способ отделения и извлечения изофлавонов и соевого белка из соевого материала (варианты)

Формула изобретения

1. Способ отделения и извлечения изофлавонов и соевого белка из соевого материала, содержащего соевый белок и изофлавоны, включающий взаимодействие очищенного соевого белкового экстракта, содержащего изофлавоны, с сильноосновной анионообменной смолой на основе четвертичных аммониевых групп, взаимодействие и связывание изофлавонов с данной анионообменной смолой, за счет чего соевый белковый экстракт очищается от изофлавонов, выделение и собирание с данной анионообменной смолы соевого белкового экстракта, очищенного от изофлавонов, и выделение и собирание изофлавонов с данной анионообменной смолы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию доведения рН очищенного от изофлавонов соевого белкового экстракта до изоэлектрической точки белка, что приводит к осаждению соевого белка.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что рН доводят до величины от 4 до 5 для осаждения белка.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что осажденный соевый белок отделяют от жидкой фазы экстракта.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что осажденный соевый белок, отделенный от жидкой фазы экстракта, нейтрализуют.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что осажденный соевый белок, отделенный от жидкой фазы экстракта, высушивают.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что сильноосновная анионообменная смола на основе четвертичных аммониевых групп является крупнопористой анионообменной смолой II типа.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что до контакта очищенного соевого белкового экстракта с данной анионообменной смолой, смолу приводят в соответствие с требуемыми условиями путем обработки смолы агентом, который превращает смолу в форму гидроксида, смолу в форме гидроксида подвергают воздействию агента, превращающего ее в форму хлорида или сульфата, затем смолу в форме хлорида или сульфата обрабатывают агентом, превращающим, по крайней мере, некоторые сильноосновные группы смолы в форму карбонатов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что изофлавоны включают, по крайней мере, одно из изофлавоновых соединений, выбранных из генистеина, даидзеина, глицитеина, биоханина А, формононетина и их природных гликозидов и конъюгированных гликозидов.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что изофлавоны отделяют и собирают с данной анионообменной смолы после того, как очищенный от изофлавонов белковый экстракт отделен и собран с данной анионообменной смолы.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что изофлавоны выделяют с данной анионообменной смолы путем элюирования изофлавонов с анионообменной смолы растворителем, выбранным из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропилового спирта, изобутилового спирта, бутанола, этилацетата, ацетонитрила, ацетона, метиленхлорида, хлороформа, четыреххлористого углерода или смеси любых из перечисленных выше растворителей.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку выделенных изофлавонов в условиях (т.е. при температуре, рН и времени инкубации), эффективных для превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает взаимодействие выделенных изофлавонов с ферментом -глюкозидазой в условиях (т.е. при температуре, рН и времени инкубации), эффективных для превращения изофлавонгликозидов в аглюконизофлавоны.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, большую часть соевого белка, содержащегося в очищенном соевом белковом экстракте, отделяют и выделяют с данной анионообменной смолы в соевом белковом экстракте, очищенном от изофлавонов.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что в основном весь соевый белок, содержащийся в очищенном соевом белковом экстракте, отделен и выделен с данной анионообменной смолы в соевом белковом экстракте, очищенном от изофлавонов.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, большая часть изофлавонов, содержащихся в очищенном соевом белковом экстракте, отделена и выделена с данной анионообменной смолы.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в основном все изофлавоны, содержащиеся в очищенном соевом белковом экстракте, отделены и выделены с данной анионообменной смолы.

18. Способ отделения и извлечения изофлавонов и соевого белка из соевого материала, содержащего соевый белок и изофлавоны, включающий получение очищенного соевого белкового экстракта, содержащего солюбилизированный соевый белок и изофлавоны, который практически не содержит нерастворимого соевого белкового материала; взаимодействие очищенного соевого белкового экстракта с сильноосновной анионообменной смолой на основе четвертичных аммониевых групп; связывание изофлавонов с данной анионообменной смолой, за счет чего соевый белковый экстракт очищается от изофлавонов; выделение и собирание с данной анионообменной смолы соевого белкового экстракта, очищенного от изофлавонов; и выделения и собирание изофлавонов с данной анионообменной смолы.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что очищенный соевый белковый экстракт получают экстракцией соевого материала, содержащего белок и изофлавоны, водным экстрагентом, имеющим рН выше изоэлектрической точки белка, для солюбилизации соевого белка и изофлавонов экстрагентом; и последующего отделения жидкого экстракта, содержащего солюбилизированные соевый белок и изофлавоны, от нерастворимого соевого материала.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что соевый материал выбран из группы, состоящей из соевых хлопьев, соевой муки, соевого порошка, соевой крупки, соевых бобов или их смеси, а водный экстрагент имеет рН от 6 до 12.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию доведения рН очищенного от изофлавонов соевого белкового экстракта до изоэлектрической точки белка, что приводит к осаждению соевого белка.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что рН доводят до величины от 4 до 5 для осаждения белка.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что осажденный соевый белок отделяют от жидкой фазы экстракта.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что осажденный соевый белок, отделенный от жидкой фазы экстракта, нейтрализуют.

25. Способ по п.23, отличающийся тем, что осажденный соевый белок, отделенный от жидкой фазы экстракта, высушивают.

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что сильноосновная анионообменная смола на основе четвертичных аммониевых групп является крупнопористой анионообменной смолой II типа.

27. Способ по п.18, отличающийся тем, что до контакта очищенного соевого белкового экстракта с данной анионообменной смолой, смолу приводят в соответствие с требуемыми условиями путем обработки смолы агентом, который превращает смолу в форму гидроксида, смолу в форме гидроксида подвергают воздействию агента, превращающего ее в форму хлорида или сульфата, затем смолу в форме хлорида или сульфата обрабатывают агентом, превращающим, по крайней мере, некоторые сильноосновные группы смолы в форму карбонатов.

28. Способ по п.18, отличающийся тем, что изофлавоны включают, по крайней мере, одно из изофлавоновых соединений, выбранных из генистеина, даидзеина, глицитеина, биоханина А, формононетина и их природных гликозидов и конъюгированных гликозидов.

29. Способ по п.18, отличающийся тем, что изофлавоны отделяют и собирают с данной анионообменной смолы после того, как очищенный от изофлавонов белковый экстракт отделен и собран с данной анионообменной смолы.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что изофлавоны выделяют с данной анионообменной смолы путем элюирования изофлавонов с анионообменной смолы растворителем, выбранным из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропилового спирта, изобутилового спирта, бутанола, этилацетата, ацетонитрила, ацетона, метиленхлорида, хлороформа, четыреххлористого углерода или смеси любых из перечисленных выше растворителей.

31. Способ по п.18, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку выделенных изофлавонов в условиях (т.е. при температуре, рН и времени инкубации), эффективных для превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды.

32. Способ по п.18, отличающийся тем, что дополнительно включает взаимодействие выделенных изофлавонов с ферментом -глюкозидазой в условиях (т.е. при температуре, рН и времени инкубации), эффективных для превращения изофлавонгликозидов в аглюконизофлавоны.

33. Способ по п.18, отличающийся тем, что по крайней мере большую часть соевого белка, содержащегося в очищенном соевом белковом экстракте, отделяют и выделяют с данной анионообменной смолы в соевом белковом экстракте, очищенном от изофлавонов.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что в основном весь соевый белок, содержащийся в очищенном соевом белковом экстракте, отделен и выделен с данной анионообменной смолы в соевом белковом экстракте, очищенном от изофлавонов.

35. Способ по п.18, отличающийся тем, что, по крайней мере, большая часть изофлавонов, содержащихся в очищенном соевом белковом экстракте, отделена и выделена с данной анионообменной смолы.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что в основном все изофлавоны, содержащиеся в очищенном соевом белковом экстракте, отделены и выделены с данной анионообменной смолы.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к способу отделения и извлечения белка и изофлавонов из растительного материала, содержащего белок и изофлавоны, и в особенности к способу использования ионного обмена для отделения и извлечения белка и изофлавонов из соевого материала.

Во всем мире растительные белки являются важным источником питания. Например, соевые бобы являются превосходным источником питания как для людей, так и для животных. Соевый белок в промышленном масштабе экстрагируют из соевых бобов для получения недорогого, высокопитательного источника белка. Изолированный соевый белок может найти применение в многочисленных диетических рецептах для использования как его питательных свойств, так и функциональных характеристик, которые белок придает пищевому продукту или напитку. Некоторые распространенные пищевые продукты, в которых используется соевый белок, включают рубленое мясо, эмульгированное мясо и маринованное мясо; налитки, такие как питательные напитки, напитки для спортсменов, напитки, обогащенные белком, соки, молоко, заменители молока и напитки для снижения веса; сыры, такие как твердые и мягкие сыры, сливочный сыр и прессованный творог; замороженные десерты, такие как мороженое, молоко со льдом, обезжиренные десерты и немолочные замороженные десерты; йогурты; супы; пудинги; хлебобулочные изделия; приправы для салатов; а также заправки и мягкие пасты для приготовления бутербродов, такие как майонез и соус для чипсов.

Определенные растения, такие как соевые бобы, горох, фасоль и другие бобовые наряду с белком содержат изофлавоны. Изофлавоны являются фитоэстрогенными соединениями, которые, как было установлено, обладают рядом свойств, полезных для здоровья людей. Например, на фиг.1 (табл.1) приведены изофлавоны, присутствующие в сое: генистеин, даидзеин, глицитеин, формононетин, а их природные гликозиды и конъюгированные гликозиды приведены на фиг.2 (табл.2) "Mal" означает "малонил" и "Ас" означает "ацетил". Другим биологическим активным изофлавоном, найденным в растениях иных, чем соя, является биоханин А, показанный на фиг 1.

Свойства изофлавонов, которые связывают с пользой для здоровья, весьма многочисленны, более того их продолжают открывать. Например, было установлено, что некоторые из этих изофлавонов препятствуют развитию рака молочной железы и рака простаты и индуцируют апоптоз клеток молочной железы и простаты. Было обнаружено, что изофлавоны, экстрагированные из сои, также сдерживают развитие атеросклероза и понижают концентрацию общего холестерина и холестерина липопротеина низкой плотности в сыворотке крови, ослабляют или предотвращают развитие симптомов климактерического периода (менопаузы), задерживают развитие болезни Альцгеймера и препятствуют разрушению костей вследствие остеопороза.

Изофлавоны связывали со специфическим горьковатым вкусом бобовых, в которых они содержатся в значительном количестве. Следовательно, изофлавоны и белок, содержащиеся в растительном материале, желательно разделить и выделить как белковый материал, очищенный от изофлавонов и обладающий хорошим вкусом, так и полезные для здоровья изофлавоны.

Способы выделения изофлавонов из растительного материала, содержащего белок и изофлавоны, известны из уровня техники. Например, в патенте США 5,679,806 раскрыт способ экстракции, выделения и очистки изофлавонов из растительного материала, согласно которому растительный материал экстрагируют спиртовым растворителем для извлечения изофлавонов из растительного материала, спиртовой экстракт, содержащий изофлавоны, адсорбируют на матрице с обращенной фазой с последующей специфической десорбцией изофлавонов с матрицы ступенчатым элюированием и кристаллизацией изофлавонов из выделенного элюата. В патенте Японии 1-258669 раскрыт способ, согласно которому соевые бобы выдерживают в теплой воде для превращения изофлавонов в форму аглюконов; аглюконизофлавоны экстрагируют в противотоке из соевого материала водным спиртом, экстракт концентрируют и высушивают, высушенный материал растворяют в спирте и наносят на полимерную смолу с обращенной фазой, изофлавоны элюируют со смолы водным спиртом.

Эти способы, будучи совершенно удовлетворительными с точки зрения отделения изофлавонов от растительного материала и их очистки, не обеспечивают способ извлечения очищенного белкового материала и очищенных изофлавонов из растительного материала, содержащего и изофлавоны и белок. В обоих способах для экстракции изофлавонов из растительного материала используется спиртовой растворитель. Растительные белки, такие как соевый белок, в значительной степени нерастворимы в спиртовых растворах и наряду с другими нерастворимыми в спирте растительными материалами, такими как растительные волокна, остаются в виде побочного остатка спиртовой экстракции.

В патенте США 4,428,876 раскрыт способ выделения и растительных белков и флаваноидов, включая изофлавоны, из растительного материала, содержащего флаваноиды и белок. Растительный материал экстрагируют водным щелочным раствором для получения экстракта, содержащего флаваноиды и белок, экстракт отделяют от неэкстрагируемых и нерастворимых растительных материалов. Для адсорбции флаваноидов экстракт наносят на неполярную или слабополярную полимерную адсорбирующую смолу (сорбент) либо сразу, либо после подкисления. Подкисление вызывает осаждение белка из экстракта. В том случае, когда проводят подкисление, осажденный белок отделяют от экстракта перед нанесением его на полимерный сорбент. После нанесения экстракта сорбент промывают водой и собирают элюат, содержащий углеводы и, если не проводили подкисление, белок. В том случае, если экстракт не подкисляли и из него не был выделен белок перед нанесением на сорбент, водный элюат подкисляют для осаждения и отделения белка. Флаваноиды элюируют с сорбента полярным растворителем, таким как метанол или этанол, элюат собирают и концентрируют.

Использование способа, раскрытого в патенте США 4,428,876, не позволяет полностью разделить изофлавоны и углеводы/белок из-за природы изофлавонов, и смолы, и элюентов, используемых в процессе. Как показано на фиг.1 и 2, изофлавоны являются относительно полярными соединениями, особенно в форме природных гликозидов или конъюгированных гликозидов. Вследствие своей полярности изофлавоны слабо адсорбируются на неполярном или слабополярном сорбенте. В водном окружении белок и углеводы также представляют собой относительно полярные соединения, которые не особенно сильно связываются с адсорбентом. Поэтому сама по себе адсорбция изофлавонов, углеводов и белков на полимерном сорбенте не эффективна для получения хорошего разделения соединений в ходе элюирования, так как соединения легко вытесняются с сорбента и незначительно отличаются друг от друга по силе связывания с сорбентом.

Способ, раскрытый в патенте США 4,428,876, обеспечивает отделение некоторых изофлавонов от белка и углеводов благодаря относительной растворимости изофлавонов в элюенте. Например, если элюентом, используемым вначале, является вода, и экстракт является соевым экстрактом (который среди прочих содержит изофлавоны генистеин и даидзин), генистеин практически не будет элюироваться с белком и углеводами, так как генистеин очень плохо растворим в воде, в то время как даидзин элюируется вместе с белком и углеводами, так как даидзин растворим в воде.

Следовательно, необходим эффективный, коммерчески жизнеспособный способ для полного разделения и извлечения белка и изофлавонов из содержащего их растительного материала.

В данном изобретении раскрыт усовершенствованный способ отделения и извлечения изофлавонов и белка из растительного материала, который может быть эффективно и экономично использован в промышленном масштабе. Способ включает отделение и извлечения изофлавонов и растительного белка путем взаимодействия очищенного растительного белкового экстракта, содержащего изофлавоны и белок, с полярной ионообменной смолой; связывание изофлавонов с полярной ионообменной смолой; отделение и выделение с полярной ионообменной смолы белкового экстракта, очищенного от изофлавонов; и отделение и выделение с ионообменной смолы изофлавонов. В предпочтительном варианте осуществления подвергнутые отделению и выделенные изофлавоны превращают в форму аглюконов.

Важной отличительной чертой данного изобретения является то, что изофлавоны отделяют от растительного белка с помощью взаимодействия очищенного растительного белкового экстракта с полярной ионообменной смолой, а не с неполярным или малополярным сорбентом. Использование полярной ионообменной смолы в значительной степени способствует чистоте разделения и извлечения белка и изофлавонов, так как изофлавоны благодаря своей полярной природе сильно адсорбируются на полярной смоле и хорошо отделяются от белка в процессе элюции экстракта со смолы.

Другой важной особенностью данного изобретения является то, что согласно данному изобретению извлекают и очищенный от изофлавонов белковый материал и изофлавоны, а не только один их этих материалов. В данном изобретении в качестве субстрата для взаимодействия с полярной ионообменной смолой используется очищенный белковый экстракт. В отличие от спиртовых экстрактов, содержащих изофлавоны и белок растительных материалов, очищенный белковый экстракт содержит значительные количества и белка и изофлавонов. Способ по настоящему изобретению может обеспечить значительную экономическую эффективность, так как два требуемых материала, содержащихся в растительном материале, могут быть разделены и извлечены одновременно.

Очищенный растительный белковый экстракт для использования согласно способу по настоящему изобретению может быть получен экстракцией растительного материала, содержащего белок и изофлавоны, водным экстрагентом, имеющим рН выше изоэлектрической точки белка для солюбилизации белка и изофлавонов этим экстрагентом. Затем жидкий экстрагент, содержащий солюбилизированные изофлавоны и белок, отделяют от нерастворимых в экстрагенте растительных материалов, таких как лигнин, целлюлоза, растительные волокна и нерастворимые гемицеллюлозы, для получения очищенного экстракта. Предпочтительно растительный экстракт отделяют от нерастворимых растительных материалов фильтрованием или центрифугированием и декантацией супернатанта экстракта с нерастворимых материалов. Получаемый в результате очищенный белковый экстракт содержит растворимый белок растительного материала и, по крайней мере, одно из изофлавоновых соединений, выбранных из генистеина, даидзеина, глицитеина, биоханина А, формононетина и их природных гликозидов и конъюгированных гликозидов, и не содержит заметных количеств нерастворимого белкового материала. Изофлавон гликозид относится к соединениям, содержащим остаток глюкозы, ковалентно связанный с аглюконизофлавоновой частью молекулы, и конъюгированные изофлавон гликозиды относятся к эфирам изофлавонгликозидов и включают соединения 6"-О-Маl генистин, 6"-O-Ас генистин, 6"-O-Маl даидзин, 6"-O-Ас даидзин и 6"-O-Маl глицитин.

Растительные материалы, содержащие белок и изофлавоны, которые могут быть использованы для получения очищенного экстракта, включают, но не ограничены только этими, один или более из следующих растительных материалов: соевые бобы, нут обыкновенный, горох обыкновенный, бобы марама, кановалию мочелистную, кановалию мечевидную, приморскую кановалию мочелистную, карао бобы, кустовую фасоль, долихос обыкновенный, чину посевную, горох огородный, бобы дженко, бобы гоа, бобы пахиризуса, кормовые бобы, бомбарский земляной орех, чечевицу, прыгающие бобы, бархатные бобы, бобы африканского рожкового дерева и другие бобовые, и производные таких растительных материалов, включая обезжиренные соевые хлопья, соевую муку и соевый порошок. В связи с высоким содержанием белка и изофлавонов в соевых бобах наиболее предпочтительным растительным материалом является соевый материал или продукты переработки соевых бобов, наиболее предпочтительны коммерчески доступные обезжиренные соевые хлопья.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления для использования согласно способу по настоящему изобретению получают очищенный соевый белковый экстракт. Коммерчески доступную соевую муку, соевый порошок, соевую крупку или обезжиренные соевые хлопья используют в качестве исходного материала. Предпочтительно соевый материал обрабатывают сульфитом, таким как сульфит натрия, для повышения сыпучести и улучшения показателей микробного контроля. Соевый материал экстрагируют водным раствором, имеющим рН от примерно 6 до примерно 12, предпочтительно водным раствором гидроксида натрия, имеющим рН от примерно 8 до примерно 11. Весовое соотношение экстрагента к соевому материалу составляет от примерно 3:1 до примерно 20:1, предпочтительно от примерно 8: 1 до примерно 16:1. Очищенный экстракт соевого белка предпочтительно отделяют от нерастворимых соевых материалов фильтрованием или центрифугированием и декантацией экстракта.

Согласно способу по данному изобретению, раствор очищенного белкового экстракта взаимодействует с полярной ионообменной смолой для связывания изофлавонов, содержащихся в экстракте, с полярной ионообменной смолой. Предпочтительно смолу набивают в колонку, имеющую входное и выходное отверстия, при этом экстракт для контакта со смолой наносят на колонку через входное отверстие, а элюат со смолы собирают на выходе с колонки (из выходного отверстия).

Предпочтительно, чтобы в процессе была использована анионообменная смола, наиболее предпочтительно крупнопористая сильно основная анионообменная смола II типа, хотя может быть использована и слабоосновная анионообменная смола. Сильноосновная анионообменная смола II типа означает тип смолы на основе четвертичных аммониевых групп, в которых четырьмя заместителями атома азота являются этанольная группа, две метальных группы и бензильная группа. Коммерчески доступные сильноосновные анионообменные смолы II типа включают IRA 910, производимую Rohm & Haas, Independence Mall West, Филадельфия, PA 19105; Dowex 22 производства Dow Chemical U.S.A., 2040 Willard H. Dow Center, Мидланд MI 48674; и lonac A 651, производимую Sybron, Sybron Chemical Division, Birmingham Road, Бирмингэм, Нью-Йорк 08011. Коммерчески доступной слабоосновной анионообменной смолой, которая может быть использована в процессе согласно настоящему изобретению, является Duolite А-7 производства Rohm & Haas.

Подходящие способы для приведения полярной ионообменной смолы к требуемым техническим условиям описаны в патенте США 5,248,804, включенном в данное изобретение в виде ссылки. Предпочтительным способом приведения смолы в соответствие с требованиями является обработка смолы реагентом, который освобождает поверхность смолы от осадка и превращает смолу в форму гидроксида, после чего смолу подвергают воздействию реагента, превращающего ее в форму хлорида или сульфата, затем смолу обрабатывают реагентом, превращающим, по крайней мере, некоторые сильноосновные группы в форму карбонатов и переводит слабоосновные группы в форму свободных оснований. Подходящим реагентом для освобождения поверхности смолы от осадка и превращения ее в форму гидроксида является раствор гидроксида натрия. Подходящим реагентом для перевода смолы в форму хлорида является соляная кислота, предпочтительно 1%-ный раствор соляной кислоты, и подходящим реагентом для перевода смолы в форму сульфата является серная кислота, предпочтительно 1%-ная серная кислота. Примеры реагентов, подходящих для превращения хотя бы некоторых сильноосновных групп в форму карбонатов и перевода слабоосновных групп в форму свободных оснований, включают карбонат натрия, бикарбонат натрия и гидроксид аммония.

После взаимодействия очищенного белкового экстракта с ионообменной смолой для связывания с ней изофлавонов белковый экстракт, очищенный от изофлавонов, выделяют со смолы и собирают, предпочтительно промывая смолу водным раствором, рН которого доведен до рН экстракта, и собирая элюат. В предпочтительном варианте осуществления по крайней мере большая часть белкового материала, содержащаяся в очищенном экстракте, собирается в составе элюата в виде белкового экстракта, свободного от изофлавонов. Более предпочтительно, чтобы в основном весь белковый материал, содержащийся в очищенном экстракте, был собран в элюате в виде белкового экстракта, свободного от изофлавонов. "В основном весь" означает по крайней мере 80%, и более предпочтительно по крайней мере 90%. При желании очищенный от изофлавонов белковый материал может быть выделен из экстракта с помощью распылительной сушки экстракта.

В предпочтительном варианте осуществления очищенный от изофлавонов белковый материал может быть осажден из собранного с ионообменника экстракта, содержащего очищенный от изофлавонов белок. Для осаждения белка рН экстракта доводят до примерно изоэлектрической точки белка. Если белок в экстракте является соевым белком, экстракт для осаждения белка может быть доведен до рН от примерно 4 до примерно 5. Осажденный белок может быть затем нейтрализован путем доведения рН экстракта, содержащего осажденный белок, до примерно рН 7. Осажденный белок, независимо от того, был ли он нейтрализован или нет, отделяют от жидкой фазы экстракта традиционными способами, предпочтительно фильтрованием или центрифугированием и декантацией жидкой фракции экстракта с осадка белка. Выделенный очищенный от изофлавонов белковый материал высушивают обычными способами, предпочтительно с помощью распылительной сушки.

После выделения с ионообменника экстракта, содержащего очищенный от изофлавонов белковый материал, изофлавоны выделяют с ионообменника и собирают со смолы предпочтительно элюированием со смолы растворителем, выбранным из метанола, этанола, пропанола, изопропилового спирта, изобутилового спирта, бутанола, этилацетата, ацетонитрила, ацетона, водных смесей перечисленных выше растворителей, метиленхлорида, хлороформа, четыреххлористого углерода или смеси любых из перечисленных выше растворителей. Содержащий изофлавоны элюат собирают. В предпочтительном варианте осуществления по крайней мере большую часть изофлавонов, содержащихся в очищенном экстракте, собирают с ионообменника в элюате, содержащем изофлавоны, и более предпочтительно, чтобы в основном все изофлавоны, содержащиеся в очищенном белковом экстракте, были собраны в элюате. "В основном все" означает по крайней мере 80%, и более предпочтительно по крайней мере 90%.

Изофлавоны могут быть выделены из содержащего изофлавоны элюата, собранного с ионообменника, путем концентрирования элюата, содержащего изофлавоны. В одном варианте осуществления элюат, содержащий изофлавоны, концентрировали в вакууме, при нагревании или с использованием и того и другого способов для удаления растворителя и получения остатка, представляющего собой концентрированные изофлавоны. В другом варианте осуществления элюат концентрировали в вакууме, при нагревании или с использованием и того и другого способов до примерно 10-25% исходного объема. Затем к концентрированному элюату добавляли по крайней мере равный объем воды, предпочтительно охлажденной до температуры от примерно 2^oС до примерно 15^oС, для осаждения изофлавонов. Осажденные изофлавоны можно затем выделить из смеси элюат/вода фильтрованием или центрифугированием.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изофлавоны в собранном элюате, содержащем изофлавоны, обрабатывают таким образом, чтобы в основном все изофлавоны в элюате представляли собой аглюконизофлавоны. Было установлено, что аглюконизофлавоны являются значительно более биологически активными с точки зрения их пользы для здоровья, чем их природные гликозиды или конъюгированные гликозиды, поэтому желательно выделить изофлавоны в форме их аглюконов. Аглюконизофлавоны также менее растворимы в воде, чем их гликозиды или конъюгированные гликозиды, поэтому аглюконизофлавоны легче выделить из элюата, содержащего изофлавоны.

Конъюгированные изофлавонгликозиды в содержащем изофлавоны элюате могут быть превращены в форму изофлавонгликозидов с помощью обработки содержащего изофлавоны элюата в течение определенного времени, при температуре и рН, эффективных для такого превращения. Интервал рН для превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды в содержащем изофлавоны элюате составляет от примерно рН 6 до примерно рН 13,5. Если это необходимо, рН содержащего изофлавоны элюата должно быть доведено до нужного значения подходящим основным или кислотным реагентом. Было установлено, что основания являются катализаторами превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды, поэтому наиболее предпочтительно использовать высокие рН для осуществления быстрого превращения. Наиболее предпочтительное рН для превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды составляет рН от примерно 9 до примерно 11.

Температурный интервал превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды в содержащем изофлавоны элюате составляет от примерно 2^oС до примерно 121^oС. Температурный интервал, в котором превращение идет быстро и эффективно, зависит от рН элюата, содержащего изофлавоны. Превращение протекает легко при более низких температурах, если рН элюата относительно высокое. Например, при рН порядка 11 превращение происходит быстро и эффективно в температурном интервале от примерно 5^oС до примерно 50^oС. При рН порядка 9 превращение протекает эффективно в температурном интервале от примерно 45^oС до примерно 75^oС. Когда рН содержащего изофлавоны элюата относительно низкое, превращение происходит при более высоких температурах. Например, при рН порядка 6 превращение протекает в температурном интервале от примерно 80^oС до примерно 121^oС. В наиболее предпочтительном варианте осуществления превращение осуществляют при рН порядка 11 и температуре порядка 35^oС.

Время, необходимое для осуществления превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды, зависит прежде всего от рН и температуры, используемых для осуществления превращения. Время превращения варьируется от примерно 15 мин до нескольких часов или больше. Превращение идет быстрее при более высоких рН и при более высокой температуре. В наиболее предпочтительном варианте осуществления в основном все конъюгированные изофлавонгликозиды превращаются в изофлавонгликозиды в течение примерно от 30 мин до примерно 1 ч при рН порядка 11 и температуре порядка 35^oС.

Предпочтительно после превращения конъюгированных изофлавонгликозидов в изофлавонгликозиды последние могут быть превращены в их соответствующие аглюконизофлавоны при взаимодействии изофлавонгликозидов в содержащем изофлавоны элюате с -глюкозидазой, ферментом, способным расщеплять 1,4-глюкозидные связи за некоторое время при выбранной температуре и рН. Такие ферменты могут быть выделены, например, из Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis и Khiyveromyces fragilis. Особенно предпочтительными коммерчески доступными ферментами, эффективными для превращения изофлавонгликозидов в форму аглюконизофлавонов, являются: биополигалактуроназа Biopectinase 100L (которую предпочтительно используют в интервале рН от примерно 3 до примерно 6), биополигалактуроназа Biopectinase 300L (оптимальное значение рН от примерно 3 до примерно 6), биополигалактуроназа Biopectinase OK 70L (оптимальное значение рН от примерно 3 до примерно 6), биолактаза Biolactase 30,000 (оптимальное значение рН от примерно 3 до примерно 6) и нейтральная лактаза Neutral Lactase (оптимальное значение рН от примерно 6 до примерно 8), все из них выпускаются Quest International, 1833 57th Street, Post Office Box 3917, Сарасота, Флорида 34243. Также особенно предпочтительными являются лактаза Lactase F (которую предпочтительно используют в интервале рН от примерно 4 до примерно 6), и лактаза Lactase 50,000 (оптимальное значение рН от примерно 4 до примерно 6), обе выпускаются Amano International Enzyme Co. , Inc., Post Office Box 1000, Троя, Вирджиния 22974. Другие особенно предпочтительные ферменты включают лактоэнзим Lactozyme 3000L (который предпочтительно используют в интервале рН от примерно 6 до примерно 8), и Alpha-Gal 600L (который предпочтительно используют при рН от примерно 4 до примерно 6,5), выпускаемые Novo Nordisk Bioindustrials, Inc. , 33 Turner Road, Данбари, Коннектикут 06813; Maxilact L2000 (который предпочтительно используют в интервале рН от примерно 4 до примерно 6), выпускаемый Gist Brocades Food Ingredients, Inc., King of Prussia, Пенсильвания, 19406; лактазу Neutral Lactase (которую предпочтительно используют в интервале рН от примерно 6 до примерно 8), выпускаемую Pfizer Food Science Group, 205 East 42nd Street, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10017; и Enzeco Fungal Lactase Concentrate (который предпочтительно используют в интервале рН от примерно 4 до примерно 6),выпускаемый Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10121.

Некоторые глюко-амилазы (глюкан-1,4--глюкозидазы) могут быть использованы вместо или в дополнение к перечисленным выше ферментам. Коммерчески доступной глюко-амилазой, влияющей на превращение, является G-Zyme G990 (которую предпочтительно используют в диапазоне рН от примерно 4 до примерно 6), выпускаемая Enzyme Development Corporation. Для того чтобы повлиять на превращение, предпочтительно, чтобы к содержащему изофлавоны элюату было добавлено от примерно 0,1% до примерно 10% ферментного материала по весу.

Диапазон рН для осуществления превращения изофлавонгликозидов в аглюкон изофлавоны в содержащем изофлавоны элюате составляет от примерно рН 3 до рН 9. Величина используемого рН зависит прежде всего от типа используемого фермента и должна быть выбрана соответственно Обычно ферменты активны либо в нейтральной области рН в интервале от примерно рН 6 до рН 8, либо в кислой области рН от примерно 3 до 6, рН элюата, содержащего изофлавоны, может быть доведено до нужного значения обычными кислотными и основными реагентами.

Температурный интервал для осуществления превращения изофлавонгликозидов в аглюконизофлавоны составляет от примерно 5^oС до примерно 75^oС. Температура существенно влияет на активность фермента и, следовательно, скорость превращения, причем повышение температуры увеличивает скорость превращения. Ферменты могут быть активны при температуре выше 70^oС, например Alpha-Gal 600L активен при 75^oС, однако предпочтительно проводить превращение при несколько более низких температурах, предпочтительно от примерно 50^oС до примерно 65^oС для того, чтобы избежать дезактивации фермента.

Время, необходимое для осуществления превращения изофлавонгликозидов в аглюконизофлавоны, зависит от факторов, связанных с ферментом, особенно от ферментативной активности и концентрации фермента, а также от температуры и рН системы. Предпочтительно, чтобы практически полное превращение изофлавонгликозидов в аглюкон изофлавоны протекало в течение 5 ч и более предпочтительно от примерно 1 до 2 ч.

Полученные в результате аглюконизофлавоны могут быть отделены от содержащего изофлавоны экстракта, как описано выше. Аглюконизофлавоны легче выделить из концентрированного изофлавонового элюата с помощью охлажденной воды, так как аглюкон изофлавоны менее растворимы в воде, чем их соответствующие конъюгированные изофлавонгликозиды или изофлавонгликозиды.

В рамках настоящего изобретения возможны различные изменения и дополнения, не изменяющие его по существу, которое определено формулой.