штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к jgg человека

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 566 Д, используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к Ig G человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G IgG человека, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к IgG человека [1, 4] . Отличительное свойство предложенных МКА заключается в способности преципитировать IgG человека. Это свойство позволяет использовать МКА данного штамма в различных реакциях иммунодиффузии для диагностики миеломной болезни, аутоиммунных и других заболеваний, сопровождающихся изменением количественных соотношений белковых фракций.

Для гидридомного слияния [1, 4] использовались клетки миеломной линии NS₁, которые в отличие от используемой Sp 2/0 Ag 14, синтезируют легкие цепи иммуноглобулинов, способные встраиваться в молекулы антител [2] , что может приводить к инактивации части антител [3] и соответственно снижать эффективность применения для иммуноферментного анализа.

Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности, способности связывать комплемент, цитотоксичности, гемагглютинирующим и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества МКА к IgG человека важно с научной и практической точки зрения.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующего преципитирующие МКА к IgG человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного из сыворотки крови больного миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCl рН 7,4 (РВS) с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели, но антиген вводят без адъюванта. Через 4 недели мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг IgG в PBS. Через 3 дня у животных определяют титр антител к IgG человека методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибродомы. Для этого 10⁸ клеток миеломы Sp 2/p Ag14 в присутствии 50% -ного раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10⁵ клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофагы мыши, которые высевают по 10⁴ клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-луночный планшет), высевая клеток на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к IgG человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают 2FIIEII.

Штамм 2FIIEII характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма - суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии ВAL B/c в дозе 1 млн. клеток на мышь.

Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на 50-250 мл. Посевная доза - 5 ^. 10⁵ клеток на 1 мл. Кратность рассева 1: 5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10^-4 М гипоксантина, 4 ^. 10^-7 М аминоптерина и 1,6 ^. 10^-5 М тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/0 Ag14 дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфе- разе. Клетки выращивают в атмосфере 5% СО₂ при 37^оС.

Культивирование в организме животного. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки (10⁷) вводят в брюшную полость мышей ВАL B/c, которым предварительно (за 7-10 сут) внутрибрюшинно инъецируют пристан. Время образования асцита 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта. МКА продуцируемые штаммом 2FIIEII, относятся к IgGI подклассу, специфически связывают IgG человека и в смеси с МКА гибридом 2НIIF9 или 3Н2Д2 преципитируют данный антиген. Принадлежность к подклассу IgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против IgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Способность к преципитации с IgG человека определяют методом иммуноферментного анализа.

Продуктивность штамма, стабильность продукции антител. Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования in vitro составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости 5 мг/мл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных.

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавление 10% диметилсульфоксида. Режи замораживания: сутки при -70^оС, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37^оС. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

П р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см² по 5 ^. 10⁵ клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37^оС в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий МКА к IgG человека, применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе: IgG дон, IgGI Куз, IgGI Мис, IgGI Гол, IgG2 Рыб, IgG2 Боб, , IgG2 б/н, IgG3 Дал, IgG4 Жел, IgG4 Бер, IgА, а также IgM, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гельфильтрацией, и папаиновые Fab-, Fc- фрагменты IgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночных планшетов. Инкубируют в течение 1 ч при 37^оС, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1% -ный раствор бычьего сывороточного альбумина (ВSA) на 1 ч при 37^оС. После окончания инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и РВS с 0,05% твином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37^оС. Через час содержимое лунок сливают, лунки промывают холодной водой и РВSТ, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой в разведении 1: 500 в растворе PBSТ и инкубируют при 37^оС 1 ч. После тщательного промывания в лунки вносят 0,4 мМ раствор субстрата - 2,2-азино-ди-3-этиленбензтиазолинсульфонат (6)] (АВTS) в 0,05 М Na-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,0-100% ), представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома 2FIIEII продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с IgG человека.

П р и м е р 2. На стеклянную пластину наливают 3% -ный раствор агара в РВS. Пробойником формируют лунки на расстоянии 0,6 см друг от друга. Асцитную жидкость штамма 2FIIEII, смешивают с асцитной жидкостью штамма 2НIIF9 или 3H2Д2 в соотношении 1: 1 и вносят в центральные лунки. В боковые лунки вносят IgG, IgA, IgM, BSA. Через 24 ч при взаимодействии IgG со смесью 2FIIEII с 2НIIF9 и со смесью 2FIIEII с 3Н2Д2 формируются полосы преципитации, которые не образуются в случае взаимодействия антител с IgA, IgM, BSA.

Таким образом, предложенный гибридный штамм продуцирует преципитирующие МКА, которые специфически взаимодействуют с IgG человека. Полученные антитела могут эффективно использоваться в биохимических и клинических исследованиях. (56) 1. Lowe I. , Bird P. , Hardie D. et al. I. Immunol. - 1982. - v. 47(2). - p. 221-396.

2. Milstein C. , Adetigbo K. , Cowan N. I. et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. - 1976. - v. 41. p. - p. 793.

3. Kohler O. , Howe S. C. , Milstein C. Eur. I. Immunol. - 1976. - v. 6, - p. 292.

4. Европейский патент N 0163141, кл. С 12 Р 21/00, 1985.