набор таблетированной живой рекомбинантной оральной бивакцины против натуральной оспы и гепатита b и способ вакцинации с использованием указанного набора

Формула изобретения

1. Набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения, включающий две таблетки, содержащие стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса ВОВ с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет (0,5-7,0)·10⁶ оспообразующих единиц (ООЕ) - минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения базового иммунного ответа в организме, а иммунизирующая доза второй составляет (1,0-5,0)·10⁷ ООЕ, - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины, причем вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ №2131 на куриных эмбрионах или перевиваемой культуре клеток животных.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что первая и вторая таблетки набора имеют разный цвет.

3. Способ вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающий оральный прием таблеток бивакцины, отличающийся тем, что для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1 и 2 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают через 7-14 дней после приема первой таблетки с минимальной дозой бивакцины.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики натуральной оспы и вирусного гепатита В.

Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы и способ вакцинации, включающий накожное применение указанной вакцины (патент РФ №2073524, МПК А61К 39/29; С12N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантного вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 с титром (3-5)×10⁸ оспообразующих единиц (ООЕ) на мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В, и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131
с указанным титром	90-95
Пептон	5-10

Недостатками известной вакцины и способа вакцинации является: низкая производительность при накожной вакцинации данным препаратом, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза «шприцевыми инфекциями» иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификационной вакциной также возможно выделение ВОВ в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.

Наиболее близким аналогом - прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе ВОВ для орального применения, содержащая в одной таблетке: 1. лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 6,5-8,0 lg ООЕ на таблетку, 2. лактозу, 3. сахарозу, 4. стеарат кальция, 5. ванилин (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Наиболее близким прототипом способа вакцинации является оральный способ однократного введения таблеток бивакцины. Иммунизирующая доза каждой таблетки одинакова (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Известная вакцина и способы ее применения имеют 2 основных недостатка: при однократном применении таблеток с малой иммунизирующей дозой не достигается достаточный уровень иммунного ответа, а при однократном применении таблеток с большой иммунизирующей дозой возникают серьезные воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, хотя при этом достигается приемлемый уровень сероконверсии к ВОВ: иммунная прослойка среди привитых достигает 90%. Кроме того, однократное применение этой вакцины даже в большой дозе вызывает формирование лишь кратковременного иммунитета к ВОВ (в течение 1-3 месяцев).

Техническим результатом предлагаемых изобретений является создание такого набора бивакцины против натуральной оспы и гепатита В и способа вакцинации с использованием указанного набора, которые обеспечили бы достаточный иммунный ответ в течение длительного времени ( 6 месяцев) без проявления побочного действия вакцины.

Указанный технический результат достигается тем, что набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения согласно изобретению включает две таблетки, каждая из которых содержит стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего белки preS2-S и HBs вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения слабого иммунного ответа в организме при незначительной реактогенности, а иммунизирующая доза второй - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает выраженный и длительно сохраняющийся иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины. Иммунизирующая доза первой таблетки составляет (0,5-7,0)×10 ⁶ ООЕ, а иммунизирующая доза второй таблетки - (1,0-5,0)×10 ⁷ ООЕ. Вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 на куриных эмбрионах (КЭ) или перевиваемой культуре клеток животных.

Причем первая и вторая таблетки вакцинного набора имеют разный цвет на поверхности и внутри.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающем оральный прием таблеток бивакцины, согласно изобретению для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1-3 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа (через 7-14 дней) после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой бивакцины.

Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С12N 15/00, опубл. 1994 г.).

Набор таблеток живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения содержит две плоские таблетки №1 и №2, расположенные в блистерной упаковке. Таблетки №1 и №2 имеют разный цвет снаружи и внутри, например желтый и серо-коричневый (для лучшего их различия). Иммунизирующая доза таблетки №1 составляет (0,5-7,0)×10⁶ ООЕ, а иммунизирующая доза таблетки №2 - (1,0-5,0)×10⁷ ООЕ. Таблетированная форма распадается в ротовой полости под действием влаги и температуры организма.

Пример 1. Способ получения живого вирусного материала

А. Получение вирусного материала на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов

Способ живого рекомбинантного вирусного материала включает в себя культивирование рекомбинантного ВОВ на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) 12-13-суточных КЭ с последующим получением вируссодержащего материала в виде гомогената ХАО с 20% лактозы, который подвергают лиофильному высушиванию. Сухой вируссодержащий биопрепарат измельчают, смешивают с компонентами наполнителя и стабилизатора для приготовления таблеточной массы. Из последней путем прессования получают таблетки вакцины.

Б. Получение вирусного материала на перевиваемых клетках животных

Вначале была проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА) и наличие встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-подуцентах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержит примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/10⁶ клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.

Для наработки вируссодержащего материала для последующего приготовления культуральной рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В путем роллерного культивирования на бутылях объемом, например, 2 литра выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на ростовой питательной среде ДМЕМ с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота (КРС) или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Использованную среду сливают и в роллерные бутыли заливают поддерживающую питательную среду ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой КРС или 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют штаммом рекомбинантного ВОВ (ГКВ №2131 (b7,5S2-S) в дозе заражения - 1,0-100,0 БОЕ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборотов в минуту до 50-70% цитопатического эффекта (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Данные о накоплении вирусного материала в культурах клеток приведены в таблице 1.

Таблица 1 Данные о накоплении штамма b7,5S2-S вируса осповакцины в культурах клеток 4647 и Vero при роллерном культивировании
Номер эксперимента	Концентрация вируса в lg БОЕ/мл в культурах клеток (I95 =±0,5 lg БОЕ/мл)
	4647	Vero
1	7,0	7,0
2	7,5	7,3
3	7,5	7,5
4	7,3	6,8*
Примечание. (*) - низкая плотность клеточного монослоя перед его инфицированием.

Далее поддерживающую питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), то есть в 10 раз меньшим. В качестве буферного раствора используют 0,01 М Tris для поддержания pH 8,8-9,0. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,01 М Tris с pH 8,8-9,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 7,0 lg БОЕ/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем.

Пример 2. Технология приготовления таблеток и их состав

Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным, исходя из активности лиофильно высушенных материалов, находилась в расчетном диапазоне.

Ниже приведены примеры (а-г) составов таблеток №1 и №2 набора живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В орального применения (в ротовой полости).

а) Таблетка №1 (желтого цвета)

Лиофилизированный материал с
рекомбинантным штаммом ВОВ с
активностью (7,6×106 ООЕ) на таблетку	2,04
пептон	0,12
желатоза	0,06
сахароза	10,10
буфер	0,001
стеарат кальция	2,0
краситель Е 104	0,02
лактоза	остальное до 100%

б) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным
штаммом ВОВ с активностью (3,9×107 ООЕ) на
таблетку	7,20
пептон	0,38
желатоза	0,19
сахароза	10,29
мочевина	0,01
буфер	0,003
стеарат кальция	1,99
ванилин	0,20
лактоза	остальное до 100%

в) Таблетка №1 (желтого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным
штаммом ВОВ с активностью (1,6×106 ООЕ) на
таблетку	1,04
пептон	1,20
желатоза	0,60
сахароза	10,85
буфер	0,009
стеарат кальция	1,97
краситель Е 104	0,02
лактоза	остальное до 100%

г) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным
штаммом ВОВ с активностью (1,5×107 ООЕ) на
таблетку	10,13
пептон	3,80
желатоза	1,90
сахароза	11,55
буфер	0,027
стеарат кальция	1,94
ванилин	0,17
лактоза	остальное до 100%

Пример 3. Способ вакцинации с использованием заявляемого набора

При оральной иммунизации таблетку нужно разжевать и держать во рту до полного растворения не менее 2-3 минут, после чего в течение 30 минут не рекомендуется пить, курить и принимать пищу. Запрещается проглатывать таблетку. Процедура иммунизации проводится под контролем вакцинатора. Прием первой таблетки из заявляемого набора вызывает формирование минимального защитного уровня специфического иммунитета на ВОВ и маркер гепатита В. Через 7-14 дней (до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой) в организм орально вводят вторую таблетку из заявляемого набора с максимальной дозой бивакцины, после чего формируется устойчивый иммунитет к вирусам ВОВ и гепатита В.

Пример 4. Данные экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации, а также отдельно таблеток №1 и №2 с целью индукции гуморального иммунитета к вирусу натуральной оспы

Вакцина. Использовали набор из двух таблеток бивакцины оспы и гепатита В с иммунизирующей дозой (0,5-7,0)×10⁶ ООЕ (таблетка №1) и (1,0-5,0)×10⁷ ООЕ (таблетка №2), приготовленные в соответствии с ранее описанными примерами 1 и 2 и отдельно таблетка №1 и таблетка №2.

Пробы. От каждого добровольца ежедневно в течение 14 суток производили отбор слюны и мочи и один раз в неделю в течение 4 недель отбирали пробы плазмы и сыворотки для вирусологических и серологических исследований.

Серологические исследования. Сыворотки крови людей исследовали с целью определения уровня антител к вирусу ВОВ (штамм ЛИВП), HBs Ag. Титры антител к ВОВ оценивали в реакции нейтрализации (РН) по общепринятой методике [Справочник, 1967]. При этом за титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, которое вызывало снижение количества ООЕ на ХАО более чем в два раза по сравнению с контролем. За рабочее разведение вируса принимали такое его разведение, которое при подсчете ООЕ на ХАО давало образование от 40 до 60 оспин. Аналогично оценивали титры антител к ВОВ в РН на культуре клеток 4647 по методу бляшек, который давал сходные результаты с таковыми, полученными с использованием КЭ. Общепринято, что защитные титры антител к ВОВ в сыворотке крови человека составляют 1:25.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин И.В., Воробьев А.А., 1962].

Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.

Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).

На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.

По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 8 групп добровольцев для проведения клинического испытания бивакцины «Ревакс-ВТ».

В группу 1 вошли 6 волонтеров, возраст - от 30 до 40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины "Ревакс-ВТ".

В группу 2 вошли 10 волонтеров, средний возраст в группе - от 22 до 24 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины "Ревакс-ВТ".

Группа 3 представлена 8 волонтерами, средний возраст в группе - от 18 до 19 лет, не имеющими на плече оспенных знаков. Они были иммунизированы в условиях первичной вакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины.

В группу 4 вошли 12 добровольцев, средний возраст - от 18 до 20 лет, не имеющих на плече оспенных знаков. Добровольцы были иммунизированы в условиях первичной вакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины.

В группу 5 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 34-40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 1 неделю большой дозой (таблетка №2).

В группу 6 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 31-38 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 2 недели большой дозой (таблетка №2).

В группу 7 вошли 11 волонтеров, возраст в группе: 28-34 года, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ"(таблетка №1) и через 1 месяц большой дозой (таблетка №2).

В группу 8 вошли 4 волонтера, возраст в группе: 32-35 лет, имеющие оспенные знаки на плече. Они были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 3-6 месяцев большой дозой (таблетка №2).

Обобщенные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 2-4.

Анализ данных, приведенных в таблице 2, показал, что однократная иммунизация добровольцев малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) не позволяет создать нужного уровня сероконверсии к ВОВ. Однократная же иммунизация большой дозой бивакцины (таблетка №2), создавая подходящий уровень сероконверсии к ВОВ - до 90%, дает сильные проявления реактогенности - до 50% процентов среди привитых волонтеров.

Вакцинация волонтеров, ранее привитых против оспы, сначала малой дозой бивакцины (таблетка №1) и через 7-14 дней большой дозой (таблетка №2) позволяет создать уровень сероконверсии к ВОВ до 100% при минимальных проявлениях реактогенности (таблица 3). Другим важным преимуществом предлагаемого нами набора и схемы вакцинации является продолжительность иммунного ответа к ВОВ: если при однократной вакцинации иммунная прослойка среди привитых волонтеров через 3 месяца уменьшается до 20%, то при двукратной вакцинации через 6 месяцев иммунная прослойка составляет 80% (таблица 4).

Нам не удалось достичь приемлемого уровня сероконверсии к HBsAg вируса гепатита В у привитых волонтеров. Однако дополнительная двукратная иммунизация коммерческой вакциной против гепатита В позволяет создать защитные уровни антител к HBsAg у людей, привитых по предложенной нами схеме вакцинации с применением предлагаемого набора, так как двукратная иммунизация людей с помощью данного набора уже создает базовый иммунитет к HBsAg (таблица 3).

Таблица 2 Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при однократной вакцинации малой дозой (таблетка №1) или большой (таблетка №2) добровольцев групп 1 и 2, ранее привитых против оспы, и групп 3 и 4, ранее не привитых против оспы
Оцениваемый показатель		Группа добровольцев
		1	2	3	4
Количество испытуемых		16	10	8	12
Иммунизирующая доза		таблетка №1	таблетка №2	таблетка №1	таблетка №2
1Местные реакции в максимальном варианте:	число	2	3	2	6
	выраженность	2Слабая	4Высокая	4Высокая	4Высокая
1Общие реакции в максимальном варианте:	число	3	4	2	6
	выраженность	3Слабая	5Средняя	5Средняя	5Средняя
6Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации:	слюна	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
	плазма	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
	моча	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
Процент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус (через 1 месяц после вакцинации):	осповакцины	31	90	63	83
Примечания: 1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации; 2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см; 3 - повышение температуры тела до 37,2°С; 4 - гнойная ангина, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 1,5 см; 5 - слабость, повышение температуры тела до 39,0°С; 6 - проводили исследование наличия ВОВ в пробах слюны, плазмы и мочи, взятых от добровольцев ежедневно в период с 1-х по 14-е сутки после вакцинации;

Таблица 3 Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при двукратной вакцинации добровольцев, ранее привитых против оспы малой дозой (таблетка №1) и затем большой (таблетка №2)
Оцениваемый показатель			Группа добровольцев
			5	6	7	8
Количество испытуемых			10	10	11	4
Иммунизирующая доза			таблетка №1 и через 1 неделю таблетка №2	таблетка №1 и через 2 недели таблетка №2	таблетка №1 и через 1 месяц таблетка №2	таблетка №1 и через 3-6 месяцев таблетка №2
Введение малой дозы (первичная иммунизация)	Местные реакции в максимальном варианте1	число	2	2	1	0
		выраженность	слабая2	слабая2	слабая 2	слабая2
	Общие реакции в максимальном варианте1	число	2	1	2	1
		выраженность	слабая3	слабая3	слабая 3	слабая3
Введение большой дозы (вторичная иммунизация)	Местные реакции в максимальном варианте:	число	0	0	0	0
		Выраженность	-	-	-	-
	Общие реакции в максимальном варианте:	число	0	0	0	0
		выраженность
Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации:		слюна	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
		плазма	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
		моча	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
Процент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус:		осповакцины	100	90,0	55,6	50
Примечание: 1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации; 2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см; 3 - повышение температуры тела до 37,2°С.

Таблица 4 Сравнительные данные по динамике титров антител к вирусу осповакцины у добровольцев, орально привитых однократно малой дозой бивакцины (таблетка №1) или большой дозой (таблетка №2) и двукратно с интервалом 1-2 недели набором бивакцины
Номер добровольца	Титр противооспенных вируснейтрализующих антител через различные сроки наблюдения:
	0 суток	30 суток	90 суток	180 суток	270 суток
Однократная вакцинация бивакциной в малой (таблетка №1) или большой дозе (таблетка №2) добровольцев, ранее иммуннизированных и не иммуннизированных против оспы*
76	1:5	1:125	1:25	1:25
77	1:5	1:25	1:5	1:5
80	<1:5	>1:125	1:125	1:25
81	1:5	>1:25	1:5	1:5
31	1:5	1:125	1:5	<1:5
35	<1:5	>1:25	<1:5	<1:5
14	<1:5	1:25	<1:5	<1:5
15	<1:5	1:125	<1:5	<1:5
17	<1:5	1:125	1:5	1:5
82	<1:5	1:125	1:5	<1:5
Двукратная вакцинация набором бивакцины с интервалом в 1-2 недели*
1	1:5	1:125	1:125	1:125
2	1:5	1:5	1:25	1:5
3	<1:5	1:125	1:25	1:125
4	<1:5	>1:125	1:125	>1:125
5	1:5	1:25	1:25	1:25
6	1:5	1:25	1:25	1:125
7	<1:5	1:25	1:25	>1:125
8	<1:5	1:25	1:25	1:125
9	1:5	1:125	>1:125	1:5
10	<1:5	1:125	>1:125	<1:5
11	<1:5	1:125			>1:125
12	<1:5	1:125			1:125
13	<1:5	1:125			1:125
14	<1:5	1:125			1:125
Примечание: * - приведены данные по титрам антител к вирусу осповакцины только у добровольцев, наблюдавшихся в течение 6-9 месяцев.

Пример 5. Данные сравнительных экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации по индукции гуморального иммунитета к гепатиту В

Вакцины. В работе использовали две серии «Бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки (Ревакс-ВТ)» №10 и №11 с концентрацией ВВ 3,9×107 и 7,6×106 ООЕ/таблетку соответственно, приготовленные согласно проекту ЭПР в соответствии ранее описанного метода (Патент РФ №2076735, 1997), прошедшие контроль качества согласно требованиям проекта ФСП в ОБТК ВЦ НИИМ МО РФ, ГНЦ ВБ «Вектор» и аттестованные в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Для усиления иммунного ответа к HBsAg использовали коммерческую рекомбинантную дрожжевую жидкую вакцину против гепатита В «Комбиотех».

Пробы. От каждого добровольца один раз в месяц в течение 6 месяцев отбирали пробы плазмы и сыворотки серологических исследований.

Серологические исследования. Выявление антител к HBsAg, наличия HBsAg и антител к HBCor Ag в сыворотках крови людей регистрировали с помощью сертифицированных в МЗ России иммуноферментных тест-систем «Векто HBs Ag-антитела-стрип», с Ag «Рекоматгеп В-стрип» и «Векто HBCor-антитела-стрип» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область, п.Кольцове). Чувствительность последней тест-системы по ОСО ГИСК - 0,2 нг/мл. Общепринято, что защитные концентрации антител к HBsAg в сыворотках крови человека составляют 10 мМЕ/мл.

Обработка результатов испытаний. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин и Воробьев, 1962; Закс, 1976].

Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.

Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).

На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.

По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 2 группы добровольцев для проведения клинического испытания набора бивакцины «Ревакс-ВТ».

Группа 1 представлена 7 волонтерами (возраст от 22 до 44 лет). Эти добровольцы были двукратно иммунизированы рекомбинантной моновакциной «Комбиотех».

Группа 2 представлена 4 волонтерами (возраст от 37 до 45 лет), ранее вакцинированными против оспы и имеющими вакцинальные знаки. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации сначала рекомбинантной моновакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg OOE) и еще через 1 месяц очень дозой 7,6 lg OOE.

Полученные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из приведенных данных защитные титры антител к HBsAg отмечены у 40% добровольцев.

Из данных таблицы 6 видно, что защитные титры антител к ВВ - у 75,0% добровольцев, а защитные титры антител к HBsAg - у 100,0% добровольцев, причем следует отметить, что увеличение титров к HBsAg отмечалось после ревакцинации бивакциной.

Сравнивая результаты, представленные в таблицах 5 и 6, можно сделать вывод о том, что применение набора таблеток бивакцины после иммунизации вакциной против гепатита В позволяет существенно усилить иммунный ответ на HBsAg. Так если вторая иммунизация вакциной «Комбиотех» индуцирует иммунный ответ на HBsAg у 40% привитых волонтеров (у 3 из 7), то иммунизация с использованием набора таблеток бивакцины - у 100% привитых добровольцев (у 4 из 4). Необходимо отметить то, что в этом опыте была использована не самая удачная схема двукратной оральной иммунизации бивакциной: интервал между введениями доз бивакцины составил 1 месяц.

Таблица 5 Динамика гуморального иммунитета к HBsAg у добровольцев группы 1, иммунизированных двукратно вакциной «Комбиотех» в дозах по 20 мкг
Номер добровольца	Возраст, год	Сутки после вакцинации	Концентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл
60	32	0	<10
		30	<10
		30	Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	<10
		180	<10
71	42	0	<10
		30	<10
			Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	3200
		180	500
90	44	0	<10
		30	<10
		30	Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	<10
62	31	0	<10
		28	100
		60	<10
61	32	0	<10
		30	<10
		30	Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	<10
		180	<10
91	24	0	<10
		30	<10
		30	Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	<10
		180	<10
4	22	0	<10
		30	<10
		30	Повторное введение вакцины «Комбиотех»
		60	500
		180	<10

Таблица 6 Динамика гуморального иммунитета к ВВ и HBsAg у добровольцев группы 9, иммунизированных сначала вакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и еще через месяц дозой бивакцины 7,6 lg OOE в условиях отдаленной ревакцинации
Номер добровольца	Возраст, год	Наличие оспенных знаков	Сутки после вакцинации	Титр антител в РН к ВВ	Концентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл
64	37	Есть	0	<1:5	<10
			0	Иммунизация вакциной «Комбиотех»
			30	-	-10
			30	Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE
			60	1:5	˜10
			60	Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE
			90	1:25	150
65	37	Есть	0	<1:5	˜10
				Иммунизация вакциной «Комбиотех»
			30	-	<10
			30	Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE
			60	<1:5	<10
			60	Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE
			90	1:25	40
99	43	Есть	0	<1:5	<10
				Иммунизация вакциной «Комбиотех»
			30	-	<10
			30	Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE
			60	<1:5	<10
			60	Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE
			90	1:125	30
103	45	Есть	0	<1:5	<10
				Иммунизация вакциной «Комбиотех»
			30	-	<10
			30	Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE
			60	<1:5	500
			60	Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE
			90	1:5	200