плазмида 40nagal, определяющая синтез -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения

Формула изобретения

1. Плазмида 40NaGal размером 7489 пар оснований (п.о.), определяющая синтез рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="/images/img_patents/2/2525/2525623/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы морской бактерии Arenibacter latericius 426^T, ВКМ В-2137Д ( -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="/images/img_patents/2/2525/2525623/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal), и характеризующаяся наличием следующих фрагментов: NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмента ДНК размером 1299 п.о., содержащего химерный ген, состоящий из структурной части гена -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="/images/img_patents/2/2525/2525623/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, адаптированной по N-концу для экспрессии в клетках E.coli, и нуклеотидов, кодирующих специфические последовательности для протеазы TEV (SEQ ID N 1).

2. Штамм E.coli Rosetta(DE3), трансформированный плазмидой 40NaGal по п.1, - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной N-ацетилгалактозаминидазы -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="/images/img_patents/2/2525/2525623/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal.

3. Способ получения рекомбинантной N-ацетилгалактозаминидазы -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="/images/img_patents/2/2525/2525623/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, характеризующийся тем, что штамм-продуцент по п.2 инкубируют в жидкой питательной среде LB в течение 12 ч при 16°C, затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буфере, далее экстракт центрифугируют, затем надосадочную жидкость помещают на колонку с металлоафинной смолой, далее элюируют белок, затем активные фракции концентрируют на ионообменной смоле, инкубируют протеазой TEV, далее выделяют целевой продукт гель-фильтрацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается способа получения рекомбинантного белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы морской бактерии Arenibacter latericius ( -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal), а также плазмиды для его получения и рекомбинантного штамма Escherichia coli. Изобретение позволяет производить высокоактивную рекомбинантную -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазу для использования в трансфузионной и клинической медицине, генной инженерии и молекулярной биологии.

Фермент -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазу (ЕС 3.2.1.49.) используют в качестве инструмента для исследования структуры сложных гликоконъюгатов и синтеза новых олигосахаридов с N-ацетамидо-2-дезокси- -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактопиранозой (NAcGal), связанных -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -O-гликозидной связью, которую трудно синтезировать химическими методами [1]. -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидаза катализирует гидролитическое отщепление N-ацетамидо-2-дезокси- -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидных остатков от невосстанавливающих концов различных сложных углеводов и гликоконъюгатов. Его физиологическими субстратами являются гликолипиды, гликопептиды и гликопротеины, содержащие структуры с O-гликозидным кором, олигосахариды и антигены иммунодоминант эритроцитов группы крови A.

Позднее интерес к ферменту возник в связи с возможностью использования его в биотехнологии создания универсальной крови группы O из донорской крови группы A для решения проблем трансфузионной медицины. Известно, что кровь группы А более широко распространена среди доноров, чем группы B и AB, поэтому интерес для медицины представляют ферменты, проявляющие специфичность к антигену группы A. Проблема заключается в том, что кровь группы A состоит из двух основных подгрупп: A1 и A2 [2]. Эритроциты группы A1 содержат на поверхности примерно в 5 раз больше А антигенов, чем эритроциты подгруппы A2. Кроме того, красные клетки подгруппы A1 имеют гликолипиды с иммунными детерминантами, составленными из повторяющейся A структуры.

На сегодняшний день -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы были выделены и всесторонне охарактеризованы лишь в некоторых наземных моллюсках, грибах и некоторых патогенных бактериях наземного происхождения Clostridium perfringens, Ruminococcus torques, а также успешно выделены из печени человека, мыши и цыпленка [3-7].

Однако конверсия эритроцитов A в эритроциты группы O была достигнута лишь с помощью -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидаз из печени цыпленка и из патогенных для человека бактерий Clostridium perfringens, причем конверсия возможна только для эритроцитов крови подгруппы A2 при pH 5,5, т.е. в условиях, травмирующих красные клетки [3, 4]. Такая специфичность не является достаточным условием для полной конверсии A-эритроцитов, поэтому эритроциты, обработанные этими ферментами, остаются не пригодными для переливания реципиентам. К тому же ферменты из вышеназванных источников имеют многомерную структуру с молекулярной массой, достигающей 500 кДа, что затрудняет их использование в молекулярной биологии и биотехнологии.

В 2007 году появилась публикация иностранных коллег, в которой сообщалось о ферменте из патогенного штамма бактерии Elisabethkingia meningosepticum, с помощью которого при pH 7,0 успешно конвертировали как эритроциты A2, так и A1 в эритроциты группы О [7]. Фермент оказался NAD ⁺-зависимым, реализующим механизм гидролиза, неродственный механизму действия классических гликозидгидролаз семейств GH 27 и 36. Данный фермент не имел аналогов среди известных -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидаз и -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидаз и открыл новое 109 семейство гликозидгидролаз в классификации, основанной на общих чертах аминокислотных последовательностей.

Нами была обнаружена -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидаза 109 семейства гликозидгидролаз из непатогенной аэробной морской бактерии Arenibacter latericius 426^T, ВКМ В-2137Д, способная инактивировать серологическую активность эритроцитов А обеих подгрупп [8]. Фермент имеет нейтральный pH оптимум действия (7,0-7,3), комфортный для жизнеспособности эритроцитов, и проявляет максимальную активность в присутствии 0,4 М NaCl и 1 мМ Mg²⁺.

Разработка эффективного способа получения универсальных по групповым свойствам эритроцитов для неотложной трансфузиологической помощи пострадавшим продолжает быть весьма актуальной. Клинические испытания конвертированных эритроцитов на добровольцах продемонстрировали, что ферментативное преобразование эритроцитов человека выполнимо, что конвертированные ферментом эритроциты группы О жизнеспособны и могут функционировать так же, как необработанные эритроциты в соответствии с правилами, принятыми в клинической медицине переливания.

Однако необходимость больших количеств фермента в этих исследованиях, даже с современной эффективной рекомбинантной технологией экспрессии, составляет экономическое препятствие для использования их в медицине переливания, так как на одну упаковку (200 мл) эритроцитов требуется 1-2 г фермента. Кроме того, огромное значение имеет pH-оптимум фермента и узкая субстратная специфичность.

Известен способ получения природного белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы из дикого штамма-продуцента Flavobacterium sp. 426^T, ВКМ В-2137Д, с удельной активностью 22 ед./мг белка [9]. Основными недостатками этого способа получения являются высокие технологические затраты при хранении и выращивании дикого штамма и относительно низкая удельная активность.

Недавно была установлена нуклеотидная последовательность зрелого белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы Arenibacter latericius 426 ^T, ВКМ В-2137Д (код GenBank HQ 108058). Однако способы получения активного рекомбинантного аналога -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы Arenibacter latericius 426 ^T ( -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal) пока еще не известны. Получение растворимой высокоактивной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal в гетерологичных бактериальных системах сопряжено с рядом трудностей, так как функциональный белок является психрофильным и состоит из двух субъединиц.

Задача изобретения - конструирование рекомбинантного штамма Е. coli, плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, и разработка способа его получения.

Поставленная задача решена созданием генетической конструкции в виде рекомбинантной плазмиды 40NaGal и штамма Е.coli Rosetta(DE3)/40NaGal, обеспечивающих индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом активной растворимой рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal в периплазму клетки кишечной палочки.

Технический результат заявленного изобретения - получение активной рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal с высоким выходом и уровнем очистки.

Плазмида 40NaGal имеет 7489 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и последовательности фрагмента ДНК размером 1299 п.о., адаптированной по N-концу для экспрессии в клетках E.coli, содержащего химерный ген, состоящий из структурной части гена -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal и двух специфических последовательностей для протеазы TEV с целью удаления дополнительных аминокислотных остатков с N- и C-концевой части молекулы рекомбинантного белка при необходимости.

На фигуре представлена физическая карта плазмиды 40NaGal и область плазмиды, ответственная за экспрессию рекомбинантного белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal.

Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды 40NaGal, фланкированная сайтами NcoI и SaiI, содержит последовательность структурного гена -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal с адаптированным N-концом для экпрессии в E.coli, соответствующую открытой рамке считывания для белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, и две последовательности с N- и C-конца, специфичные для расщепления протеазой TEV (SEQ ID N 1).

Штамм E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal получен трансформацией клеток E.coli Rosetta(DE3) (Novagen) плазмидой 40NaGal с использованием традиционной генно-инженерной технологии [10].

Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма образуют крупные круглые с ровными краями выпуклые колонии до 5 мм в диаметре, поверхность колоний гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается. Грамотрицательны, спор не образуют, капсулы не имеют. Колонии хорошо растут на простых питательных средах (LB). При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки.

Штамм E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal видотипичен по своим биохимическим свойствам. Штамм не обладает желатиназной активностью, не ферментирует лизин; расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу до кислоты и газа. Имеет мутацию в гене lac, обеспечивающую контроль уровня экспрессии, а также трансляцию редких кодонов. Оптимальной для роста является температура 37°C, а для продукции психрофильной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal - 16°C.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки штамма характеризуются устойчивостью к хлорамфениколу (34 мкг/мл) и канамицину (25 мкг/мл).

Патогенность и токсичность.

Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.

Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (30%) при -20°C.

Заявляемый способ получения рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal заключается в культивировании клеток штамма E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal в питательной среде LB, содержащей канамицин, отделении биомассы от культуральной жидкости, разрушении микробных клеток с последующим выделением целевого продукта водной экстракцией и хроматографической очисткой ферментного препарата. Очистку целевого продукта осуществляют хроматографией на металлоафинной смоле и гель-фильтрацией.

Выход рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal в результате применения описанного способа составляет не менее 10 мг рекомбинантного белка с 1 л культуры с удельной активностью 60 ед./мг по п-нитрофенил-N-ацетил-галактозаминиду, что превышает удельную активность природного аналога из морской бактерии Arenibacter latericius как минимум в 3 раза и рекомбинантного аналога из патогенной бактерии Elizabethkingia meningoseptica - в 5 раз [7].

Рекомбинантный белок -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal является гомодимером с молекулярной массой 164 кДа или 96 кДа после удаления аминокислотных довесков протеазой TEV, имеет оптимальную температуру реакции 20-37°C, стабилен до 50°C, оптимум pH 7,0-7,2, и его активность не зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов в инкубационной среде. Аминокислотные довески не влияют принципиально на ферментативные свойства белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, поэтому стадией их удаления при очистке рекомбинантного белка можно пренебречь.

Рекомбинантная -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal может быть успешно использована для удаления групповой специфичности эритроцитов человека группы крови A(II) и получения универсальной донорской крови группы O(I), а также в структурном анализе сложных гликопротеинов и протеогликанов и в синтезе уникальных гликозидов для целей биотехнологии и медицины.

Существенными преимуществами заявляемого способа являются:

- использование штамма-продуцента E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal, что позволяет получать при биосинтезе большое количество полноразмерной и высокоактивной рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal;

- использование двухстадийной хроматографической очистки фермента, что позволяет получить чистый рекомбинантный белок за короткое время и с малыми потерями.

Способ получения функционально активного белка на основе использования гена, кодирующего -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазу морской бактерии -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование плазмиды 40NaGal.

Рекомбинантную плазмиду 40NaGal, содержащую структурный ген -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, кодирующий зрелый белок -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазу A. latericius, и последовательности, специфичные для расщепления протеазы TEV, фланкированные сайтами рестрикции Ncol и Sail, конструируют на основе коммерческой плазмиды рЕТ-40b(+) (Novagen).

Фрагмент ДНК, содержащий полноразмерный ген -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, получают при помощи полимеразной цепной реакции с использованием геномной ДНК штамма морской бактерии Arenibacter latericius 426^T, ВКМ В-2137Д, в качестве матрицы и пары праймеров Nac40TEV_NcoFn Nac40TEV_SalIR, где Nac40TEV_NcoF - праймер, специфичный по отношению к N-концевой последовательности -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, включающий последовательность для протеазы TEV, Nac40TEV_SalIR - обратный праймер, специфичный по отношению к C-концевой последовательности -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, включающий последовательность для протеазы TEV:

Nac40TEV_NcoF: 5'-ttaaccatgGAAAATCTTTATTTTCAGGGTGGGGCTAAGTACATGGGCGGTTTTTCTGCT-3'

Nac40TEV_SalIR: 5'-ttaagtcgacACCCTGAAAATAAAGATTTTCGCTTACAATATCTAATGGTGCAGTGGT-3'

Данную реакцию проводят в следующих условиях: 10х Encyclo буфер, 50х смесь полимераз Dream Taq (Ферментас), 50х смесь dNTP (10 mM каждого), смесь праймеров (5 µM каждого), 50 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 95°C - 2 мин, 35 циклов ПЦР (15 сек - 95°C, 1 мин - 72°C) и инкубация 10 мин при 72°C. После амплификации фрагмент ДНК очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. Фрагмент (1 мкг) обрабатывают рестриктазами NcoI и SalI в оптимальном буфере (Fermentas) в течение 3 час, затем ферменты удаляют из реакционной среды по стандартной методике фенолом (1:1). В водную фракцию, содержащую фрагмент, добавляют 1/10 объема 0,3 М ацетата натрия, pH 5,2, и 1/2 объема изопропанолового спирта и оставляют при -20°C в течение 30 мин. Затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин, осадок промывают 75% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Осадок растворяют в 20 мкл деионизованной воды.

5 мкг плазмидной ДНК рЕТ-40b(+) обрабатывают рестриктазами NcoI и SalI в соответствии с методикой, описанной выше, и из полученного гидролизата выделяют векторную часть плазмиды в 1% геле легкоплавкой агарозы.

Полученный фрагмент и векторную часть плазмиды pET-40b(+) сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli Rosetta(DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 25 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°C клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают ДНК, содержащую необходимую последовательность, представляющую собой плазмиду 40NaGal размером 7489 п.о.

Пример 2. Получение штамма E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal, трансформированного плазмидой 40NaGal - продуцента химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal.

Штамм-продуцент получают путем трансформации клеток штамма E.coli Rosetta(DE3) рекомбинантной плазмидой 40NaGal. Ночную культуру (0,5 мл LB) штамма-продуцента рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal выращивают в литровой колбе в жидкой среде LB, содержащей на литр 10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 10 г NaCl, 25 мг/мл канамицина, pH 7,7, на шейкере при 200 об/мин при температуре 37°C в течение 2 час до оптической плотности 0,6-0,8 (OD₆₀₀), затем добавляют индуктор экспрессии IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ и инкубируют далее при 16°C в течение 12 час.

Для определения продуктивности штамма клеточные водные экстракты анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в растворимой клеточной фракции составляет не менее 30% от всех белков этой фракции.

Пример 3. Выделение и характеристика рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal.

Штамм-продуцент рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal - E.coli Rosetta(DE3)/40Gal, инкубируют в литровой колбе в жидкой среде LB, содержащей на литр 10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 10 г NaCl, 0,2 мМ IPTG, 25 мг/мл канамицина, pH 7,7, на шейкере при 250 об/мин в течение 12 час при 16°C. Бактериальные клетки осаждают на проточной центрифуге при 5000 об/мин в течение 10 мин. Суспензию клеток дезинтегрируют в 100 мл буфера А (0,01 М NaH₂PO₄, pH 7,7, 0.01%) NaN₃) в течение 5×30 сек, охлаждая во льду. Затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость собирают и помещают на колонку с металлоафинной смолой (Qiagen), предварительно уравновешенную буфером А. Элюцию белка проводят буфером А, содержащим 50 мМ ЭДТА. Активные фракции собирают и концентрируют до 3 мл в буфере А на ионообменной смоле ДЕАЕ-целлюлоза (Watman) и инкубируют с протеазой TEV (Invitrogen) при 21°C в течение 12 час. Раствор белка наносят на колонку для гель-фильтрации с Sephacryl S-200 HR (Sigma). Выход рекомбинантного белка составляет около 10 мг с 1 л культуры.

Полученный рекомбинантный полипептид определяют по первым 10 аминокислотам на автоматическом секвенаторе. Проведенное секвенирование препарата рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal, выделенной из клеток штамма Е.coli Rosetta(DE3)/40NaGal, показало, что N-концевая аминокислотная последовательность (GAKYMGGFSAPKLDT) соответствует первым 15 аминокислотам полноразмерного природного белка -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы морской бактерии Arenibacter latericius 426^T, ВКМ В-2137Д, - аналога -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal.

Активность -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы определяют по расщеплению п-нитрофенил-альфа-N-ацетилгалактозаминида. Реакционная смесь в объеме 400 мкл содержит 10 мМ NaH₂ PO₄ (pH 7,2), 3 мМ субстрата и фермент. После 20 мин инкубации при 20°C реакцию останавливают добавлением 0,6 мл 1 М Na₂CO₃. Количество образовавшегося в процессе ферментативной реакции продукта определяют спектрофотометрически при 400 нм. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего освобождение 1 мкМ субстрата в течение 1 мин инкубации. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяют по методу Брэдфорда.

Полученные данные по физико-химическим характеристикам и ферментативной активности продукта экспрессии искусственного химерного гена -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal в клетках штамма E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal свидетельствуют о соответствии исследуемого полипептида его природному аналогу.

Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать активную рекомбинантную -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазу -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.

Заявленное изобретение позволяет:

- с помощью использования штамма-продуцента E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal получать активную рекомбинантную a-N-ацетилгалактозаминидазу -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal;

- использование штамма-продуцента E.coli Rosetta(DE3)/40NaGal позволяет получать при биосинтезе большое количество полноразмерной рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-ацетилгалактозаминидазы -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -AlNaGal;

- использование металлоафинной и гель-фильтрационной хроматографии при очистке фермента из водного экстракта клеток штамма-продуцента позволяет получать фермент с чистотой более 98%.

Литература

1. Naundorf A., Ajisaka K. Purification of -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-acetyl-galactosaminidase from Aspergillus niger and its use in the synthesis of GalNAc- -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -(1 -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> O)-serine // Enz. Microbial. Technol. - 1999. - Vol.25, N 6. - P.483-488.

2. Clausen H., Hakomori S.-i. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution // Vox Sang. - 1989. - Vol.56, N 1. - P.1-20.

3. Hata J., Dhar M., Mitra M., Harmata M., Haibach P., Sun P., Smith D. Purification and characterization of N-acetyl- -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-galactosaminidase from Gallus domesticus II Biochem. Int. - 1992. - Vol.28, N 1. - P.77-86.

4. Hsieh H.Y., Mitra M., Wells D.C., Smith D. Purification and characterization of -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-acetylgalactosaminidase from Clostridium perfringens IIIUBMB Life. - 2000. - Vol.50, N 2. - P.91-97.

5. Hoskins L.C., Boulding E.T., Larson G. Purification and characterization of blood group A-degrading isoforms of -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-acetylgalactosaminidase from Ruminococcus torques strain IX-70 // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol.272, N 12. - P.7932-7939.

6. Kadowaki S., Ueda Т., Yamamoto K., Kumagai H., Tochikura T. Isolation and characterization of a blood group A substance-degrading -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-acetylgalactosaminidase from an Acremonium sp. // Agric. Biol. Chem. - 1989. - Vol.53, N 1. - P.111-120.

7. ChengYu Y.U., Hua X.U., LiSheng W., JianGeng Z., YangPei Z. Human RBCs blood group conversion from A to О using a novel -N-acetylgalactosaminidase of high specific activity // Chinese Science Bulletin. - 2008. - Vol.53, N 13. - P.2008-2016.

8. Бакунина И.Ю., Кульман P.A., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.Д., Недашковская О.И., Михайлов В.В., Елякова Л.А. -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения, патент № 2525682" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -N-Ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426Т, устраняющая групповую специфичность A-эритроцитов // Биохимия. - 2002.- Т.67, N 6. - С.830-837.

9. RU 2141526 С1, 20.11.1999.

10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989.