителя трансляции. Все это при подобранных условиях культивирования позволяет значительно повысить технологичность и экономичность процесса получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека при одновременном увеличении выхода целевого продукта в 8 раз по сравнению с прототипом.

Источники информации

1. Kashyap S.K., Korobko V.G.// Current Science. 1994. V.67. P.995-1001.

2. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Yamazaki T.// EMBO J. 1986. V.5. P. 575-581.

3. Nagata S.//Bioassays. 1992. V.10. P.113-117.

4. Tahakashi К., Taniguchi S., et al // Acta haematol. 1991. V.86. P.95-98.

5. Kobayashi Yu., Okabe Т., Urabj A., et al // Jap. J. Cancer Res. 1987. V.78. Р 15-18.

6. Патент США №4833127, кл. А61К 37/02, 1989.

7. Европейский патент №215126, кл. С12N 15/00, 1987.

8. Европейский патент №220520, кл. С12N 15/00, 1987.

9. Oheda M., Hasegawa M., Hattori К., Kuboniwa H., Kojima Т., Orita Т., Tomonou К., Yamazaki Т., Ochi N.// J. Biol. Chem. 1990. V.265(20). P.11432-11435.

10. Souza L.M., Boone T.C., Gabrilove J., Lai P.H., Zsebo K.M., Mudrok D.C., Chazin V.R., Bruszewski J., Kenneth H.L., Chen K.K., Barendt J., Platzer E., Moore M.A.S., Mertelsmann R., Welte K. // Science. 1986. V.232(4746). P.61-65.

11. Коробко В.Г., Шингарова Л.П., Петровская Л.Е., Петренко Л.А., Пустошилова Н.М.// Патент РФ 2113483 С1, 1996.

12. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г.// Биоорган, химия. 1996. Т.22(4). С.243-251.

13. Шингарова Л.Н., Кашьяп С.К., Петровская Л.Е., Петренко Л.А., Пустошилова Н.М., Синичкина С.А., Коробко В.Г. // Биотехнология. 1998. Т.6. С.24-35.

14. Паспорт штамма микроорганизма Escherichia coli SGK25. Номер ВКПМ В-8686.

15. Trisler P., Gottesman S. // J. Bacteriol. 1984. V.160(1). Р.184-191.

16. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis Т. // Molecular Cloning. A Laboratory manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989.

17. CycleReader DNA Sequencing Kit #K1711, Fermentas. Sequencing Protocol.

18. Роспатент №2004126196/15(029366) от 30.08.2004.