гидрофобные, модифицированные, полученные из pres вируса гепатита в (hbv) пептиды и их использование в качестве ингибиторов проникновения hbv и hdv
Классы МПК: | C07K14/005 из вирусов C07K14/02 Hepadnaviridae, например вирус гепатита B A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды A61K39/29 вирус гепатита A61P31/12 противовирусные средства |
Автор(ы): | МИЕР Вальтер (DE), УРБАН Штефан (DE) |
Патентообладатель(и): | РУПРЕХТ-КАРЛС-УНИВЕРЗИТЭТ ХАЙДЕЛЬБЕРГ (DE) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-01-26 публикация патента:
10.09.2013 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полученным из preS вируса гепатита В (HBV) пептидам, и может быть использовано в медицине. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS вируса гепатита В (HBV) пептид формулы:
используют при профилактике или лечении инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D, где Р - это полученный из preS пептид, характеризующийся последовательностью аминокислот SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; Н - это гидрофобная модификация пептида Р, которая производится на N-конце Р и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобных функциональных компонентов; R - это С-концевая модификация пептида Р, которая защищает пептид от деградации; m равно, по меньшей мере, 1; и n равно 0 или, по меньшей мере, 1. Пептид может быть соединен с меткой, выбранной из флуоресцентного красителя, радиоизотопа и контрастного вещества, или слит с пептидом или белком, предпочтительно выбранным из альбумина и Fc-домена человеческого IgG. Изобретение позволяет эффективно ингибировать проникновение HBV и HDV в клетку. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 9 табл., 1 пр.
Формула изобретения
1. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS вируса гепатита В (HBV) пептид формулы:
,
для применения при профилактике или лечении инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D, где
Р - это указанный полученный из preS пептид, характеризующийся последовательностью аминокислот SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12;
H - это гидрофобная модификация указанного полученного из preS пептида Р, которая производится на N-конце Р и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобных функциональных компонентов;
R - это С-концевая модификация указанного полученного из preS пептида Р, которая защищает пептид от деградации;
m равно, по меньшей мере, 1; и
n равно 0 или, по меньшей мере, 1.
2. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по п.1, где Н и/или R связаны с Р посредством линкера или спейсера.
3. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по п.1, где Н представляет собой гидрофобную модификацию, полученную путем ацилирования карбоновыми кислотами, жирными кислотами, С8-С22 жирными кислотами или аминокислотами с липофильной боковой цепью.
4. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по п.3, где Н является гидрофобной модификацией, полученной путем ацилирования миристоилом (С 14), пальмитоилом (С 16) или стеароилом (С 18).
5. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по п.1, где Н представляет собой гидрофобную модификацию полученную путем добавления гидрофобного функционального компонента, выбранного из холестерина, производных холестерина, фосфолипидов, гликолипидов, сложных эфиров глицерина, стероидов, церамидов, производных изопрена, адамантана, фарнезола, алифатических групп, полиароматических соединений.
6. Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по п.1, где R является модифицированной функциональной группой, которую выбирают из амида, D-аминокислоты, модифицированной аминокислоты, циклической аминокислоты, природного и синтетического полимера, такого как ПЭГ, глицина.
7. Пептид по п.1, где пептид ингибирует проникновение HBV и/или HDV в клетку.
8. Пептид, состоящий из гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида по п.1, и метки, выбранной из флуоресцентного красителя, радиоизотопа и контрастного вещества, для применения при профилактике или лечении инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D.
9. Пептид, состоящий из гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида по п.1, который слит с пептидом или белком, предпочтительно выбранным из альбумина и Fc-домена человеческого IgG для применения при профилактике или лечении инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D.
10. Способ профилактики или лечения заболевания у пациента путем применения пептида по любому из пп.1-9, где заболевание представляет собой инфекции HBV и/или HDV, первичные инфекции HBV и/или HDV, гепатит В и/или D, или хронический гепатит В и/или D.
11. Способ по п.10, где инфекция HBV, вызванная любым генотипом HBV ингибируется или предотвращается.
12. Способ по п.10, где пептид вводят пациенту путем, выбираемым из подкожного, внутривенного, перорального, назального, внутримышечного, чрескожного, ингаляционного введения или введения суппозиториями.
13. Фармацевтическая композиция для применения при лечении инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D, содержащая эффективное количество, по меньшей мере, одного гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой эффективное количество находится в диапазоне от 10 мкг до 1 мг на кг массы тела, предпочтительно от 10 мкг до 100 мкг.
15. Вакцинная композиция для применения при профилактике инфекций HBV и/или HDV, первичных инфекции HBV и/или HDV, гепатита В и/или D, хронического гепатита В и/или D, содержащая эффективное количество, по меньшей мере, одного гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Описание изобретения к патенту
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к гидрофобным, модифицированным, полученным из preS вируса гепатита В пептидам, которые являются производными консенсусной последовательности preS HBV и которые предпочтительно ацилированы по N-концу и необязательно модифицированы по С-концу. Данные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды являются крайне эффективными ингибиторами проникновения HBV, а также ингибиторами проникновения HDV, и, таким образом, предназначены для ингибирования инфекций HBV и/или HDV, профилактики инфекций HBV и/или HDV, а также для лечения (хронических) инфекций гепатита В и/или D. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической и вакцинной композициям, содержащим эти гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды.
Уровень техники
В настоящее время у около 2 млрд людей выявляются серологические маркеры HBV. Около 400 миллионов из них хронически инфицированы HBV. По данным центра по борьбе с заболеваниями (CDC) 15-25% хронически инфицированных HBV людей имеют предрасположенность к развитию гепатоцеллюлярной карциномы (НСС) в течение десяти лет, если они не получают надлежащего лечения (1). Вызванная HBV гепатоцеллюлярная карцинома имеет плохой прогноз и в связи с этим HBV был классифицирован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве наиболее значимого природного человеческого канцерогена. Несмотря на существование профилактической вакцины, число инфицированных будет расти в ближайшие десятилетия из-за увеличения численности населения мира и из-за ограничения профилактики в бедных странах.
В промышленно развитых странах HBV в первую очередь передается парентеральным путем. 90-95% инфицированных в острой форме, иммунокомпетентных индивидуумов освобождаются от вируса, обретая иммунную защиту на всю жизнь. У около 5-10% из них развивается хронический гепатит В (300000-500000 человек в Германии). Напротив, в высокоэндемичных областях, особенно в Центральной Африке и в Восточной Азии, основным путем передачи вируса является вертикальная передача от матери ребенку. К сожалению, инфекция не полностью иммунокомпетентных детей приводит в 90-98% случаев к хроническому течению заболевания. Вследствие этого вызванная гепатитом В гепатоцеллюлярная карцинома является наиболее частым видом злокачественных новообразований в большинстве этих стран.
Утвержденные в настоящее время схемы для лечения хронических инфекций вируса гепатита В (HBV) либо нацелены на стадии репликации вирусного генома при сформировавшейся инфекции (Lamivudine, Adefovir, Entecavir), либо действуют как модуляторы иммунной системы (интерферон альфа). К сожалению, только 10-25% пациентов сохраняют устойчивый вирусологический ответ на такие терапии, что отражает в, частности, быстрый отбор мутантов, устойчивых к нуклеотидам/нуклеозидам. Несмотря на доступность профилактической вакцины в силу вышесказанного крайне важно разработать новые виды терапии, нацеленные на незатронутые до сих пор стадии репликации, например на стадию проникновения вируса.
Специфическое ингибирование проникновения вируса является привлекательной терапевтической концепцией для контроля и, в конечном счете, ликвидации острых и хронических инфекций. Для ВИЧ (HIV) интерференция с проникновением вируса была достигнута с помощью полученного из gp41 пептида, состоящего из 36 аминокислот (Fuzeon®), предотвращающего слияние вирусной и клеточной мембран (2).
Несмотря на доступность профилактической вакцины и ингибиторов обратной транскриптазы (reverse transcriptase (RT)) во всем мире растет число инфицированных HBV людей и число связанных с HBV смертей (в настоящий момент около 500000 в год). Около двух третей случаев первичного рака печени связано с персистирующей инфекцией HBV (3).
Текущее лечение следует двум стратегиям: (i) лечение интерфероном (IFN alpha) модулирует иммунные реакции против HBV и демонстрирует прямой противовирусный эффект, который приводит к долгосрочным клиническим результатам примерно у 30% пациентов без эрадикации вируса; (ii) введение ингибиторов вирусной обратной транскриптазы подавляет репликацию вируса и сопровождается значительными биохимическими и гистологическими улучшениями после 1 года лечения. Тем не менее, длительное лечение связано с появлением устойчивых штаммов вируса (4).
HBV является прототипом семейства малых, оболочечных ДНК вирусов млекопитающих и птиц (5). Оболочка HBV включает в себя три белка, которые называются L-(большой), М-(средний) и S-(малый) (см. фигуру 1А). У них одинаковый С-концевой S-домен с четырьмя трансмембранными областями. М- и L-белки несут дополнительные N-концевые вставки длиной 55 (preS2), и, в зависимости от генотипа, 107 или 118 аминокислот (preS1) (см. фигуру 1 В). В вирионах стехиометрическое отношение L, М и S составляет около 1:1:4, наряду с тем, что обильно секретируемые неинфекционные субвирусные частицы (SVP) содержат почти исключительно S- и лишь следы L-белка (6). Во время синтеза preS1-домен L белка миристилируется и транслоцируется через ЭР. Эта модификация имеет большое значение для инфекционности HBV (7, 8).
Исследования ранних событий инфекции HBV носили ограниченный характер, поскольку до недавнего времени не были доступны ни системы культур клеток, ни модели на малых животных (9). Разработка восприимчивой к HBV клеточной линии HepaRG способствовала систематическим исследованиям проникновения HBV и привела к открытию ингибиторов проникновения на основе белков оболочки (10).
Кроме того, в настоящее время не существует эффективной терапии инфекции HDV, сателитного вирусоида, использующего белки оболочки HBV для проникновения в гепатоциты (15, 17, 20). В данной области существует необходимость обеспечения эффективных терапий против инфекции HDV.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на улучшение способов и средств ингибирования, профилактики и/или лечения инфекции HBV и других связанных с HBV заболеваний, известных на данный момент, и, таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных способов и средств, позволяющих целенаправленное и эффективное ингибирование, профилактику и/или лечение инфекции HBV и связанных с HBV заболеваний.
Дополнительная задача настоящего изобретения заключается в обеспечении способов и средств ингибирования, профилактики и/или лечения инфекции HDV и связанных с HDV заболеваний.
Раскрытие изобретения
В соответствии с настоящим изобретением эта задача решается путем обеспечения гидрофобных, модифицированных, полученных из preS HBV пептидов.
Указанные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды имеют общую формулу
,
Р является указанным полученным из preS пептидом и содержит аминокислотную последовательность консенсусной последовательности preS HBV или ее варианты.
Н является указанной гидрофобной модификацией полученного из preS пептида Р, которая является N-концевой и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобного функционального компонента; где m равно, по меньшей мере, 1.
R является необязательной С-концевой модификацией (т.е. n равно 0 либо, по меньшей мере, 1) указанного полученного из preS пептида Р.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для диагностирования, профилактики и/или лечения заболеваний.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается с помощью гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для производства лекарственного средства для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается способами ингибирования инфекций HBV и/или HDV; профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или лечения (хронических) гепатита В и/или D с применением гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению.
В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Осуществление изобретения
Перед тем, как настоящее изобретение будет описано более детально, следует принять к сведению, что это изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методологией, протоколами и реактивами, поскольку последние могут меняться. Также следует принять к сведению, что использованная здесь терминология необходима только для целей описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые будут ограничены только прилагаемой формулой изобретения. Если иное не определено, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычным специалистом в данной области. Для целей настоящего изобретения все процитированные здесь источники включены посредством отсылки во всей полноте.
Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды
Как отмечалось выше, настоящее изобретение обеспечивает гидрофобные, модифицированные, полученные из preS вируса гепатита В (HBV) пептиды.
Оболочка HBV включает в себя три белка, которые называются L (большой), М (средний) и S (малый) (см. фигуру 1А). У них одинаковый С-концевой S-домен с четырьмя трансмембранными областями. М- и L-белки несут дополнительные N-концевые вставки длиной 55, и, в зависимости от генотипа, 107 или 118 аминокислот (preS2- и preS1) (см. фигуру 1В).
Таким образом, экспрессия «полученного из preS» HBV пептида в соответствии с настоящим изобретением относится к пептиду с аминокислотной последовательностью, которая соответствует N-концевым вставкам L-белка HBV, preS1, предпочтительно консенсусной последовательности видов и генотипов от А до Н, а также консенсусным последовательностям HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), вирусов гепатита В шимпанзе и гориллы, но также относится и к их вариантам, предпочтительно вариантам, усеченным по N- и С-концам, вариантам с аминокислотными заменами.
Последовательность с SEQ ID NO: 1 демонстрирует консенсусную аминокислотную последовательность preS HBV видов и генотипов от А до Н, а также консенсусную последовательность HBV шерстистой обезьяны (WMHBV).
Смотрите на фигуре 2 выравнивание, демонстрирующее консенсусную последовательность preS HBV (Consensus) и восемь генотипов HBV (А-Н), а также последовательность preS из HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), охватывающую аминокислоты со 2 по 48. Обратите внимание на то, что генотипы А, В, С, Е, F, G и Н имеют вплоть до одиннадцати дополнительных аминокислот на N-концах.
Аминокислотная последовательность HBV «генотипа С» в данной заявке относится к искусственной последовательности, которая соответствует или является идентичной HBV генотипа С, например, представленной в «Genbank» под номером ABV02850.1, за исключением того, что в позиции 46 в генотипе С настоящего изобретения (в соответствии с нумерацией описанной ниже) вместо Gln (Q) последовательности из «Genbank» находится Lys (К); последовательность HBV генотипа С данной заявки можно также назвать «HBV генотип С Q46K». Смотрите также последовательности SEQ ID NOs. 4, 12, 21-27.
На фигуре 2 также представлена нумерация аминокислотных остатков консенсусной последовательности preS HBV, о которой пойдет речь в тексте данной спецификации:
Аминокислотный остаток под номером 1 является метионином (Metl) генотипа D (ранее описанного как подтип ayw, см. также последовательность с SEQ ID NO: 5), в то время как аминокислотный остаток под номером - 11 является метионином (Met-11) генотипа С (SEQ ID NO: 4). In vivo Metl или Met(-11), соответственно, отрезаются клеточной метиониламинопептидазой и модифицируются последовательным переносом N-миристоилтрансферазой миристоильного остатка с Миристоил-СоА на аминокислотный остаток под номером 2, глицин (Gly2), или на аминокислотный остаток под номером (-10), глицин (Gly(-10)), соответственно. N-концевой аминокислотный остаток генотипа D является естественной аминокислотой глицином (Gly2) и числиться под номером 2 в соответствии с соответствующей нумерацией кодонов исходной открытой рамки считывания L (или, например Gly(-10) для генотипа С). Консенсусная последовательность preS HBV также содержит дополнительные N-концевые аминокислоты генотипов А, В, С, Е, F, G и Н (обозначенные как позиции «-»). Таким образом, в общем консенсусная последовательность preS HBV охватывает позиции от (-11) до 48.
Таким образом, существует разница между описанной выше нумерацией и действительным порядком аминокислот в последовательности с SEQ ID NO: 1, например Met (-11), номер остатка (-11), числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly (-10), номер остатка (-10), числится как остаток 2 последовательности с SEQ ID NO: 1; Met 1, номер остатка 1, числится как остаток 12 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly 2, номер остатка 2, числится как остаток 13 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly 48, номер остатка 48, числится как остаток 58 последовательности с SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 консенсусная последовательность preS HBV (позиции от (-11) до 48)
Для последовательностей SEQ ID NOs. 2-10 смотрите также номера доступа в «Genbank»:
HBV Генотипа A Genbank AAT28684.1
HBV Генотипа В Genbank AAUO 1950.1
HBV Генотипа С Genbank ABV02850.1 (где в позиции 46 находится Lys (К) (как в последовательности с SEQ ID NO: 4) вместо Gin (Q) (of ABV02850.1)
HBV Генотипа D Genbank AAR1 9337.1
HBV Генотипа E Genbank ABS31101.1
HBV Генотипа F Genbank ABK1 9774.1
HBV Генотипа G Genbank AAF34735.1/AF160501_3
HBV Генотипа Н Genbank AAM09052.1
WMHBV Genbank AAC 16905.1
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид в соответствии с настоящим изобретением имеет формулу
,
где
Р является указанным полученным из preS пептидом
Н является указанной гидрофобной модификацией Р;
R является С-концевой модификацией Р;
m равно, по меньшей мере, 1;
n равно 0 или, по меньшей мере, 1.
Полученный из preS HBV пептид, Р, в соответствии с настоящим изобретением содержит:
- аминокислотную последовательность консенсусной последовательности preS HBV, как показано в последовательности с SEQ ID NO: 1, или
- ее варианты.
«Вариантами» предпочтительно являются укороченные с N- и С-конца варианты, варианты с аминокислотными заменами и делециями или удлиненные варианты. Варианты содержат помимо прочего аминокислотную последовательность, содержащую модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неприродную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и) или дополнительные соединения, которые могут имитировать пептидный остов/структуру.
Предпочтительно, если варианты выбираются из укороченных с N- или С-конца вариантов последовательности с SEQ ID NO: 1; вариантов с аминокислотными заменами или делециями; вариантов, содержащих модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неестественную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и), или из дополнительных соединений, которые могут имитировать пептидный остов/структуру.
В соответствии с изобретением вариант гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида содержит, по меньшей мере, 10 или 20 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 и может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или большего количества аминокислот последовательности с SEQ ID NO:1 или ее вариантов.
Укороченные с N- и/или С-конца варианты содержат предпочтительно, по меньшей мере, 48 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки со 2 по 48), более предпочтительно, по меньшей мере, 17 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки с 5 по 21) или, по меньшей мере, 20 последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки со 2 по 21).
Термин «вариант» также относится к гомологичным последовательностям, обнаруженным в различных вирусных видах, штаммах или подтипах рода гепаднавирусов, таких как штамм alfa 1 HBV, штамм LSH HBV (изолят из шимпанзе), HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), или штаммы, выбранные из группы, состоящей из генотипов HBV от А до Н, а также и определенного здесь HBV генотипа С Q46K (также как в последовательности SEQ ID NO: 4).
Термин «вариант» также относится к гомологичным последовательностям, которые демонстрируют, по меньшей мере, 50% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или любой другой раскрытой здесь аминокислотной последовательности, предпочтительно 70%, более предпочтительно 80%, еще более предпочтительно 90% или 95%.
Таким образом, в предпочтительном гидрофобном, модифицированном, полученном из preS пептиде Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью различных вирусных видов, штаммов или подтипов, предпочтительно генотипов HBV или HBV шерстистой обезьяны (woolly monkey HBV (WMHBV) или их вариантов.
Предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: со 2 по 10 или их вариантов (см. также фигуру 2).
В предпочтительном воплощении в гидрофобном, модифицированном, полученном из preS пептиде Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью, выбранной
из аминокислотных остатков со 2 по 21,
из аминокислотных остатков с 5 по 21,
из аминокислотных остатков с 5 по 15 или
из аминокислотных остатков с 9 по 15 (см. также последовательность [SEQ ID NO: 15])
представленной в последовательности с SEQ ID NO: 1 консенсусной последовательности preS HBV.
Более предпочтительно, если Р не содержит аминокислотных замен и/или делеций остатков с 9 по 22 последовательности с SEQ ID NO: 1, как, например, делеция остатков с 17 по 21.
Более предпочтительно, если Р не содержит аминокислотных замен и/или делеций остатков с 9 по 15 последовательности с SEQ ID NO: 1.
Более предпочтительно, если мотив последовательности NPLGFFP [SEQ ID NO:15] (соответствующий остаткам с 9 по 15 последовательности с SEQ ID NO: 1) не прерывается или не модифицируется, например, путем замены остатков 11-15 D-аминокислотами.
Более предпочтительно, если в гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидах Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из:
аминокислотных остатков со 2 по 48 консенсусной последовательности [SEQ ID NO: 11];
[SEQ ID NO: 12]; аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа С [SEQ ID NO: 13];
аминокислотных остатков с 5 по 21 генотипа С [SEQ ID NO: 14];
аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа С [SEQ ID NO: 15];
аминокислотных остатков со 2 по 48 генотипа D [SEQ ID NO: 16];
аминокислотных остатков с 5 по 48 генотипа D [SEQ ID NO: 17];
аминокислотных остатков со 2 по 33 генотипа D [SEQ ID NO: 18];
аминокислотных остатков с 5 по 33 генотипа D [SEQ ID NO: 19];
аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа D [SEQ ID NO: 20];
аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа D [SEQ ID NO: 15].
Таким образом, предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: с 11 по 20 или из их вариантов.
Также смотрите предпочтительные аминокислотные последовательности Р ниже в таблицах 1-7, фигурах и примерах.
«Варианты» последовательности с SEQ ID NO: 1 также содержат варианты или «аналоги», содержащие аминокислотные делеции, аминокислотные замены, такие как консервативная или неконсервативная замена другими аминокислотами или изостерами (модифицированными аминокислотами, которые несут близкую структурную и пространственную схожесть с белковыми аминокислотами), аминокислотные дополнения или изостерные дополнения, при условии если последовательности дают 70% ингибирование инфекции HBV при концентрации пептида ниже 10 мкМ, и предпочтительно ниже 1 мкМ.
Консервативные аминокислотные замены, как правило, относятся к заменам аминокислотами того же класса. Эти классы включают, например,
- аминокислоты, обладающие незаряженными полярными боковыми цепями, такие как аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин;
- аминокислоты, обладающие основными боковыми цепями, такие как лизин, аргинин и гистидин;
- аминокислоты, обладающие кислыми боковыми цепями, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и
- аминокислоты, обладающие неполярными боковыми цепями, такие как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и цистеин.
Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды по изобретению предпочтительно могут быть модифицированы для того, чтобы обладать повышенными иммуногенными свойствами. К таким повышенным иммуногенным свойствам относятся, например, увеличение диапазона антител, выявляемых после иммунизации, или запуск продуцирования антител, способных нейтрализовать инфекцию различных вирусных штаммов.
В другом воплощении гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды по изобретению предпочтительно могут быть модифицированы для ослабления их иммуногенных свойств. Такие гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды могут быть особенно полезны в терапевтическом применении для ингибирования инфекции HBV in vivo, при отсутствии или ограничении побочных эффектов.
Таким образом, предпочтительными мотивами модифицированных заменой и/или делецией последовательностей являются последовательности, ответственные за иммуногенность, такие как эпитопы для В- и/или Т-клеток, и, помимо этого, такие как мотивы распознавания антителами.
Предпочтительными эпитопами HBV для В-клеток являются аминокислотные остатки с 20 по 23, мотив DPAF последовательности с SEQ ID NO: 1 и аминокислотные остатки с 26 по 32, мотив NSNNPDW, консенсусной последовательности (SEQ ID NO: 1) и генотипа С (SEQ ID NO: 4) или мотив NTANPDW генотипа D (SEQ ID NO: 5).
В предпочтительном воплощении модифицируются аминокислотные остатки с 20 по 23 последовательности с SEQ ID NO: 1, предпочтительно путем аминокислотной замены; и/или аминокислотные остатки с 26 по 32, предпочтительно путем аминокислотной замены и/или делеции.
Предпочтительно, если аминокислотные остатки с 20 по 23 последовательности с SEQ ID NO: 1 (мотив DPAF) модифицируются заменой на аминокислоту аланин, предпочтительно в мотив APAF.
Предпочтительно, если аминокислотные остатки с 26 по 32 последовательности с SEQ ID NO: 1 модифицируются заменой на аминокислоту аланин, предпочтительно в мотив NANAPDW или NAAAPDW.
В предпочтительном воплощении Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: с 21 по 28 или из их вариантов.
Смотрите также ниже таблицы 2, 7 и соответствующие фигуры и примеры.
В более предпочтительном воплощении Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей:
SEQ ID NO: 11 (остатки со 2 по 48 консенсусной последовательности),
SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С),
SEQ ID NO: 13 (остатки со 2 по 21 генотипа С),
SEQ ID NO: 4 (остатки с (-11) по 48 генотипа С), и
SEQ ID NO: 20 (остатки со 2 по 21 генотипа D).
Гидрофобная модификация (Н) полученного из preS пептида Р является N-концевой.
К «N-концевым» относится гидрофобная модификация на N-конце, т.е. соответствующая первому аминокислотному остатку (например, Gly 2), но также к ним могут относиться гидрофобные модификации в непосредственной близости от N-конца, например, соответствующие аминокислотным остаткам (-4), (-3), (-2), (-1), 1, 2 или 3 или 4. Таким образом, гидрофобная модификация помимо прочего может быть получена путем прикрепления гидрофобного функционального компонента на участке, близком к N-концу Р.
Гидрофобная модификация указанного полученного из preS HBV пептида по настоящему изобретению добавляет гидрофобный функциональный компонент к пептиду.
Более того m равно, по меньшей мере, 1, т.е. модификация, по меньшей мере, одним гидрофобным функциональным компонентом или группой.
В предпочтительных воплощениях по этому изобретению m равно 1, 2, 3, 4 или больше. Т.е. Р может быть модифицирован более чем одним гидрофобным функциональным компонентом или группой, например, 2-мя. Гидрофобные функциональные компоненты или группы могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
Гидрофобная модификация указанного полученного из preS HBV пептида по настоящему изобретению выбирается из:
- ацилирования;
- добавления гидрофобного функционального компонента.
Ацилирование предпочтительно выбирается из ацилирования карбоновыми кислотами, жирными кислотами, аминокислотами с липофильной боковой цепью.
Предпочтительными являются насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, разветвленные или неразветвленные жирные кислоты, предпочтительно с 8-22 атомами углерода (от С8 до С22).
Более предпочтительно, если гидрофобная модификация ацилированием выбирается из ацилирования миристоилом (С14), пальмитоилом (С16) и стеароилом (С18).
Добавление гидрофобных функциональных компонентов предпочтительно выбирается из добавления холестерина, производных холестерина, фосфолипидов, гликолипидов, эфиров глицерина, стероидов, церамидов, производных изопрена, адамантана, фарнезола, алифатических групп, полиароматических соединений.
Прикрепление гидрофобного компонента предпочтительно осуществляется ковалентным связыванием, которое может быть достигнуто посредством карбаматной, амидной, эфирной, дисульфидной или любой другой связи, доступной специалисту в данной области.
Таким образом, гидрофобные, модифицированные, предпочтительно ацилированные, полученные из preS пептиды по этому изобретению предпочтительно являются липопептидами из-за их N-концевой липофильной или гидрофобной группы/функционального компонента.
Предпочтительные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды смотрите также в таблицах 1 и 2.
Более предпочтительными гидрофобными, модифицированными, полученными из preS пептидами по изобретению являются те, в которых:
- Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 20; и
- H является гидрофобной модификацией ацилированием с помощью миристоила (С14), или стеароила (С18), предпочтительно стеароила (С18).
Таким образом, более предпочтительными гидрофобными, модифицированными, полученными из preS пептидами по изобретению являются:
Обозначение пептида | Аминокислотная последовательность | Гидрофобная модификация |
HBVpreS/2-48stearoyl (consensus) | SEQ ID NO: 11 | Стеароил (С18) |
HBVpreS/2-48myr (consensus) | SEQ ID NO: 11 | Миристоил (С14) |
HBVpreS/2-48 stearoyl (С) | SEQ ID NO: 12 | Стеароил (С18) |
HBVpreS/2-48 myr (С) | SEQ ID NO: 12 | Миристоил (С14) |
HBVpreS/2-21 stearoyl (C) | SEQ ID NO: 12 | Стеароил (С18) |
HBVpreS/(-11)-48 stearoyl (C) | SEQ ID NO: 4 | Стеароил (С18) |
HBVpreS/(-11)-48 myr (C) | SEQ ID NO: 4 | Миристоил (С14) |
HBVpreS/2-21 stearoyl (C) | SEQ ID NO: 20 | Стеароил (С18) |
где (С) относится к HBV генотипа С Q46K.
Предпочтительное воплощение последовательностей генотипа С
В весьма предпочтительном воплощении этого изобретения гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды Р по изобретению содержат аминокислотную последовательность, полученную из генотипа С.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS генотипа С пептид (или пептиды) настоящего изобретения ингибирует инфекцию HBV более сильно чем те, что получены из генотипа D. Смотрите также фигуру 3 и таблицу 3.
Как обсуждалось выше, аминокислотная последовательность HBV «генотипа С» в данной заявке относится к искусственной последовательности, которая соответствует или является идентичной последовательности HBV генотипа С, например, представленной в «Genbank» под номером ABV02850.1, за исключением того, что в позиции 46 генотипа С настоящего изобретения (в соответствии с нумерацией описанной ниже) находится Lys (К), вместо Gin (Q), представленного в последовательности из «Genbank»; последовательность HBV генотипа С этой заявки можно также назвать «HBV генотипа С Q46K». Смотрите также последовательности с SEQ ID NO: 4, 12, 21-27.
Нумерация, подобная описанной выше для консенсусной последовательности preS HBV используется для нумерации аминокислотных остатков последовательности генотипа С (смотрите также фигуру 2), например,
Met (-11), номер остатка (-11), числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 1;
Gly (-10), номер остатка (-10), числится как остаток 2 последовательности с SEQ ID NO: 1;
Met 1, номер остатка 1, числится как остаток 12 последовательности с SEQ ID NO: 1;
Gly 2, номер остатка 2, числится как остаток 13 последовательности с SEQ ID NO: 4; и числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 12;
Gly 48, номер остатка 48, числится как остаток 58 последовательности с SEQ ID NO: 4; и числится как остаток 47 последовательности с SEQ ID NO: 12;
SEQ ID NO: 12 аминокислотная последовательность, которая соответствует позициям от 2 по 48 HBV Генотипа С за исключением того, что в позиции 46 находится Lys (К) вместо Gln (Q); Q46K
2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
Предпочтительно Р может быть выбран из
SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С),
SEQ ID NO: 4 (остатки с (-11) по 48 генотипа С),
SEQ ID NO: 13 (остатки со 2 по 21 генотипа С),
SEQ ID NO: 14 (остатки с 5 по 21 генотипа С), и
SEQ ID NO: 15 (остатки с 9 по 15 генотипа С),
В предпочтительном воплощении последовательностей генотипа С гидрофобный, модифицированный, полученный из preS вируса гепатита В (HBV) пептид формулы
,
в которой предпочтительно:
Р является полученным из preS пептидом, содержащим аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12 или укороченный с N- и/или С-конца вариант этой последовательности длиной, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислот, или ее производное, содержащее модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неестественную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и);
Н является гидрофобной модификацией полученного из preS пептида Р, которая является N-концевой и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобного функционального компонента;
R является С-концевой модификацией указанного полученного из preS пептида Р;
m равно, по меньшей мере, 1;
n равно 0 или, по меньшей мере, 1.
Предпочтительный пептид по изобретению особенно эффективен для ингибирования инфекций HBV и/или HDV, для профилактики острых инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.
Предпочтительно, если Р содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С).
Также предпочтительно, если Р содержит вариант аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12, где вариант содержит, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислотных остатков последовательности с SEQ ID NO: 12 (предпочтительно остатки с 9 по 18), более предпочтительно 15 или 20, и может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или большего количества аминокислотных остатков последовательности с SEQ ID NO: 12.
Предпочтительно, если последовательные аминокислотные остатки последовательности с SEQ ID NO: 12, которые содержаться в Р, выбираются из
аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа С [=SEQ ID NO: 15],
аминокислотных остатков со 2 по 15 генотипа С,
аминокислотных остатков с 9 по 18 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 18 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 20 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа С [=SEQ ID NO: 13],
аминокислотных остатков с 5 по 21 генотипа С [=SEQ ID NO: 14],
аминокислотных остатков со 2 по 25 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 30 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 35 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 40 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 45 генотипа С,
аминокислотных остатков со 2 по 46 генотипа С, или
аминокислотных остатков со 2 по 48 генотипа С [=SEQ ID NO: 12].
В воплощениях, Р содержит соответствующие остаточные аминокислотные остатки последовательности с SEQ ID NO: 12, а именно
аминокислотные остатки с 16 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 19 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 21 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 22 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 26 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 31 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 36 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 41 по 48 генотипа С,
аминокислотные остатки с 46 по 48 генотипа С, или
аминокислотные остатки с 47 по 48 генотипа С,
которые либо являются идентичными соответствующим аминокислотным остаткам последовательности с SEQ ID NO: 12 либо являются их производными, где производное содержит, по меньшей мере, одну модификацию, выбранную из замены аминокислоты, делеции аминокислоты, модифицированной аминокислоты, неестественной аминокислоты или пептидомиметика,
где, по меньшей мере, одна модификация представлена 1, 2, 3, 4, 5 или большее количество раз.
Здесь описаны предпочтительные аминокислотные замены.
Предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-15 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 16-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-20 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 21-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-25 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 26-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-30 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 31-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-35 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 36-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-40 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 41-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;
- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12;
в которой производное содержит, по меньшей мере, одну модификацию, выбранную из аминокислотной замены, аминокислотной делеции, модифицированной аминокислоты, неестественной аминокислоты или пептидомиметика,
где, по меньшей мере, одна модификация представлена 1, 2, 3, 4, 5 или большее количество раз.
В предпочтительном воплощении последовательностей генотипа С:
Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности с SEQ ID NO: 12 или, соответственно, описанных вариантов/производных/модификаций,
- Н является гидрофобной модификацией ацилированием с помощью миристоила (С14), или стеароила (С18), предпочтительно стеароила (С18).
Модификация миристоилированием является предпочтительной при применении in vivo и в медицинских целях из-за ее более высокой безопасности, например, из-за отсутствия побочных эффектов стеароиловой группы (врожденный иммунный ответ и т.п.)
Таким образом, более предпочтительными гидрофобными модифицированными полученными из preS пептидами по изобретению являются:
С-концевая модификация (R) указанного полученного из preS пептида Р является модификацией функциональным компонентом, который защищает от деградации, как, например, деградация in vivo.
К «С-концевым» относится модификация С-конца, т.е. соответствующая последнему аминокислотному остатку, но также к ним могут относиться модификации в непосредственной близости от С-конца, например, в предпоследнем остатке, предпредпоследнем остатке или в более удаленных от конца аминокислотных остатках (примером такой модификации является введение одной D-аминокислоты, которая защищает носитель от энзиматической деградации, например, в результате действия карбоксипептидаз).
Специалист в данной области будет способен выбрать соответствующий подходящий функциональный компонент (или компоненты) в зависимости от соответствующего применения.
Предпочтительные функциональные компоненты, защищающие от деградации, выбираются из амидов, D-аминокислот, модифицированных аминокислот, циклических аминокислот, естественных и синтетических полимеров, таких как ПЭГ, гликан.
В воплощении Р сшивается с пептидом или белком, предпочтительно выбранным из альбумина, Fc-домена человеческих IgG.
Сшивка предпочтительно проводится на С-конце Р.
При этом n равно 0 или, по меньшей мере, 1, т.е. С-концевая модификация является необязательной.
Предпочтительно n равно 1.
В дополнительных воплощениях по этому изобретению n равно 1, 2, 3, 4 или больше. Т.е. С-конец Р или область вблизи от него могут быть модифицированы более чем одним функциональным компонентом или группой, например, 2-мя. Функциональные компоненты или группы могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
В воплощении этого изобретения Н и/или R связаны с Р через линкер или спейсер.
Специалисту в данной области известны линкеры или спейсеры, такие как полиаланин, полиглицин, углеводы, (CH2)n-группы.
Специалист в данной области будет, таким образом, способен выбрать соответствующие подходящие линкер(ы) или спейсер(ы) в зависимости от соответствующего применения.
В предпочтительном воплощении, гидрофобный, модифицированный, полученный из preS пептид по изобретению несет метку или маркер, предпочтительно выбранный из флуоресцентной краски, радиоизотопа и контрастного агента.
Предпочтительными изотопами являются 131I, 125I, 99mTc, 18F, 68Ga, 111In, 90Y, 177Lu.
Предпочтительными флюоресцентными красками являются краски «Alexa», производные родамина и флюоресцеина, «Су»-красители.
Предпочтительными контрастными агентами являются комплексы гадолиния (Gd), комплексы и частицы супрамагнитного железа (Fe), соединения, содержащие атомы с высоким атомным числом, т.е. йод для компьютерной томографии (КТ), микропузырьки и носители, такие как липосомы, которые содержат данные контрастные агенты.
Пептиды этого изобретения могут быть приготовлены с помощью различных процедур, уже известных специалисту в данной области, в общем, с помощью синтетических химических процедур и/или генно-инженерных процедур.
Конкретно синтетические химические способы включают последовательный и блочный синтез в твердой фазе (11). Последовательный способ в твердой фазе может быть осуществлен с помощью общепринятых автоматизированных способов, таких как использование автоматизированного пептидного синтезатора. В этом способе защищенные по -амино группе аминокислоты связывают с полимерной подложкой. Используемая полимерная подложка может быть любой подходящей смолой, обычно используемой в данной области для получения (поли)пептидов в твердой фазе, предпочтительно полистиролом, который кополимеризован с полиоксиэтиленом для обеспечения участков образования эфиров с изначально введенной о-аминозащищенной аминокислотой. Этот оптимизированный способ, примененный изобретателями, был подробно описан (см. например, (12)). Аминокислоты вводились одна за другой (пошагово). Каждый цикл синтеза, соответствующий введению одной аминокислоты, включает стадию снятия защиты, последующие стадии отмывки, стадию присоединения с активацией аминокислоты и последующие стадии отмывки. После каждой из этих стадий следует фильтрация. Реактивными агентами для присоединения являются классические реактивные агенты для синтеза (поли)пептидов, такие как дициклогексилкарбодиимид, гидроксибензотриазол, гексафторфосфат бензотриазил-1-ил-окситрис(диметиламино)фосфония и дифенилфосфорилазид. После синтеза полипептида на смоле полипептид отделяется от смолы обработкой сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота в присутствии анизола, этандиола или 2-метилиндола. Соединение затем очищается классическими методами очистки, в частности с помощью ВЭЖХ.
Пептиды настоящего изобретения также могут быть получены путем соединения селективно защищенных (поли)пептидных фрагментов, такое соединение может быть проведено, например, в растворе.
Кроме того, пептиды могут быть получены с помощью известных специалисту в данной области методов генетической инженерии. Особенно для этого подходит эукариотическая экспрессирующая система, такая как бакуловирусная система. В соответствии с этим способом белки экспрессируются в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, и регулирующие полинуклеотидные последовательности, такие как промотор. Для инфекции рекомбинантным бакуловирусом доступно несколько клеточных линий, таких как клеточная линия Sf-9, доступная в американской коллекции типовых культур (CRL 1711). Также вполне подходит экспрессия в прокариотической экспрессирующей системе, такой как Е. coli.
Введение гидрофобного функционального компонента в пептид может быть проведено с помощью различных широко известных специалистам в данной области процедур, включая синтетические и генно-инженерные подходы.
Как вариант, пептиды и/или сшитые пептиды (т.е. гидрофобные модифицированные пептиды) могут быть получены путем стабильной трансфекции эукариотических клеточных линий, подобных СНО и другим известным в данной области клеточным линиям, которые обычно используются для получения вакцин и т.п. Из-за внутреннего свойства, заключающегося в том, что N-концевые аминокислоты 47-preSl содействуют секреции миристоилированного белка/пептида, биологически активный гидрофобный пептид может быть выделен из супернатантов клеточной культуры.
Характеристики гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидов изобретения
Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды настоящего изобретения являются универсальными ингибиторами проникновения вируса гепатита и также проявляют гепатотропизм/тропизм к печени, т.е. они имеют своей целью печень. Тропизм к печени продемонстрирован, в частности, на фигуре 11.
Указанный гепатотропизм далее раскрыт в соответствующей предварительной заявке на патент США изобретателей с заголовком: «Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS вируса гепатита В (HBV) пептиды и их использование в качестве переносчиков для специфической доставки соединений в печень», который зарегистрирован в тот же день и который включен здесь посредством отсылки во всех полноте.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) настоящего изобретения является крайне подходящими и эффективными ингибиторами проникновения HBV, а также HDV, in vitro (например, путем предотвращения связывания и/или интернализации частиц HBV гепатоцитами) или in vivo.
Как видно из фигур и примеров, гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды настоящего изобретения обладают высокой ингибиторной активностью, т.е. они эффективно ингибируют инфекции HBV и/или HDV в очень низких дозах. Значения IC50 более предпочтительных воплощений находятся в диапазоне от 0,01 до 50 нМ, предпочтительно от 0,025 до 50 нМ, более предпочтительно от 0,05 до 25 нМ. См. также таблицу 1.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS генотипа С пептид (или пептиды) настоящего изобретения ингибируют инфекцию HBV более сильно, чем те, что получены из генотипа D.
Более того, гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды настоящего изобретения могут быть специально сделаны так, чтобы не содержать иммуногенных эпитопов, но при этом все еще проявлять сильную ингибиторную активность, например, как HBVpreS/2-21stearoyl , который не содержит иммуногенных эпитопов в своей последовательности, и при этом обладает IC50 около 8 нМ.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) изобретения также способен перекрестно препятствовать HBV генотипов С и D, потому что пептиды, полученные из генотипа С (такие как HBVpreS/2-21stearoyl (C) или HBVpreS/2-48 myr (C)), могут ингибировать проникновение HBV генотипа D.
Фармацевтические и вакцинные композиции
Как подчеркнуто выше, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит:
- по меньшей мере, один описанный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид;
- определенный здесь конъюгат; и
- необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению очень хорошо приспособлены для всех описанных здесь применений и способов.
Как подчеркнуто выше, настоящее изобретение обеспечивает вакцинную композицию, содержащую, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Вакцинные композиции по настоящему изобретению очень хорошо приспособлены для всех описанных здесь применений и способов.
«Фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель» относится к любому переносчику, в котором или с которым могут быть составлены фармацевтическая или вакцинная композиции по изобретению. К ним относятся солевой раствор и фосфатно-солевой буферный раствор. В общем, разбавитель или носитель выбираются на основании стандартной фармацевтической практики, вида и пути введения.
Медицинские применения
Как подчеркнуто выше, настоящее изобретение обеспечивает первое медицинское применение гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующую фармацевтическую композицию (или композиции) данного изобретения.
Таким образом, гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) в соответствии с изобретением являются подходящими и, таким образом, обеспечиваются для диагностики, профилактики и/или лечения заболеваний.
Как подчеркнуто выше, настоящее изобретение кроме того обеспечивает гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) и/или соответствующую композицию (или композиции) данного изобретения для диагностики, профилактики и/или лечения некоторых заболеваний.
В предпочтительно воплощении гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения обеспечивают ингибирование инфекций HBV и/или HDV; профилактику первичных инфекции HBV и/или HDV и/или лечение гепатита В и/или D, предпочтительно хронических гепатита В и/или D.
В предпочтительном воплощении гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения используются для изготовления лекарственного средства для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.
Предпочтительно, если гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения обеспечивают ингибирование инфекции HBV и/или HDV.
Предпочтительно, если гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения обеспечивают профилактику первичных инфекций HBV и/или HDV.
Предпочтительно, если ингибируется или предотвращается инфекция HBV любого генотипа HBV.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) изобретения способен перекрестно препятствовать HBV генотипов С и D, поскольку пептиды, полученные из генотипа С (такие как HBVpreS/2-21stearoyl (C) или HBVpreS/2-48 myr (C)), могут ингибировать проникновение HBV генотипа D.
В предпочтительном воплощении гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения используются/предоставляются в качестве ингибиторов проникновения HBV и/или HDV.
Предпочтительно, если гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) или фармацевтическая композиция (или композиции) изобретения предоставляются для лечения гепатита В и/или D, в частности хронических гепатита В и/или D.
Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид (или пептиды) настоящего изобретения являются весьма подходящими и эффективными ингибиторами проникновения HBV, а также HDV как in vitro (например, путем предотвращения связывания и/или интернализации частиц HBV гепатоцитами), так и in vivo.
При этом изобретение предоставляет способ ингибирования инфицирования гепатоцитов HBV in vitro, содержащий использование описанных выше гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида или фармацевтической композиции.
К соответствующим гепатоцитам относятся человеческие первичные гепатоциты или клеточная линия, полученная из гепатомы, которая называется HepaRG (22) (описанная в патентной заявке FR 0109044), гепатоциты из Tupaia belangeri (23), которые также восприимчивы к инфекции HBV.
При этом, как описано выше, настоящее изобретение предоставляет способы для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для предотвращения первичных инфекции HBV и/или HDV и для лечения (хронических) гепатита В и/или D путем применения гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) или фармацевтической композиции (или композиций) изобретения.
Путь введения
Предпочтительно, если путь введения гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидов или фармацевтических композиций настоящего изобретения выбирается из подкожного, внутривенного, перорального, назального, внутримышечного, чрезкожного, ингаляционного или введения суппозиториями.
Предпочтительным воплощением для назального введения или применения является назальный спрей.
Терапевтически эффективное количество
Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды или фармацевтические композиции изобретения обеспечиваются таким образом, чтобы они содержали терапевтически эффективное количество указанного гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида (или пептидов) в указанной фармацевтической композиции (или композициях).
«Терапевтически эффективное количество» гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида или фармацевтической композиции этого изобретения относится к количеству, которое достаточно для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; профилактики первичных инфекций HBV и/или HDV; лечения гепатита В и/или D и/или достаточно для вакцинирования и/или ингибирования проникновения HBV или HDV in vivo.
Предпочтительное терапевтически эффективное количество находится в диапазоне от 10 мкг до 1 мг на кг массы тела, предпочтительно от 10 мкг до 100 мкг.
При использовании гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида изобретения в качестве вакцины предпочтительное терапевтически эффективное количество находится в диапазоне от 10 мкг до 1 мг на кг массы тела.
Для значения IC50 гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида, использованного в концентрации 10 нМ, предпочтительное терапевтически эффективное количество составляет около 100 мкг на кг массы тела или находится в диапазоне от 1 до 5 мг на пациента. Предпочтительное терапевтически эффективное количество в диапазоне от 1 до 5 мг на пациента может быть введено один раз в день или в других воплощениях только раз каждые 2-3 дня.
Предпочтительное терапевтически эффективное количество зависит от соответствующего приложения и требуемого результата в ингибировании, лечении или вакцинации.
Специалист в данной области будет способен определить подходящие терапевтически эффективные количества.
Идентификация рецептора HBV
Изобретение дополнительно относится к способу идентификации in vitro и/или in vivo рецептора гепатоцитов, вовлеченного в прикрепление и/или проникновение HBV, и/или относится к способу для количественного выражения экспрессии указанного рецептора, который содержит использование описанного выше гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида.
Указанный рецептор гепатоцитов может быть идентифицирован в животных или в соответствующих животных моделях, предпочтительно в мыши или в человеке.
В частности, указанный способ содержит стадии:
- контактирование биопсии печени или гепатоцитов с гидрофобным, модифицированным, полученным из preS пептидом изобретения в условиях и за период времени, достаточный для специфического связывания указанного пептида с рецептором, экспрессированным на поверхности гепатоцитов;
- выявление связывания указанного пептида с рецептором; и
- идентификация указанного рецептора.
Это может быть достигнуто классическими способами, хорошо известными специалисту в данной области. Например, в это может быть вовлечены радиоактивное, энзиматическое или флуоресцентное мечение гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида изобретения и последующая детекция подходящим способом. Известно множество флюоресцентных материалов, которые могут быть использованы в качестве меток. К их числу относятся, например, метки на основе флюоресцеина, родамина, аурамина, «Texas Red», «Су3», «Су5», «DIGE». Энзиматические метки включают конъюгирование фермента с молекулой, представляющей интерес, например с полипептидом, и могут быть обнаружены с помощью любого колориметрического, спектрофотометрического или флюороспектрометрического способа.
Изобретатели идентифицировали липопептиды, полученные из поверхностного белка-HBV-preS1, которые эффективно блокируют проникновение HBV in vitro и in vivo. Исследования биораспределения этих ингибиторных пептидов настоящего изобретения выявили то, что они селективно аккумулируются в печени, где они связываются гепатоцитами, в которые они, вероятно, проникают. Этот гепатотропизм требует N-концевое ацилирование пептида и зависит от некоторых мотивов последовательности preS HBV в N-концевом участке preS1 длиной 47 аминокислот, т.е. в пределах от 2 до 21 аминокислотного остатка (или предпочтительно, в пределах минимальной последовательности остатков от 9 до 15). По наблюдениям изобретателей эта пептидная последовательность дополнительно несет сигнал мембранной транслокации, который облегчает транспорт даже полностью сшитых белков через плазматические мембраны (неопубликованные результаты), открывая возможность специфической доставки любого типа лекарственных средств к плазматической мембране гепатоцитов или даже селективно в клетку.
Изобретатели показали, что липопептиды, полученные из preS1 HBV, способны в очень низких дозах полностью предотвратить инфицирование HBV в мышиной модели с трансплантированными uPA-RAG-1. Исследования фармакокинетики этих полученных из preS1 HBV ингибиторов проникновения помимо прочего показали значительный гепатотропизм вместе с необычайно высокой стабильностью в сыворотке (t1/2 прибл. 60 ч) и продолжительным периодом полураспада в целевом органе (t 1/2 прибл. 24 ч). Обязательным являются как N-концевое ацилирование, так и целостность определенной аминокислотной последовательности пептидов. Пептиды могут, таким образом, также быть использованы как универсальные векторы для специфичных, нацеленных на печень лекарственных средств для поражения инфекций гепатоцитов или для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.
(См. также соответствующую предварительную патентную заявку США изобретателей с заголовком «Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS вируса гепатита В (HBV) пептиды и их использование в качестве переносчиков для специфической доставки соединений в печень» («Hydrophobic modified preS-derived peptides of hepatitis В virus (HBV) and their use as vehicles for the specific delivery of compounds to the liver»), зарегистрированную того же числа.)
Изобретатели помимо прочего доказали принцип того, что инфекция WMHBV может эффективно блокироваться in vivo посредством подкожных применений пептидов, полученных из оболочечных белков HBV. Данный факт открывает новые перспективы для профилактики острых инфекций HBV и возможные подходы к лечению хронического гепатита В. Поскольку в использованных в этом изобретении мышах uPA/RAG-2/Pfp отсутствуют В-, Т-, и NK-клетки, предполагается прямой ингибиторный эффект пептидов на восприимчивые гепатоциты. Это подтверждается эффективной аккумуляцией ацилированных, полученных из preS пептидов в печени с последующим медленным очищением, возможно, через желчный проток. Оба свойства позволяют подкожное применение при очень низких дозах и с низкими частотами. Учитывая, что 5 инъекций по 0,2 мг/кг HBV/preS2-48myr в течение 5 дней предотвратили развитие инфекции WMHBV, непрерывное введение (около) в 30 раз более активного пептида HBV/preS2-48stearoyl может быть эффективным при дозах ниже 7 мкг/кг ~ 13 нмоль/кг, при ежедневном введении или при введении каждые 2 дня. Принимая во внимание, что полученная на мышах эффективная фармакологическая доза относительно массы тела для людей корректировалась (13) примерно на порядок, эффективная доза на персону, как ожидается, будет ниже чем 100 мкг/день.
Схема на основе аналогов нуклеозидов/нуклеотидов для лечения хронической инфекции HBV часто приводит к отбору устойчивых мутантов (4, 14). Это требует альтернативных стратегий и новых лекарственных средств, которые адресуются различным стадиям репликативного цикла HBV. Ингибирование проникновения HBV липопептидами является одним из таких подходов. Благодаря механизму действия изобретатели рассчитывают на эффективность против любых устойчивых к нуклеозидам/нуклеотидам мутантов. Более того, поскольку активность пептидов требует консервативной последовательности в preS 1-домене (15), пептиды активны против любого генотипа HBV. В отличие от «Fuzeon®», который, поражая белок gp41 HIV, тем самым приводит к возникновению внутримолекулярных компенсаторных мутаций, предыдущие исследования показали, что ацилированные липопептиды из HBV адресованы клеточному компоненту, предотвращая взаимодействие HBV с его рецептором (16, 17). Таким образом, появление устойчивых мутантов становится маловероятным.
Явными условиями для клинического применения липопептидов, полученных из preS HBV, является профилактика еще не сформировавшихся инфекций HBV (например, постконтактная профилактика, профилактика вертикальной трансмиссии или профилактика повторного заражения трансплантата печени). Тем не менее, ингибиторы проникновения также эффективны у хронически инфицированных пациентов, например, в сочетании с интерфероном или с ингибиторами вирусной обратной транскриптазы. Поскольку поддержание хронической инфекции HBV может зависеть от динамики оборота инфицированных гепатоцитов, очищаемых иммунной системой, с одной стороны, и от (ре)инфицирования вылеченных/незараженных клеток, с другой стороны (18), было бы интересно оценить в химерной системе с uPA эффективность подавления такими терапевтическими подходами распространения инфекции и появления устойчивых штаммов в условиях противовирусного лечения (19).
Полученные из preS1 HBV липопептиды также ингибируют in vitro инфекцию HDV, сателитного вирусоида, использующего белки оболочки HBV для проникновения в гепатоциты (15, 17, 20). Поскольку до настоящего времени не существовало эффективной терапии инфекции HDV, полученные из preS липопептиды представляют первую селективную терапию для этого часто осложненного заболевания печени.
Применение полученных из preS HBV липопептидов иммунокомпетентными пациентами вызывает клеточную и гуморальную иммунные реакции. Это благоприятно сказывается на терапевтическом результате, поскольку известно, что антитела, узнающие эпитопы на HBVpreS/2-48, нейтрализуют инфекцию HBV in vitro (21). Более того, делалось предположение, что ликвидация вируса при естественной инфекции требует удачное установление специфичного к HBVpreS иммунитета. Таким образом, в дополнение к прямой интерференции проникновению вируса, стимуляция пептидами специфичных к preS иммунных ответов может способствовать ликвидации вируса через цитолитические и нецитолитические иммунные реакции, особенно в комбинации с IFN .
Следующие примеры и чертежи иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Схематическое изображение частицы HBV и L-, М- и S-белков HBV.
(A) Частично двуспиральная ДНК ковалентно ассоциирована с комплексом вирусной полимеразы, состоящим из терминального белка (ТР), обратной транскриптазы (RT) и RNaseH. Геном инкапсулирован икосаэдрической оболочкой, построенной из 120 димеров корового белка. Три поверхностных белка HBV L-, М- и S- встроены в липидный бислой из ЭР. L- и М-белки содержат полный S-домен, выступающий в роли мембранного якоря.
(B) Доменпная структура трех поверхностных белков HBV L, М и S.
L-белок содержит N-концевой миристоилированный 107 аминокислотный preS1-домен, 55 аминокислотный preS2-домен и S-домен, содержащий четыре трансмембранных сегмента (I-IV).
Фигура 2. Консенсусная последовательность preS1 HBV.
Сверху: L-белок HBV с изображенными доменами preS1, preS2 и S. N-конец миристоилирован.
Выравнивание ниже демонстрирует: консенсусную последовательность (Consensus) и восемь генотипов HBV (А-Н), а также preS последовательность HBV шерстистой обезьяны, охватывающую аминокислоты 2-50. Обратите внимание на то, что генотипы А, В, С, Е, G и Н обладают одиннадцатью дополнительными аминокислотами на N-концах, а генотип F обладает 10-ю дополнительными аминокислотными остатками.
Внизу представлены известные функциональные субдомены.
Пожалуйста, обратите внимание на то, что HBV генотипа С относится к HBV генотипа С Q46K.
Фигура 3. Анализ сравнительного ингибирования инфекции полученных из preS HBV миристоилированного и стеароилированного пептидов двух генотипов С и D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 2000 нМ BVpreS/2-48myr (D), HBVpreS/2-48 myr(C), HBVpreS/(-11)-48myr(C), HBVpreS/2-48 stearoyl(C) и HBVpreS/(-11)-48stearoyl(С). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
где (С) или генотип С относится к HBV генотипа С Q46K.
Фигура 4. Анализ ингибирования инфекции полученными из preS HBV миристоилированным и стеароилированным пептидами с консенсусной последовательностью.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 0,125; 0,25; 0,5; 0,75 и 1 нМ HBVpreS/2-48 myr(consensus) и HBVpreS/2-48stearoyl(consensus). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 5. Анализ сравнительного ингибирования инфекции делегированных по С-концу, полученных из preS HBV стеароилированных пептидов генотипа D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ HBVpreS/2-48stearoyl(D), HBVpreS/2-15stearoyl (D), HBVpreS/2-21(D), HBVpreS/2-26stearoyl(D) и HBVpreS/2-33 stearoyl(D). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 6. Анализ сравнительного ингибирования инфекции делегированных по N- и С-концу полученных из preS HBV стеароилированных пептидов генотипа D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ HBVpreS/2-48stearoyl(D), HBVpreS/2-33 stearoyl(D), HBVpreS/5-33stearoyl(D), HBVpreS/5-48 stearoyl(D), HBVpreS/9-33stearoyl(D) и HBVpreS/9-48 stearoyl(D). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 7. Анализ сравнительного ингибирования инфекции мутированных внутри стеароилированных пептидов HBVpreS/2-48 генотипа D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ HBVpreS/2-48 stearoyl(D), HBVpreS/2-48stearoyl(D-AS11-15 )(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Ala11-15)(D) HBVpreS/2-48stearoyl( 17-21)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Ala17-21 )(D) и HBVpreS/2-48stearoyl(Ala2-9)(D). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 8. Анализ сравнительного ингибирования инфекции мутированных внутри стеароилированных пептидов HBVpreS/2-48 генотипа D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ HBVpreS/2-48 stearoyl(retroinverso)(D) и HBVpreS/2-48stearoyl (Ala21,23,29,30)(D). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 9. Анализ сравнительного ингибирования инфекции мутированных внутри стеароилированных пептидов HBVpreS/2-48 генотипа D.
Клетки HepaRG инфицировали либо в отсутствие (0 нМ), либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ HBVpreS/2-48stearoyl(Ala 18)(D), HBVpreS/2-48stearoyl( 11-15)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Ser13 )(D) и HBVpreS/2-48stearoyl(Arg11)(D). Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА.
Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Фигура 10. Стеароилированные полученные из HBVpreS пептиды генотипа D, используемые в данном изобретении.
Фигура 11. Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды по изобретению демонстрируют in vivo тропизм к печени.
А - Биораспределение HBVpreS/2-48 Tyrstearoyl (D) в мыши.
В - Биораспределение HBVpreS/5-48 D-Tyrstearoyl (D) в мыши.
С - Биораспределение HBVpreS/2-33-D Tyrstearoyl (D) в мыши.
Фигура 12. Ингибирование инфекции HBV в клетках HepaRG с помощью «Myrcludex В», эффект ацилирования.
«Myrcludex В» относится к HBVpreS/2-48(C), где (С) относится к HBV генотипа С Q46K.
Конкурентный анализ сравнения стеароилированного и миристоилированного HBVpreS/2-48(C), HBVpreS/2-48myr(C) и HBVpreS/2-48stearoyl (C). Протестированные концентрации были ниже 1 нМ для того, чтобы имелась неполная конкуренция.
Представлены изменения HBeAg, дни 7-14 после инфекции.
Реакция и условия инфицирования такие же, как и в экспериментах, представленных на фигурах 3 и 9.
ПРИМЕРЫ
Методы
Синтез гидрофобных, модифицированных, полученных из preS HBV пептидов
Синтез проводили, как описано, например, в (16).
Клеточные линии и первичные клеточные культуры
Клетки HepaRG растили в среде «William's Е», дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином, 5 мкг/мл инсулином и 5×10-5 М гемисукцинатом гидрокортизона (16). Клетки пассировали 1/5 каждые две недели с помощью трипсинизации. За две-три недели до инфекции индуцировали клеточную дифференцировку добавлением в поддерживающую среду 2% ДМСО. Среду заменяли каждые 2-3 дня.
Инфекционный конкурентный анализ
В качестве инфекционного инокулюма был использован 50-кратный концентрированный культуральный супернатант клона HepG2 2.2.15 (23), по причине неограниченного запаса и постоянного качества. Он был приготовлен из свежесобранных супернатантов путем преципитации вирусных частиц в присутствии 6% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 8000. Осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 25% FCS. Аликвоты хранили при -80°С. Дифференцированные клетки HepaRG или РНН инкубировали с концентрированным инфекционным источником, 10 кратно разведенным в культуральной среде, дополненной 4% ПЭГ 8000 (Sigma), в течение 20 ч при 37°С. В конце инкубации, клетки отмывали три раза культуральной средой и содержали в присутствии 2% ДМСО и 5×10-5 М гемисукцината гидрокортизона и собирали в указанное время.
Конкурентные эксперименты проводили в 12-луночных планшетах. Примерно 1×106 клеток в начале предварительно инкубировали в течение 30 минут с химически синтезированными полученными из HBV пептидами с последующей коинкубацией клеток с пептидом и вирусом в течение 10 часов. Все конкурентные серии были проведены, по меньшей мере, дважды и результаты одного репрезентативного эксперимента представлены в каждом конкретном случае (см. фигуры 3-7).
Клетки HepaRG были инфицированы либо в отсутствие (0 нМ) либо в присутствии 1, 5, 25, 100 и 2000 нМ
- HBVpreS/2-48myr(D),
- HBVpreS/2-48myr(C),
- HBVpreS/(-11)-48 myr(C),
- HBVpreS/2-48stearoyl (C) и
- HBVpreS /(-11)-48stearoyl(c) или
0,125; 0,25; 0,5; 0,75 и 1 нМ
- HBYpreS/2-48myr(consensus),
- HBVpreS/2-48 stearoyl(consensus),
1, 5, 25, 100 и 1000 нМ
- HBVpreS/2-48stearoyl(D),
- HBVpreS/2-15stearoyl(D),
- HBVpreS/2-21 stearoyl(D),
- HBVpreS/2-26stearoyl (D) и
- HBVpreS/2-33stearoyl(D), или
- 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ
- HBVpreS/2-48 stearoyl(D),
- HBVpreS/2-15stearoyl (D),
- HBVpreS/2-21stearoyl(D),
- HBVpreS/2-26stearoyl(D) и
- HBVpreS/2-33stearoyl(D), или
- 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ
- HBVpreS/2-48stearoyl (D),
- HBVpreS/2-48stearoyl(D-AS 11-15)(D),
- HBVpreS/2-48stearoyl (Ala11-15)(D),
- HBVpreS/2-48 stearoyl( 17-21)(D),
- HBVpreS/2-48stearoyl (Ala17-21)(D), или
- 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ
- HBVpreS/2-48stearoyl(retroinverso)(D) и
- HBVpreS/2-48stearoyl(Ala21,23,29,30 ) (D), или
- 1, 5, 25, 100 и 1000 нМ
- HBVpreS/2-48stearoyl (Ala18) (D),
- HBVpreS/2-48stearoyl ( 11-15) (D),
- HBVpreS/2-48stearoyl (Ser13)(D),
- HBVpreS/2-48stearoyl (Arg11) (D).; или
- 50, 100, 150, 250 и 1000 пМ (0,05, 0,1, 0,25 и 1 нМ)
- HBVpreS/2-48 myr(C) и
- HBVpreS/2-48stearoyl (C),
где (С) относится к HBV генотипа С Q46K.
Инфекционный инокулюм (HBV генотипа D) и пептиды инкубировали в течение ночи. После отмывки, клетки выдерживали в течение еще 12 дней для того, чтобы обеспечить вирусную генную экспрессию. Супернатант клеточной культуры периода 8-12 дней собирали и анализировали в нем секретируемый HBSAg с помощью количественного коммерчески доступного ИФА. Значения HBsAg из соответствующих бесконкурентных инфекций были приняты за 100% и степень ингибирования инфекции приведена как процент от бесконкурентной инфекции.
Результаты представлены на фигурах 3-9 и 12, а также в таблицах 3-9.
Биораспределение гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидов
Биораспределение гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидов изучали на самцах мышей NMRI. Все эксперименты проводили в соответствии с немецкими законами. Пептиды, содержащие дополнительные остатки Tyr на С-конце, метили 131I (Amersham Biosciences, Фрайбург, Германия) по методу с хлорамином-Т и очищали с помощью ВЭЖХ. Меченные пептиды вводили подкожно инъекцией раствора в 50% ДМСО. Через установленные периоды времени мышей забивали и измеряли радиоактивность, содержащуюся в крови, сердце, легких, селезенке, печени, почках, мышцах и мозге, с помощью гамма-счетчика (Canberra Packard, Рюссельхайм, Германия) и выражали как процент от инъецированной дозы на грамм ткани (% ИД/г).
Оценка стабильности гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидов после выделения из печени
Для определения стабильности в печени меченный 131I HBVpreS/2-48myr(D) выделяли из одной доли печени через 24 часа после подкожной инъекции. С этой целью 1 мл воды на грамм замороженной ткани печени добавляли к образцу. После гомогенизации добавляли равный объем ацетонитрила и повторяли гомогенизацию. После центрифугирования (2×10 мин при 4000×g) этот раствор разделяли на колонке обратнофазной ВЭЖХ и подсчитывали счетчиком гамма-излучения радиоактивность каждой фракции.
Признаки, раскрытые в предыдущем описании, в формуле изобретения и/или в прилагаемых чертежах, могут как раздельно, так и в любой комбинации служить материалом для реализации изобретения в различных его формах.
Класс C07K14/02 Hepadnaviridae, например вирус гепатита B
Класс A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды
Класс A61K39/29 вирус гепатита
Класс A61P31/12 противовирусные средства