способ длительного хранения in vitro растений осины

Формула изобретения

1. Способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л, витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°C в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пригоден для хранения растений генетически модифицированной осины с рекомбинантными генами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству, и может быть использовано для беспересадочного хранения особо ценных и траснформированных клонов растений осины в условиях in vitro.

В современной биотехнологии сохранение in vitro культур растений используется для снижения затрат на пересадку трансгенных и нетрансгенных клонов, и для сохранения особо ценных генотипов. Наиболее приемлемым способом депонирования является хранение in vitro культур при положительных температурах (+4°C).

Осина (Populus tremula) и ее гибриды широко используются в биотехнологии как модель для изучения различных аспектов генетики лесных древесных растений по ряду причин: относительно небольшой размер генома и возможность его эффективной трансформации, быстрый рост, простота клонального микроразмножения и выращивания in vitro. В лесном хозяйстве осина начинает занимать приоритетное направление для использования в целлюлозно-бумажной промышленности и получении стройматериалов. Поэтому беспересадочное депонирование in vitro культур на длительный период рассматривается как способ сохранения растений, обладающих ценными свойствами.

Известно несколько способов хранения растений при положительных температурах, в частности известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент России № 2110172). Он включает перенос фрагментов растений длиной 10-12 мм на твердую питательную среду, в которую добавляют тонкоизмолотые зерна винограда. Возможность использования данного способа для других растений не описана и, очевидно, потребует дополнительных модификаций метода и финансовых затрат.

Известен также состав питательной среды для длительного хранения растений in vitro (патент России № 94011805). Новым в питательной среде является совместное введение в ее состав сорбита в концентрации 1-10 г/л и 6-бензиламинопурина в концентрации 0,1-1,0 мг/л. Влияние на культуру древесных растений, в частности осины, не оценивалось.

Наиболее близким техническим решением из описанных является «Effect of abscisic acid, cold hardening, and photoperiod on recovery of cryopreserved in vitro shoot tips of silver birch» (Ryynänen L. // Cryobiology, 1998, № 36, PP.32-39). В статье описывается методика предварительного кратковременного хранения перед криоконсервацией почек микрорастений березы серебристой. Для введения в состояние покоя использовалось добавление абсцизовой кислоты в концентрации 10^-6, 10^-5 и 10^-4 М в питательную среду для укоренения и хранения MS (Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962. 15 (3): P.473-497), а также изменялись условия инкубации - понижение температуры до +4°C и режим освещения (8 ч день/16 ч ночь). Однако при таких условиях растения долго не хранили, а лишь вводили в состояние покоя in vitro для последующих манипуляций. Пригодность метода введения в состояние покоя для других древесных растений в данной работе не оценивали.

Целью предлагаемого изобретения является повышение сохранности микрорастений осины в условиях in vitro при хранении на +4°C, без пересадок культур в течение 12 месяцев.

Поставленная цель достигается за счет того, что используются оптимальные концентрации минеральных и органических компонентов питательной среды и изменяется режим освещения (длительность и интенсивность).

Суть изобретения заключается в том, что для пассажа на укоренение и последующее хранение используют среду WPM (Lloyd G., McCown В., Commercially feasiblemicropropagation of mountain laural (Kalmla latlfolia) by use of shoot tip cultures. Ccmb Proc Intl Soc 1980. 30: PP.421-427.) с добавлением к легко метаболизируемой сахарозе (10-20 г/л) таких осмолитиков, как сорбитол (5-10 г/л) и маннитол (5-10 г/л), а также агар-агара (9 г/л) и витаминов MS 1 мл/л. После инкубации растений в течение 2 недель при интенсивном (примерно 5000 люкс) длиннодневном режиме освещения (16 ч день/8 ч ночь) при температуре +22°C растения переносятся в условия хранения на +4°C при пониженном освещении (примерно 2000 люкс) и режиме короткого дня (8 ч день/16 ч ночь). В результате использование осмолитиков в составе питательной среды и подбор правильного освещения во время хранения способствуют постепенному переходу растений в состояние покоя, что повышает до 100% их сохранность в течение года. Способ подходит для хранения in vitro культур осины как генетически модифицированных клонов, так и ценных селекционных генотипов, отобранных в природе.

Анализ известных способов хранения микрорастений трансгенной и нетрансгенной осины при температуре +4°C в условиях in vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения, как «новизна».

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда для укоренения и последующего хранения. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. Растворяются необходимые количества сахарозы, сорбитола и маннитола. После этого добавляется навеска агара. Среда разливается по колбам; автоклавирование проводится при 1 атм (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В охлажденную до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в ламинар-боксе в условиях стерильного воздуха. Число эксплантов в одном сосуде составляет 20 штук.

2. После переноса растительного материала на среду для укоренения и последующего хранения инкубацию побегов проводят 2 недели при интенсивном (5000 люкс) длиннодневном (16 ч день/8 ч ночь) режиме освещения, при температуре +22°C.

3. Укорененные микрорастения затем переносят в условия хранения. Режим освещения на протяжении всего периода хранения короткодневный - 8 часов «день», 16 часов «ночь», интенсивность освещения должна не превышать 2000 люкс. Температура хранения +4°C.

4. Пересадку верхушечной почки растений на среду для восстановления (WPM с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, гиббереллиновой кислоты 0,5 мг/л) необходимо провести через год депонирования. Восстановление осуществляется при длиннодневном режиме освещения 16 часов «день», 8 часов «ночь» интенсивностью 5000 люкс, при температуре +22°C. Процент выживания оценивается после 2 недель инкубации на среде для восстановления.

В таблицах 1-2 представлены результаты выживаемости растений осины в зависимости от условий хранения. Для подтверждения неочевидности представленного изобретения нами был проведены исследования роли каждого из основополагающих, по нашему мнению, факторов для хранения культуры осины in vitro (таблица 1).

Для сравнения была использована методика кратковременного хранения, предложенная Ryynänen L. (1998). Показано, что абсцизовая кислота действительно ускоряет процесс перехода в состояние покоя, но после переноса на среду для восстановления образуются витрифицированные побеги с измененной формой листа, что не происходит при использовании разработанного нами способа (таблица 2).

Данный способ хранения подходит как для растений дикого типа, так и для трансформированных растений осины. Было проведено хранение разных нетрансформированных генотипов осины (Pt, f2, PtV22) и трансгенных растений осины с разными рекомбинантными генами (GFP, Gus, Bar, Xeg, GS). Сохранность и трансгенных, и нетрансгенных клонов всех генотипов после года хранения составляла 100% (таблица 3). Сохранение экспрессии рекомбинантных генов в трансгенных растениях осины после года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь подтверждено методом ОТ-ПЦР (рисунок 1).

Преимуществом предложенного способа хранения при температуре +4°C является сохранение параметров микрорастений и увеличение доли жизнеспособных эксплантов (микрорастений) после хранения.

Предложенный способ хранения при температуре +4°C не является затратным, так как требует лишь добавления осмолитиков и инкубации при разработанных режимах освещения. Поэтому способ может быть успешно использован для научных исследований, сохранения ценных генотипов осины или при производстве посадочного материала растений в лесном хозяйстве.

Таблица 1
Процент выживших растений осины при разных условиях инкубации после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C
Опыт	Состав сахаров в питательной среде (г/л)	Интенсивность освещения (люкс)	Режим освещения (день/ночь)	Выживание после хранения (%)
				1 мес	6 мес	12 мес
1	сахароза - 30	5000	16/8	42	0	0
2	сахароза - 15	5000	16/8	56	0	0
	сорбитол - 7,5
	маннитол - 7,5
3	сахароза - 15	2000	16/8	73	0	0
	сорбитол - 7,5
	маннитол - 7,5
4	сахароза - 15	2000	12/12	100	57	0
	сорбитол - 7,5
	маннитол - 7,5
5	сахароза - 15	2000	8/16	100	100	100
	сорбитол - 7,5
	маннитол - 7,5

Таблица 2
Процент выживших растений осины при добавлении в среду разных концентраций абсцизовой кислоты (АВА) и менее усвояемых сахаров после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь
Опыт	Концентрация АВА, М	Выживание после хранения (%)
		1 мес	6 мес	12 мес
1	10-4	100	24*	0
2	10 -5	100	100	62*
3	10-6	100	100	100*
4	0	100	100	100
* - образование витрифицированных побегов с измененной формой листа

Таблица 3
Процент выживших растений осины разных генотипов при добавлении в среду менее усвояемых сахаров после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь
Название клонов	Количество посажанных растений	Выживание после хранения (%)
		1 мес	6 мес	12 мес
Pt	200	100	100	100
f2	200	100	100	100
PtV22	200	100	100	100
Pt III GFP 3с*	200	100	100	100
Pt III GFP 5b*	200	100	100	100
Pt III GFP 5c*	200	100	100	100
f2 VII Gus 1a*	200	100	100	100
f2 VII Gus 1b*	200	100	100	100
Pt I Gus 5a*	200	100	100	100
Pt V Gus 2c*	200	100	100	100
PtV22 V Gus 14a*	200	100	100	100
f2 XI Bar 2a*	200	100	100	100
Pt XI Bar 24a*	200	100	100	100
PtXIV Xeg 1a*	200	100	100	100
PtXIV Xeg 1b*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 1a*	200	100	100	100
PtXVXeg 2b*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 3a*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 3b*	200	100	100	100
PtXVXeg 4a*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 4c*	200	100	100	100
PtXVXeg 5a*	200	100	100	100
PtXVI Xeg 5c*	200	100	100	100
* трансгенные клоны осины с рекомбинантными генами GFP, Gus, Bar, Xeg, полученные на основе растений дикого типа генотипов Pt, f2, PtV22.