способ выделения рекомбинантного интерлейкина - 1 из биомассы микроорганизмов

Формула изобретения

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> ИЗ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий разрушение клеток штамма E.coli, продуцирующего рекомбинантный белок, отделение клеточных стенок и очистку целевого продукта многостадийной хроматографией с использованием на первой стадии катионита Солоза КГ 20 х 30, отличающийся тем, что разрушение клеток осуществляют щелочным агентом при рН 12 - 13, хроматографическую очистку проводят в три стадии, из которых одну осуществляют с использованием анионита Q - целлюлозы, а две - с применением катионита Солоза КГ 20 х 30, причем одну из двух стадий очистки на катионите проводят в присутствии сульфата аммония, а конечный продукт обессоливают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве щелочного агента используют раствор гидроокиси натрия.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что Q-целлюлозу используют на второй стадии хроматографической очистки, причем сорбцию интерлейкине-1 b ведут из (0,01 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатного буфера при рН 8,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, сорбент промывают тем же буфером, а белок элюируют повышением ионной силы буферного раствора до (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М при этом же значении рН.

4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что на первой стадии хроматографической очистки используют катионит Солозу КГ 20 х 30, причем сорбцию ведут из (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,02) М трисацетатного буфера с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, сорбент промывают тем же раствором, а целевой продукт элюируют (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М раствором триса.

5. Способ по пп.1 - 4, отличающийся тем, что третью стадию хроматографической очистки осуществляют на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, сорбцию ведут из раствора интерлейкина - 1 b, содержащего (2,2 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,1) М сульфата аммония, катионит промывают (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">0,002) М трисацетатным буфером, содержащим (2,2 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,1) М сульфата аммония, при том же рН, а белок элюируют повышением рН раствора до 7,9 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05.

6. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в неочищенный препарат интерлейкина-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> вводят сульфат аммония до концентрации (2,2 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,1) М, доводят рН до значения 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05 и наносят на сорбент Солоза КГ 20 х 30, уравновешенный (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, а после промывки сорбента (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетным буфером, содержащим (2,2 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,1) М сульфата аммония, белок элюируют (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,0002) М трисацетатным буфером с рН 7,9 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, содержащим (2,2 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,1) М сульфата аммония.

7. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что вторую стадию хроматографической очистки осуществляют на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, элюат, полученный на первой стадии, перед нанесением на сорбент подкисляют до рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, сорбент промывают (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, а белок элюируют (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М раствором триса.

8. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что на третьей стадии хроматографической очистки используют Q-целлюлозу, уравновешенную (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 9,5 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, на которую наносят элюат, полученный на второй стадии, сорбент промывают (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 9,5 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, а интерлейкин элюируют (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 8,0 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят на катионите Солоза КГ 20 х 30, уравновешенном (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М трисацетатным буфером с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, на который наносят элюат, полученный на третьей стадии хроматографической очистки и подкисленный до рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, сорбент промывают (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М раствором однозамещенного фосфата натрия с рН 4,1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,05, а белок элюируют (0,05 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,002) М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащим (0,15 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051006/177.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,01) М хлористого натрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения белков генноинженерным методом, а точнее к технологии получения высокоочищенного интерлейкина I- из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> (ИЛ-I из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">).

В настоящее время известны методы получения ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> из культуральной среды клеток человека путем многостадийной очистки.

Недостатками известных способов являются низкий выход целевого продукта, а также относительно невысокая активность.

Для решения проблемы получения значительных количеств ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> разработаны технологии его получения путем экспрессии гена в генах микроорганизма с последующим разрушением клеток и выделением конечного продукта.

Недостатками данных методов являются сложная технология, низкий выход цитокинов.

Известен способ получения ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> путем культивирования Е.coli, разрушения клеток осмотическим шоком и хроматографической очистки.

Недостатком способа является потеря N-концевого аланина у 50% молекул и относительно невысокая удельная активность 1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ единиц на мг белка.

Прототипом заявленного изобретения является способ получения рекомбинантного человеческого ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, разработанного авторами, который включает в себя экспрессию гена в клетки E.coli, культивирование, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, разрушение клеток ультразвуком, отделение клеточных стенок центрифугированием, осаждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином, удаление нуклеиновых кислот центрифугированием, осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осадка центрифугированием, растворение белкового осадка, диализ белкового раствора и последующую многостадийную очистку хроматографическими методами.

Очистка включает в себя ионообменную хроматографию белкового раствора на катионите Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 с последующим диализом элюата. Затем используют высокоэффективную жидкостную хроматографию с применением анионита DEAE-TSK-5РW.

Недостатками прототипа являются многостадийность, потери ИЛ- из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, относительно низкая удельная активность, необходимость перевода целевого продукта в физиологический буфер, вследствие чего метод не может быть использован в препаративных целях.

Задачей являлась разработка более технологического процесса, позволяющего получать целевой продукт с большим выходом и более высокой активностью.

Найдено, что технологию получения ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> можно существенно упростить, использовав выделение ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> из клеток обработкой щелочным агентом при pH 12-13, изменив хроматографическую очистку и введя стадию обессоливания. В качестве щелочного агента, как правило, используют гидроокись натрия, однако возможно использование других веществ основного характера.

Хроматографическая очистка включает двухстадийную хроматографию на Солозе КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 и одну стадию очистки на Q целлюлозе. Обессоливание проводится на Солозе КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30.

Технологически эффективны две последовательности стадий очистки, а именно на Солозе КГ 20*30 Q-целлюлозе Солозе КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 и Солозе КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 Солозе КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 Q-целлюлозе.

При первом варианте очистки хроматографический процесс проводится в следующих условиях: на первом этапе катионит уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюцию ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> осуществляют 0,050 + 0,002 М раствором трис(гидроксиметил)аминометана [трис] Затем продукт пропускают через анионит Q-целлюлоза, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 и элюируют ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> повышением ионной силы раствора до 0,050 + 0,002 М. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> сорбируют на катионит Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 в присутствии 2,2 + 0,1 М сульфата аммония при pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> повышением pH элюирующего раствора до 7,90 + 0,05.

При втором варианте на первой стадии катионит Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. В раствор ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> добавляют сульфат аммония до концентрации 2,2+ 0,1 М и наносят на катионит. Элюируют ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05. Элюат подкисляют до pH 4,10-0,05 и наносят на катионит Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 0,050 + 0,002 М раствором триса. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> сорбировали на анионит Q целлюлоза, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюируют 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05.

На стадии обессоливания ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 при pH 4,10 + 0,05 и после промывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 целевой продукт элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия, получив таким образом готовый продукт в физиологическом буфере.

Технический уровень заявленного изобретения определяется условиями оригинального процесса обработки клеток Е.coli щелочью, который ранее для подобных целей не применялся. В результате указанного процесса получается раствор, обогащенный ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> и не содержащий растворимых нуклеаз.

Благодаря этому полученная смесь после отделения нерастворимых продуктов стандартным методом (например, центрифугированием) может подвергаться более простой хроматографической очистке. В частности, удается исключить стадии обработки биомассы ультразвуком, осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином, сульфатаммонийного осаждения белкового осадка, диализа белкового раствора, многократных центрифугирований для отделения твердой фазы, использовать только два сорбента и получить готовый препарат в физиологическом буфере. Дополнительными элементами, доказывающими новизну и технический уровень данной технологии, является новая совокупность используемых сорбентов и условий очистки.

В результате использования заявляемого изобретения удается сократить число стадий с 13 до 7, повысить выход на 20% и удельную активность с 1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ до 1,6 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ ед/мг белка.

Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами, в которых использовались штамм Е.coli С 600, содержащий рекомбинантную плазмиду pFR-TGATG-IL-I из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, и промышленные ионообменники, разработанные в ГосНИИ особо чистых препаратов.

П р и м е р 1. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл 0,050 + 0,002 М трисацетатного буфера pH 8,0 + 0,1, содержащего 0,0020 + 0,0002 М PMSF и 0,0050 0,0005 М ЭДТА (лизисный буфер). Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. После этого суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и отделяли нерастворимые продукты центрифугированием в течение 20 2 мин со скоростью 10000 + 100 g и температуре 4 + 2^оС.

Супернатант разводили в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 0,05. После промывки катионита тем же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса.

Элюат подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 8,1, разводили дистиллированной водой в 2,5 раза до значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q целлюлоза объемом 150 + 10 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05.

К элюату добавляли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на катионит Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и с целью обессоливания наносили на катионит Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,1 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> составляла 1,6 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ единиц на мг белка (табл.1).

Для оценки биологической активности интерлейкина-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> использован метод костимуляции пpолиферации тимоцитов мышей. В качестве стандарта для определения единиц биологической активности интерлейкина-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> использован международный стандартный образец интерлейкина-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 86/680 (National Institute for Biological Standards and Control, England).

П р и м е р 2. В условиях примера I проводились эксперименты по проведению щелочной обработки при различных pH. Полученные результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 3. 600 + 20 г биомассы суспензировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + 100 g при 4 + 2^о.

Супернатант разбавляли в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,05 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,01 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050+ 0,002 М раствором триса.

В элюате подводили pH до значения 8,10 + 0,05 50 +1% раствором уксусной кислоты, разбавляли в 2,5 раза дистиллированной водой до получения значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q-целлюлоза объемом 150 + 5 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10-0,05. После промывки сорбента 0,020 + 0,002 М трис- ацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. В элюате растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + + 0,01 М, подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 4,10 + 0,05 и наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 50 + 2 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония. После отмывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,10 0,01 М раствором двузамещенного фосфата натрия.

Активность полученного препарата ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> соответствовала 1,3 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ единиц на мг белка.

П р и м е р 4. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали 45 + 1% раствором гидроокиси натрия при перемешивании до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + +100 g при 4 + 2^оС.

В супернатанте растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 м трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05.

В элюате подводили pH значения 4,10 + 0,05 50 + 1% раствором уксусной кислоты и наносили на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенную 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса, добиваясь таким образом и обессоливания препарата.

В элюате проверяли значение проводимости, которое не должно превышать 0,15 МСи/см, при необходимости подводили значение pH элюата до 9,50 + 0,05 и наносили на сорбент Q целлюлоза объемом 150 + + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и наносили с целью обессоливания на сорбент Солоза КГ 20 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051011/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> составляла 1,6 единиц на мг белка (табл.4).

Как показали приведенные эксперименты предложенная технология является оптимальной и позволяет получить целевой продукт, а именно высокоочищенный человеческий рекомбинантный интерлейкин с активностью 1,6 из биомассы микроорганизмов, патент № 2051922" SRC="/images/patents/421/2051003/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> 10⁸ единиц на мг белка в препаративных масштабах в 7 стадий вместо 13.