закрытый контейнер, содержащий активированный полипептид фактора vii, способы его получения и набор и способ применения набора

Формула изобретения

1. Закрытый контейнер, содержащий композицию активированного полипептида фактора VII (1), причем указанный контейнер содержит активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера, причем активированный полипептид фактора VII получается согласно способу по пп.22-27.

2. Контейнер по п.1, который содержит от более чем 10 до 25 мг активированного полипептида фактора VII на 1 мл объема контейнера.

3. Контейнер по п.1, где активированный полипептид фактора VII находится в водном растворе.

4. Контейнер по п.3, где раствор представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, в особенности готовую к применению фармацевтическую композицию.

5. Контейнер по п.3, где раствор имеет рН в интервале 5,0-7,0.

6. Контейнер по п.5, где раствор содержит буферный агент (2).

7. Контейнер по п.3, где раствор, кроме того, содержит один или более стабилизирующих агентов (3).

8. Контейнер по п.3, где водный раствор содержит один или более модификаторов ионной силы (4).

9. Контейнер по п.3, где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 200 мМ.

10. Контейнер по п.3, где водный раствор имеет концентрацию активированного полипептида фактора VII более 10 мг/мл.

11. Контейнер по п.3, где водный раствор содержит:

по меньшей мере более чем 10 мг на 1 мл объема контейнера активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

12. Контейнер по п.3, где водный раствор содержит:

по меньшей мере более чем 10 мг/мл активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент (3а), выбранный из солей кальция, в концентрации в пределах по меньшей мере 15 мМ;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

13. Контейнер по п.3, где водный раствор содержит:

по меньшей мере более чем 10 мг/мл активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент на основе двухвалентного металла первого переходного периода (3б), где молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3б) и полипептидом FVII составляет больше 0,5;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

14. Контейнер по п.3, где водный раствор содержит:

по меньшей мере более чем 10 мг/мл активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент бензамидин / аргинин-типа (3в), где молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3в) и полипептидом FVII составляет больше 0,1;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

15. Контейнер по п.1, где композиция имеет содержание влаги не более чем приблизительно 3%.

16. Контейнер по п.15, где композиция находится в лиофилизированной форме.

17. Контейнер по п.16, где композиция содержит по меньшей мере один стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из а) комбинации антиоксиданта и маннита; б) комбинации метионина и полиола; в) комбинации сахарида и маннита; г) комбинации сахарозы и полиола и д) метионина.

18. Контейнер по любому из пп.15-17, который после восстановления композиции с водным раствором дает контейнер по любому из пп.3-14.

19. Контейнер по п.1, который имеет по меньшей мере два отделения, где первое отделение содержит активированный полипептид фактора VII.

20. Контейнер по п.19, где активированный полипептид фактора VII первого отделения находится в лиофилизированной форме, и второе отделение содержит водный растворитель для указанного активированного полипептида фактора VII.

21. Контейнер по п.19, где активированный полипептид фактора VII первого отделения находится в водном растворе, и второе отделение содержит водный растворитель для указанного активированного полипептида фактора VII.

22. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) соединяют раствор, содержащий полипептид фактора VII, с анионообменным материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанного полипептида фактора VII с указанным анионообменным материалом;

(б) промывают указанный анионообменный материал промывным буфером, имеющим рН в интервале 5,5-7,0, или альтернативно в интервале 8,5-9,5 в присутствии 1-7 мМ Са ²⁺; и

(в) элюируют указанный анионообменный материал с элюирующим буфером, имеющим рН в интервале 3,0-7,0, и собирают элюат активированного полипептида фактора VII;

(г) загружают по меньшей мере часть элюата в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют элюат; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

23. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) соединяют раствор, содержащий полипептид фактора VII, с анионообменным материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанного полипептида фактора VII с указанным анионообменным материалом, поддерживая рН раствора при приблизительно 5,5-7,0, или альтернативно в интервале 8,5-9,5 в присутствии 1-7 мМ Са²⁺;

(б) возможно промывают указанный анионообменный материал промывным буфером, сохраняя в процессе ионную силу при 40-250 мМ;

(в) элюируют указанный анионообменный материал, увеличивая концентрацию кальция и/или ионную силу (например NaCl) в процессе элюирования и/или уменьшая рН в процессе элюирования, и собирают элюат активированного полипептида фактора VII;

(г) загружают по меньшей мере часть элюата в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют элюат; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

24. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) соединяют раствор, содержащий полипептид фактора VII, с гидроксиапатитовым материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанного полипептида фактора VII с указанным гидроксиапатитовым материалом;

(б) возможно промывают указанный гидроксиапатитовый материал промывным буфером;

(в) элюируют указанный гидроксиапатитовый материал с элюирующим буфером, имеющим рН в интервале 5,5-7,0, и собирают элюат активированного полипептида фактора VII;

(г) загружают по меньшей мере часть элюата в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют элюат; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

25. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) объединяют насыщенный раствор сульфата аммония с раствором, содержащим полипептид фактора VII, чтобы облегчить осаждение полипептида фактора VII;

(б) повторно растворяют выпавший в осадок полипептид фактора VII в водном растворителе, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(в) возможно обессоливают указанный концентрированный раствор;

(г) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют раствор; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

26. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) подвергают раствор, содержащий полипептид фактора VII, ультрафильтрации и/или диафильтрации, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(б) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(в) возможно лиофилизируют раствор; и

(г) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

27. Способ получения активированного полипептида фактора VII в закрытом контейнере, включающий стадии, при которых:

(а) лиофилизируют раствор, содержащий полипептид фактора VII, чтобы получить композицию полипептида фактора VII, имеющую содержание влаги не более чем приблизительно 3%;

(б) повторно растворяют лиофилизированный полипептид фактора VII в водном растворителе, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(в) возможно обессоливают указанный концентрированный раствор;

(г) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

28. Набор, включающий (1) закрытый первый контейнер, содержащий твердую фармацевтическую композицию активированного полипептида фактора VII, и (2) второй контейнер, содержащий жидкий водный растворитель для указанной твердой фармацевтической композиции, где первый контейнер включает композицию, содержащую активированный полипептид фактора VII в диапазоне от более чем 10 до 90 мг на 1 мл объема первого контейнера.

29. Набор по п.28, где первый контейнер и второй контейнер расположены в виде карпулы, где одно отделение соответствует первому контейнеру и другое смежное отделение соответствует второму контейнеру.

30. Способ получения готовой к применению жидкой водной фармацевтической композиции активированного полипептида фактора VII из набора, как определено в любом из пп.28-29, при котором смешивают твердую фармацевтическую композицию первого контейнера с по меньшей мере фракцией жидкого водного растворителя второго контейнера, чтобы образовалась готовая к применению жидкая водная фармацевтическая композиция активированного полипептида фактора VII.

31. Способ по п.30, где по существу весь жидкий водный растворитель второго контейнера смешивают с твердой фармацевтической композицией первого контейнера.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к закрытому контейнеру, содержащему композицию активированного полипептида фактора VII в количестве в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера. Изобретение также относится к разным способам получения подобных закрытых контейнеров, набору, включающему подобные контейнеры, и способу применения этого набора.

Предшествующий уровень техники

Доказано, что фактор VII, который вовлечен в систему свертывания крови, является полезным терапевтическим агентом при лечении ряда патологических состояний. Таким образом, существует увеличивающаяся потребность в препаратах, содержащих активированные полипептиды фактора VII, которые являются фармацевтически приемлемыми и проявляют постоянную и предопределенную клиническую эффективность. Для определенных терапевтических применений необходимо вводить довольно большое количество активированного полипептида фактора VII, например порядка 40 мкг/кг веса тела или даже больше.

Общепринятая имеющаяся в продаже композиция полученного рекомбинантным путем полипептида фактора VII НовоСэвен® (NovoSeven®, Novo Nordisk A/S, Дания) представлена, например, в виде флакона (объем контейнера около 3,0 мл), содержащего 1,2 мг рекомбинантного фактора VIIa человека, 5,84 мг NaCl, 2,94 мг CaCl₂×2H₂O, 2,64 мг GlyGly, 0,14 мг полисорбата 80 и 60,0 мг маннита. Данный продукт перед применением восстанавливают 2,0 мл воды для инъекций (WFI) до рН 5,5, таким образом получая концентрацию полипептида фактора VII приблизительно 0,6 мг/мл.

Для терапевтических применений, когда необходимо вводить большие количества (например, 10-20 мг) активированного полипептида фактора VII (например, полученного рекомбинантным путем фактора VIIa человека), неудобно использовать препарат, подобный композиции НовоСэвен®, так как требуется вводить довольно большой объем (например, 15-30 мл), обычно путем инъекции.

Таким образом, существует потребность в жидких фармацевтических продуктах, а также высушенных сублимацией фармацевтических продуктах для последующего восстановления, содержащих активированный полипептид фактора VII, в которых относительно большое количество активированного полипептида фактора VII находится в определенном объеме контейнера, в результате чего объем, который вводят, в основном в ходе инъекции, причиняет минимум неудобства для конечного потребителя.

WO 03/055512 А1 раскрывает жидкую водную композицию, содержащую (1) полипептид фактора VII; (2) агент, пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0; (3) агент, выбранный из списка: соль кальция, соль магния или их смесь; где концентрация (3) составляет по меньшей мере 15 мМ. По-видимому, изобретение, раскрытое в этой международной патентной заявке, применимо для полипептидов фактора VII в разных концентрационных диапазонах, включая интервал концентраций от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл.

WO 2004/000347 А1 раскрывает между прочим композицию, которая при растворении в воде содержит полипептид фактора VII (от 0,6 до 10 мг/мл), хлорид кальция (от 5 до 20 мМ), NaCl (0-50 мМ), глицилглицин (0-15 мМ), L-гистидин (0-20 мМ), маннит (20-40 мг/мл), сахарозу (5-20 мг/мл), метионин (0-1 мг/мл), полоксамер 188 (0,5-3 мг/мл) при рН в пределах от 5,0 до 7,0.

WO 2004/082708 А1 раскрывает жидкую водную фармацевтическую композицию, содержащую полипептид фактора VII (0,1-10 мг/мл) и буферный агент, пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0; где молярное отношение не связанных в комплекс ионов кальция (Са ²⁺) к полипептиду фактора VII составляет меньше 0,5.

WO 2004/112828 А1 раскрывает жидкую водную композицию, содержащую (1) полипептид фактора VII; (2) агент, пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0; (3) агент, выбранный из списка: соль кальция, соль магния или их смесь; где концентрация (3) составляет менее 15 мМ; и (4) модификатор ионной силы; где ионная сила композиции составляет по меньшей мере 200 мМ. По-видимому, изобретение, раскрытое в международной патентной заявке, применимо для полипептидов фактора VII в разных концентрационных диапазонах, включая интервал концентраций от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл.

WO 2005/016365 A1 раскрывает жидкую водную фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере 0,01 мг/мл полипептида фактора VII (1); буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0, и по меньшей мере один стабилизирующий агент (3), включающий фрагмент -C(=N-Z ¹-R¹)-NH-Z²-R² (например, бензамидин или аргинин). По-видимому, изобретение, раскрытое в международной патентной заявке, применимо для полипептидов фактора VII в разных концентрационных диапазонах, включая интервал концентраций 0,01-20 мг/мл.

Несмотря на то что некоторые предшествующие патентные заявки заявителя охватывают возможность применения соответствующего изобретения для жидких растворов полипептида фактора VII в довольно широком диапазоне концентраций, в их демонстрационных примерах не исследовали верхнюю область таких пределов концентраций, также ни в одной предшествующей патентной заявке не раскрыт или предвосхищен закрытый контейнер, содержащий относительно большое количество активированного полипептида фактора VII. Считается, что это обусловлено общепринятым суждением, что степень расщепления полипептида фактора VII, в частности расщепления тяжелой цепи, будет существенно увеличиваться с увеличением концентрации полипептида фактора VII независимо от общих мер, применяемых с целью уменьшить автокаталитическое расщепление активированного полипептида фактора VII, и что высокая степень расщепления будет давать продукты, которые будут неприемлемы для большинства терапевтических применений.

Кроме того, считается, что то обстоятельство, что промышленный продукт предшествующего уровня техники содержит относительно большие количества кальция, может стать неразрешимым, когда будут необходимы большие количества активного компонента (полипептида фактора VII) для лечения особых состояний. Поэтому большие количества кальция могут потребовать высокие концентрации полипептида фактора VII в маленьком объеме.

Для того чтобы получить закрытый контейнер с высоким содержанием активированного полипептида фактора VII на единицу объема контейнера, требуется высококонцентрированный раствор очищенного активированного полипептида фактора VII, который можно дозировать в контейнер. До настоящего времени это считалось затруднительным или даже невозможным, так как активированный полипептид фактора VII представляет собой сериновую протеазу, которая обладает аутопротеолитической активностью, что означает, что белок катализирует свое расщепление (см., например, "The Use of RP-HPLC for measuring activation and cleavage of rFVIIa during purification" (Использование ОФ-ВЭЖХ для измерения возбуждения и расщепления rFVIIa в процессе очистки), 1. Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng., том 48 (1995), 501-505 и "Studies on coagulation factor VIIa autoproteolysis and formation of degradation products" (Исследования аутопротеолиза коагулирующего фактора VIIa и образования продуктов расщепления), Т.В.Hansen et al., доклад представлен в ACS (2003)). Разрушение происходит в результате расщепления на С-концевой стороне Lys38, Arg290 и Arg315. В ходе расщепления белок ослабляет свою кровоостанавливающую функцию и таким образом свой терапевтический эффект. Скорость расщепления пропорциональна концентрации активированного полипептида фактора VII во втором порядке, как указано ниже:

-d[FVIIa]/dt=k[FVIIa] ²,

где [FVIIa] представляет собой концентрацию активированного полипептида фактора VII.

Это означает, что если концентрацию активированного полипептида фактора VII увеличить, например, в 10 раз, то скорость расщепления, как ожидается, увеличится в 100 раз.

Другая сложность концентрирования активированного полипептида фактора VII заключается в его растворимости, это означает, что активированный полипептид фактора VII начнет выпадать в осадок, когда достигнет определенной концентрации в том или ином буфере.

Краткое описание изобретения

В настоящее время данные изобретатели неожиданно обнаружили, что действительно возможно получить подходящий фармацевтический продукт (например, флакон, карпулу и т.п.) с соответствующим большим количеством активированного полипептида фактора VII, поскольку степень автокаталитического расщепления, в особенности расщепления тяжелой цепи, активированных полипептидов фактора VII можно уменьшить при соответствующем подборе условий, и что степень расщепления будет ниже ожидаемой.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к закрытому контейнеру, включающему композицию активированного полипептида фактора VII (1), к указанному контейнеру, содержащему активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способам получения закрытого контейнера, содержащего активированный полипептид фактора VII.

Третий аспект настоящего изобретения относится к набору, включающему (1) закрытый первый контейнер, содержащий твердую фармацевтическую композицию активированного полипептида фактора VII, и (2) второй контейнер, содержащий жидкий водный растворитель для указанной твердой фармацевтической композиции, где первый контейнер включает композицию, содержащую активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема первого контейнера.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу получения готовой к применению жидкой водной фармацевтической композиции активированного полипептида фактора VII из набора, как определено здесь, к способу, в ходе которого смешивают твердую фармацевтическую композицию первого контейнера с по меньшей мере фракцией жидкого водного растворителя второго контейнера, чтобы получить готовую к применению жидкую водную фармацевтическую композицию активированного полипептида фактора VII.

Чертёж показывает оптическую плотность ОП ₆₀₀ как функцию концентрации FVIIa (мг/мл).

Подробное описание изобретения

Как упоминалось выше, по настоящему изобретению предложен закрытый контейнер, включающий композицию активированного полипептида фактора VII (1), указанный контейнер, содержащий активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера.

Термин «закрытый» означает, что содержимое контейнера отделено от внешней среды. Таким образом, контейнер обычно создается так, чтобы необходимо было сломать пломбу или необходимо было удалить крышку перед тем, как содержимое контейнера станет доступно. В предпочтительных воплощениях контейнер является водо- и газонепроницаемым, например контейнер является также воздухонепроницаемым, чтобы воздух и влага не могли проникнуть внутрь контейнера и тем самым вызвать разрушение содержимого. Свободный объем контейнера может быть заполнен инертным газом. Инертный газ можно выбрать из группы, состоящей из азота, аргона и т.п.

Контейнер (например, флакон, карпулу или картридж (такой как карпула или картридж для ручки-аппликатора)) обычно изготавливают из стекла или пластмассы, в особенности стекла, возможно закрывают резиновой прокладкой или другими закрывающими устройствами, позволяющими проникнуть внутрь с сохранением целостности фармацевтической композиции. В одном воплощении контейнер представляет собой флакон, карпулу или картридж, помещенный в запечатанный пакет, например запечатанный пластиковый пакет, такой как ламинированный (например, покрытый металлом (таким как алюминий) пластиковый пакет). В интересном варианте материал внутренней стенки контейнера выбран из стекла с кремниевым покрытием, стекла с силиконовым покрытием, полимеров нециклических олефинов, циклоолефиновых полимеров и сополимеров циклоолефинов / линейных олефинов, например, как раскрыто в более ранней заявке заявителя WO 2004/103398.

При использовании здесь термин «продукт» относится к контейнеру, включающему композицию активированного полипептида фактора VII. То есть термин «продукт» обычно является имеющимся в продаже продуктом, таким как флакон, карпула или картридж, содержащий композицию активированного полипептида фактора VII.

Термин «композиция» относится к твердой или жидкой смеси, которая включает активированный полипептид фактора VII и возможно одну или более добавок, например буферы, стабилизирующие агенты, модификаторы тоничности и т.п. (см. ниже).

Активированный полипептид фактора VII является таким, как определено ниже.

Предполагают, что термин «мл объема контейнера» относится к внутреннему объему рассматриваемого контейнера, выраженному в миллилитрах (мл), то есть к объему пространства контейнера, где находится полипептид фактора VII. Объем закрытого (например, запечатанного) контейнера можно определить наиболее точно, как объем свободного пространства соответствующего закрытого и пустого контейнера, то есть объем контейнера, не занятый пробкой, пломбой или подобным. Например, общепринятая имеющаяся в продаже композиция полученного рекомбинантным путем полипептида фактора VII НовоСэвен® (Novo Nordisk A/S, Дания) выпускается в виде флаконов трех разных размеров, (1) 4,3 мл ± 0,5 мл объема, (2) 7,1 мл ± 0,5 мл объема и (3) 13,5 мл ± 1,0 мл объема. В этих флаконах пробки занимают 0,44 мл объема контейнера, то есть свободное пространство соответствующих закрытых и пустых контейнеров составляет (1) 3,86 мл ± 0,5 мл, (2) 6,66 мл ± 0,5 мл и (3) 13,06 мл ± 1,0 мл.

Контейнер обычно содержит активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг, например в диапазоне 2,5-75 мг или в диапазоне 4-90 мг, на 1 мл объема контейнера. В некоторых воплощениях контейнер содержит 4-60 мг на 1 мл объема, например 4-50 мг на 1 мл объема, или 5-25 мг на 1 мл объема, или 6-15 мг на 1 мл объема. В других воплощениях контейнер содержит 2,5-60 мг на 1 мл объема, например 2,5-50 мг на 1 мл объема, или 2,5-40 мг на 1 мл объема, или 2,5-30 мг на 1 мл объема. Для некоторых терапевтических применений контейнер может содержать 4-15 мг на 1 мл объема, или 6-40 мг на 1 мл объема, или 10-30 мг на 1 мл объема, или 25-60 мг на 1 мл объема.

Композиция активированного полипептида фактора VII может находиться либо в солюбилизированной форме, например в виде водного раствора или суспензии, либо в сухой форме, например в лиофилизированной форме.

Композиция в солюбилизированной форме

В одном воплощении активированный полипептид фактора VII находится в солюбилизированной форме, например в водном растворе. Предпочтительно водный раствор активированного полипептида фактора VII представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, в частности готовую к применению фармацевтическую композицию активированного полипептида фактора VII.

Под термином «водный раствор» понимают, что активированный полипептид фактора VII солюбилизирован в растворителе, который главным образом состоит из воды, то есть органические растворители составляют самое большее 5%, в частности самое большее 2%, композиции.

Чтобы сделать водный раствор пригодным для непосредственного парентерального введения млекопитающему, такому как человек, обычно требуется, чтобы значение рН композиции поддерживалось в приемлемых пределах, таких как от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0. Для того чтобы обеспечить подходящее значение рН при данных условиях, фармацевтическая композиция обычно содержит буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0. С дополнительной целью сделать водный раствор более стабильным при хранении и манипуляциях, раствор предпочтительно имеет рН в интервале 5,0-7,0. Предпочтительно рН находится в интервале 5,8-6,5 или в интервале 5,5-6,2, с особым предпочтением для рН в интервале 5,8-6,2.

Термин «буферный агент» охватывает те агенты или комбинации агентов, которые поддерживают рН раствора в приемлемом диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0, в частности от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5, например в диапазоне 5,8-6,5 или в диапазоне 5,5-6,2, в особенности в диапазоне 5,8-6,2. В одном воплощении рН композиции сохраняется от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,5, или от приблизительно 5,7 до приблизительно 6,2, или от приблизительно 5,2 до приблизительно 5,7.

В одном воплощении буферный агент (2) представляет собой по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из кислот и солей MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, гистидина, имидазола, глицина, глицилглицина, глицинамида, фосфорной кислоты, уксусной кислоты (например, ацетата натрия или кальция), молочной кислоты, глутаровой кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты и янтарной кислоты. Следует понимать, что буферный агент может включать смесь двух или более компонентов, где смесь будет обеспечивать значение рН в установленном диапазоне. В качестве примеров можно привести уксусную кислоту и ацетат натрия и т.п.

Концентрацию буферного агента выбирают таким образом, чтобы поддерживать предпочтительный рН раствора. В разных воплощениях концентрация буферного агента находится в интервале 1-100 мМ, в интервале 1-50 мМ, в интервале 1-25 мМ или в интервале 2-20 мМ.

В дополнение к трем обязательным компонентам (полипептид FVII, растворитель, буферный агент) жидкая водная фармацевтическая композиция может содержать дополнительные компоненты, полезные для получения, разработки, стабильности или введения композиции.

Для того чтобы улучшить стабильность водного раствора, также возможно включить один или более стабилизирующих агентов (3), например один или более стабилизирующих агентов, выбранных из солей кальция и солей магния (3а); и/или один или более стабилизирующих агентов на основе двухвалентного металла первого переходного периода (3б), где указанный металл выбран из группы, состоящей из металлов первого переходного периода в степени окисления +II, за исключением цинка; и/или один или более стабилизирующих агентов (3в), содержащих фрагмент-C(=N-Z ¹-R¹)-NH-Z²-R², где Z ¹ и Z² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -NR⁴- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C _1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R ² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или Z² и R ² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹ -R¹ образует часть гетероциклического кольца, или Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z² -R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z ¹-R¹-R²-Z²- является бирадикалом.

Соли кальция и соли магния (3а)

В одном воплощении стабилизирующий агент включает по меньшей мере один агент, выбранный из солей кальция и солей магния, в особенности из солей кальция.

Примерами солей кальция являются хлорид кальция, ацетат кальция, глюконат кальция, левулинат кальция или их смесь.

Примерами солей магния являются хлорид магния, ацетат магния, сульфат магния, глюконат магния, левулинат магния, магниевые соли сильных кислот или их смесь.

Концентрация (3а) в водном растворе предпочтительно составляет по меньшей мере 15 мМ, например по меньшей мере 25 мМ, так по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 200 мМ, по меньшей мере 400 мМ или по меньшей мере 800 мМ.

В предпочтительных воплощениях стабилизирующий агент (3а) выбран из хлорида кальция, ацетата кальция, хлорида магния, ацетата магния, сульфата магния или их смеси; и модификатором ионной силы (4) является хлорид натрия или смесь хлорида натрия и по меньшей мере одного дополнительного модификатора ионной силы (кроме того см. ниже).

Стабилизирующий агент на основе двухвалентного металла первого переходного периода (3б)

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) включает по меньшей мере один металлсодержащий агент (3б), где указанный металл выбран из группы, состоящей из металлов первого переходного периода в степени окисления +II.

Предполагают, что при использовании здесь термин «металлы первого переходного периода в степени окисления +II» охватывает титан, ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, никель и медь.

Несмотря на то что титан и ванадий могут находиться в водных средах в степени окисления +II, обычно выбирают металл(ы) из хрома, марганца, железа, кобальта, никеля и меди. Иллюстрирующими примерами металлсодержащих агентов (3б), соответствующих этим металлам, являются хлорид хрома (II), хлорид марганца (II), хлорид железа (II), хлорид кобальта (II), хлорид никеля (II) и хлорид меди (II). Следует понимать, что металлсодержащий агент (3б) может включать два или более металлов, например два или более металлов первого переходного периода. Таким образом, в некоторых случаях два или более вышеупомянутых агентов можно использовать в комбинации.

Пока самыми многообещающими металлами являются медь и марганец. Иллюстрирующими примерами соответствующих металлсодержащих агентов (3б) являются хлорид меди (II) и хлорид марганца (II).

Концентрация металлсодержащего агента (или агентов) (3б) обычно составляет по меньшей мере 1 мкМ. Желательная (или необходимая) концентрация обычно зависит от выбранного металлсодержащего агента (или агентов), точнее от сродства к связыванию выбранного металла в степени окисления +II с полипептидом фактора VII.

В разных воплощениях металлсодержащий агент (3б) находится в концентрации по меньшей мере 5 мкМ, по меньшей мере 25 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 200 мкМ, по меньшей мере 400 мкМ, по меньшей мере 500 мкМ, по меньшей мере 800 мкМ, по меньшей мере 900 мкМ, по меньшей мере 1000 мкМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 200 мМ, по меньшей мере 400 мМ, по меньшей мере 800 мМ, по меньшей мере 900 мМ или по меньшей мере 1000 мМ.

В разных воплощениях молярное соотношение между металлсодержащим агентом (3) (Ме2+) и полипептидом FVII (агент (3б): FVII) составляет больше 0,5, больше 1, больше 2, больше 4, больше 5, больше 10, больше 25, больше 100, больше 150, так, например, в интервале 0,5-250, таком как 0,5-150, 0,5-100, 0,5-25,1-250,1-100, 1-25, 1-10.

В одном конкретном воплощении металлом металлсодержащего агента (3б) является медь, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 5 мкМ, например по меньшей мере 10 мкМ или по меньшей мере 15 мкМ.

В другом конкретном воплощении металлом металлсодержащего агента (3б) является марганец, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 100 мкМ, например по меньшей мере 500 мкМ или по меньшей мере 1 мМ.

Стабилизирующий агент бензамидин / аргинин-типа (3в)

В еще другом воплощении стабилизирующий агент включает по меньшей мере один агент (3в), содержащий фрагмент -C(=N-Z¹-R¹ )-NH-Z²-R², где Z¹ и Z² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -О-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или Z² и R² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или -C(=N-Z¹-R ¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z ² - является бирадикалом.

Полагают, что термин «С_1-6-алкил» охватывает ациклические и циклические насыщенные углеводородные остатки, которые имеют 1-6 углеродных атомов и которые могут быть линейными или разветвленными. Конкретными примерами являются метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, циклопропилметил, н-пентил, изопентил, н-гексил и т.п. Подобным образом термин «C_1-4-алкил» охватывает ациклические и циклические насыщенные углеводородные остатки, которые имеют 1-4 углеродных атомов и которые могут быть линейными или разветвленными.

Также полагают, что термин «С_2-6-алкенил» охватывает ациклические и циклические углеводородные остатки, которые имеют 2-6 углеродных атомов и содержат одну ненасыщенную связь, которые могут быть линейными или разветвленными. Примерами С_2-6-алкенильных групп являются винил, аллил, бут-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, пент-1-ен-1-ил и гекс-1-ен-1-ил.

Под термином «возможно замещенный» в отношении C _1-6-алкильных и С_2-6-алкенильных групп понимают, что рассматриваемая группа может быть замещена один или несколько раз, предпочтительно 1-3 раза, группой(ами), выбранной из группы, состоящей из гидрокси, С_1-6-алкокси (т.е. С_1-6 -алкил-окси), С_2-6-алкенилокси, оксо (образуя кето или альдегидную функциональную группу), арила, арилокси, арилкарбонила, гетероциклила, гетероциклилокси, гетероциклилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, галогена, где любой арил или гетероциклил может быть замещен, как особо описано ниже, для возможно замещенных арила и гетероциклила.

«Галоген» включает фтор, хлор, бром и йод.

Предполагают, что при использовании здесь термин «арил» обозначает полностью или частично ароматическое карбоциклическое кольцо или кольцевую систему, такую как фенил, нафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, антрацил, фенантрацил, пиренил, бензопиренил, флуоренил и ксантенил, среди которых фенил является предпочтительным примером.

Предполагают, что термин «гетероциклил» обозначает насыщенное, частично ненасыщенное, частично ароматическое или полностью ароматическое карбоциклическое кольцо или кольцевую систему, где один или более атомов углерода заменены на гетероатомы, например атомы азота (=N- или -NH), серы (-S-) и/или кислорода (-О-). Примерами подобных гетероциклильных групп являются оксазолил, оксазолинил, оксазолидинил, изоксазолил, изоксазолинил, изоксазолидинил, оксадиазолил, оксадиазолинил, оксадиазолидинил, тиазолил, изотиазолил, пирролил, пирролинил, пирролидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиразолил, пиридинил, пиразинил, пиридазинил, пиперидинил, кумарил, фурил, хинолил, бензотиазолил, бензотриазолил, бензодиазолил, бензоксозолил, диазолил, диазолинил, диазолидинил, триазолил, триазолинил, триазолидинил, тетразол и т.п. Предпочтительными гетероциклильными группами являются 5-, 6- или 7-членные моноциклические группы, такие как изоксазолил, изоксазолинил, оксадиазолил, оксадиазолинил, пирролил, пирролинил, диазолил, диазолинил, триазолил, триазолинил, имидазолил, имидазолинил и т.п.

Предполагают, что термин «гетероциклическое кольцо» означает кольцо, соответствующее тому, что определено под «гетероциклилом».

Под термином «возможно замещенный» в отношении терминов «арил», «гетероциклил» и «гетероциклическое кольцо» понимают, что рассматриваемая группа может быть замещена один или несколько раз, предпочтительно 1-3 раза, группой(ами), выбранной из гидрокси-группы (которая, когда находится в енольной системе, может быть представлена и в таутомерной кето-форме), C_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, фенила, бензила, C_1-6-алкокси, оксо-группы (которая может быть представлена в таутомерной енольной форме), карбокси, C_1-6-алкоксикарбонила, C_1-6-алкилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6 -алкил)амино, дигалоген-С_1-4-алкила, тригалоген-С _1-4-алкила и галогена. Наиболее характерными примерами заместителей являются гидроксил, С_1-4-алкил, фенил, бензил, С_1-4-алкокси, оксо, амино, моно- и диметиламино и галоген.

Кроме того факта, что R¹ и R² независимо друг от друга могут быть выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C _1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, также возможно, что часть фрагмента -C(=N-Z¹-R ¹)-NH-Z²-R² может быть частью гетероциклического кольца, тогда как другая часть фрагмента имеет значение, установленное для Z¹, Z², R¹ и R² , соответственно. В некоторых интересных воплощениях -C=N-Z ¹-R¹ может образовывать часть гетероциклического кольца, выбранного из группы, состоящей из 1,2-диазолового кольца, изоксазолового кольца, 1,2,4-триазолового кольца и 1,2,4-оксадиазолового кольца, или -C-NH-Z²-R² может образовывать часть гетероциклического кольца, выбранного из группы, состоящей из 1,2-диазолинового кольца, изоксазолинового кольца, 1,2,4-триазолинового кольца и 1,2,4-оксадиазолинового кольца. Подобные гетероциклические кольца могут быть замещены, как описано выше.

В некоторых воплощениях по меньшей мере один R¹ и R² представляет собой водород, например оба являются водородами. Кроме того, в некоторых воплощениях, которые можно сочетать с упомянутыми ранее воплощениями, по меньшей мере один Z¹ и Z² является одинарной связью, например оба являются одинарными связями. В конкретных воплощениях R ¹ и R² оба являются водородами, и Z¹ и Z² оба являются одинарными связями.

Считается, что фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z ²-R² особенно важен для стабилизирующего эффекта стабилизирующего агента (3в). В частности считается, что фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² имитирует аргининовую группу субстрата полипептида фактора VII.

В более конкретных воплощениях стабилизирующий агент (3в) является по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из амидиновых соединений, содержащих фрагмент -C(=N-Z¹ -R¹)-NH-Z²-R², и гуанидиновых соединений, содержащих фрагмент >N-C(=N-Z¹-R ¹)-NH-Z²-R².

В некоторых воплощениях стабилизирующий агент (3в) представляет собой по меньшей мере одно амидиновое соединение, выбранное из группы, состоящей из бензамидинов, содержащих фрагмент -C₆ H₄-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z² -R², где C₆H₄ обозначает возможно замещенное бензольное кольцо, из которых бензамидин (R¹ и R² являются водородами, и Z¹ и Z² являются одинарными связями) составляет конкретное воплощение.

В других конкретных воплощениях этого бензамидины содержат фрагмент >N-C₆H₄ -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² , где С₆Н₄ обозначает возможно замещенное бензольное кольцо, т.е. о-амино-бензамидин, м-амино-бензамидин или п-амино-бензамидин, из которых п-амино-бензамидины, такие как п-амино-бензамидин, являются на данный момент самыми многообещающими.

Дополнительные иллюстрирующие примеры п-амино-бензамидинов являются такими, как раскрыто Aventis в ЕР 1162194 А1, см. в частности те, которые определены в пунктах 1-6 формулы изобретения и в параграфах [0009]-[0052], и в ЕР 1270551 А1, см. в частности пункты 1 и 2 формулы изобретения и параграфы [0010]-[0032].

В другом воплощении стабилизирующий агент (3в) представляет собой по меньшей мере одно гуанидиновое соединение, выбранное из группы, состоящей из гуанидиновых соединений, содержащих фрагмент - CH₂-NH-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z ²-R². Примерами гуанидиновых соединений являются соединения, выбранные из группы, состоящей из аргинина, производных аргинина и пептидов из 2-5 аминокислотных остатков, содержащих по меньшей мере один аргининовый остаток. Аргинин составляет конкретное воплощение.

Термин «производные аргинина», как считают, охватывает гомологи аргинина, функционализированные на N-конце аргинины (например, N-метилированные и N-ацилированные (например, ацетилированные) производные), функционализированные на С-конце аргинины (например, С-амидированные, С-алкиламидированные и С-алкилированные производные) и их комбинации.

Как упоминалось выше, один ключевой фрагмент стабилизирующих агентов представляет собой -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z ²-R². Другие части стабилизирующего агента также могут быть важны, в особенности в отношении оптимизации стабилизирующего эффекта и переносимости пациентом. Обычно стабилизирующий агент имеет формулу Y-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z² -R², где Y представляет собой органический радикал. Радикал Y обычно выбирают так, чтобы улучшить эффективность стабилизирующего эффекта. Также радикал Y может содержать один или более дополнительных фрагментов формулы -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z ²-R².

Молекулярная масса стабилизирующего агента обычно составляет самое большее 1000 Да, например самое большее 500 Да.

Концентрация стабилизирующего агента (или агентов) (3в) обычно составляет по меньшей мере 1 мкМ. Желательная (или необходимая) концентрация обычно зависит от выбранного стабилизирующего агента (или агентов), точнее от сродства к связыванию выбранного стабилизирующего агента с полипептидом фактора VII.

В разных воплощениях стабилизирующий агент (3в) находится в концентрации по меньшей мере 5 мкМ, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 20 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 150 мкМ, по меньшей мере 250 мкМ, по меньшей мере 500 мкМ, по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 2 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 20 мМ, например в диапазоне 20-2000 мкМ, в диапазоне 50-5000 мкМ, в диапазоне 0,1-10 мМ, в диапазоне 0,2-20 мМ или в диапазоне 0,5-50 мМ.

В разных воплощениях молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3) и полипептидом FVII (агент (3в): FVII) составляет больше 0,1, больше 0,5, больше 1, больше 2, больше 5, больше 10, больше 25, больше 100, больше 250, больше 1000, больше 2500 или больше 5000, так, например, в интервале 0,1-10000, 0,1-5000, 0,1-2500, 0,1-1000, 0,1-250, 0,1-100, 0,1-25, 0,1-10, 0,5-10000, 0,5-5000, 0,5-2500, 0,5-1000, 0,5-250, 0,5-100, 0,5-25, 0,5-10, 1-10000, 1-5000, 1-2500, 1-1000, 1-250, 1-100, 1-25, 1-10, 10-10000, 10-5000, 10-250, 1000-10000 или 1000-5000.

В одном воплощении стабилизирующий агент (3в) представляет собой бензамидин, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 0,5 мМ, например по меньшей мере 2 мМ, хотя исследовано, что замещенные бензамидины могут быть более действенными, по этой причине их можно добавлять в более низких концентрациях.

В одном воплощении стабилизирующий агент (3в) представляет собой аргинин, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 2 мМ, например по меньшей мере 10 мМ,

Следует понимать, что вышеупомянутые стабилизирующие агенты (3а), (3б) и (3в) можно применять в комбинации.

Другие добавки

Кроме того, композиция также может содержать модификатор тоничности (5).

Используемый здесь термин «модификатор тоничности» включает агенты, которые вносят вклад в осмоляльность раствора. Модификатор тоничности (5) включает по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из средних солей, аминокислот, пептидов из 2-5 аминокислотных остатков, моносахаридов, дисахаридов, полисахаридов и сахарных спиртов. В некоторых воплощениях композиция содержит два или более подобных агентов в комбинации.

Под «средней солью» подразумевают соль, которая не является ни кислотой, ни основанием при растворении в водном растворе.

В одном воплощении по меньшей мере один модификатор тоничности (5) является средней солью, выбранной из групп, состоящих из солей натрия, солей калия, солей кальция и солей магния, таких как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, ацетат кальция, глюконат кальция, левулинат кальция, хлорид магния, ацетат магния, глюконат магния и левулинат магния.

В дополнительном воплощении модификатор тоничности (5) включает хлорид натрия в сочетании с по меньшей мере одним агентом, выбранным из группы, состоящей из хлорида кальция, ацетата кальция, хлорида магния и ацетата магния.

В еще дополнительном воплощении модификатор тоничности (5) является по меньшей мере одним агентом, выбранным из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида кальция, сахарозы, глюкозы и маннита.

В разных воплощениях модификатор тоничности (5) находится в концентрации по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 20 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 200 мМ, по меньшей мере 400 мМ, по меньшей мере 800 мМ, по меньшей мере 1000 мМ, по меньшей мере 1200 мМ, по меньшей мере 1500 мМ, по меньшей мере 1800 мМ, по меньшей мере 2000 мМ или по меньшей мере 2200 мМ.

В одной серии воплощений модификатор тоничности (5) находится в концентрации в диапазоне 5-2000 мМ, таком как 25-2200 мМ, 50-2200 мМ, 100-2200 мМ, 200-2200 мМ, 400-2200 мМ, 600-2200 мМ, 800-2200 мМ, 1000-2200 мМ, 1200-2200 мМ, 1400-2200 мМ, 1600-2200 мМ, 1800-2200 мМ или 2000-2200 мМ; 5-1800 мМ, 25-1800 мМ, 50-1800 мМ, 100-1800 мМ, 200-1800 мМ, 400-1800 мМ, 600-1800 мМ, 800-1800 мМ, 1000-1800 мМ, 1200-1800 мМ, 1400-1800 мМ, 1600-1800 мМ; 5-1500 мМ, 25-1400 мМ, 50-1500 мМ, 100-1500 мМ, 200-1500 мМ, 400-1500 мМ, 600-1500 мМ, 800-1500 мМ, 1000-1500 мМ, 1200-1500 мМ; 5-1200 мМ, 25-1200 мМ, 50-1200 мМ, 100-1200 мМ, 200-1200 мМ, 400-1200 мМ, 600-1200 мМ или 800-1200 мМ.

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере один модификатор тоничности (5) является модификатором ионной силы (4).

Наиболее предпочтительно, чтобы композиция контейнера по изобретению содержала модификатор ионной силы (4). Таким образом, водный раствор предпочтительно содержит один или более модификаторов ионной силы (4), а также один или более модификаторов тоничности (5), не являющихся модификаторами ионной силы.

Используемый здесь термин «модификатор ионной силы» включает агенты, которые вносят вклад в ионную силу раствора. Агенты включают, не ограничиваясь этим, средние соли, аминокислоты, пептиды от 2 до 5 аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях композиция содержит два или более подобных агентов в комбинации.

Предпочтительные примеры модификаторов ионной силы (4) представляют собой средние соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и хлорид магния (последние два можно дополнительно считать «стабилизирующими агентами» (см. выше)). Предпочтительным агентом (4) является хлорид натрия.

Термин «ионная сила» является ионной силой раствора (µ), которая определена по уравнению: µ= ¹/₂ ([и](Z_и ²)), где µ представляет собой ионную силу, [и] представляет собой миллимолярную концентрацию иона и Z _и представляет собой заряд (+или -) этого иона (см., например, Solomon, Journal of Chemical Education, 78(12): 1691-92, 2001; James Fritz и George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979).

В одном воплощении изобретения ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере около 50 мМ, так, например, по меньшей мере 100 мМ. В разных воплощениях изобретения ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 200 мМ, например составляет по меньшей мере 400 мМ, так по меньшей мере 800 мМ, по меньшей мере 1000 мМ, по меньшей мере 1200 мМ, по меньшей мере 1500 мМ, по меньшей мере 1800 мМ, по меньшей мере 2000 мМ или по меньшей мере 2200 мМ. В конкретном варианте этого концентрация стабилизирующего агента(ов) (3а) (т.е. солей кальция и солей магния) в водном растворе составляет менее 15 мМ, однако с одновременным присутствием по меньшей мере 100 мМ NaCl.

В некоторых конкретных воплощениях общая концентрация модификатора тоничности (5) и модификатора ионной силы (4) находится в интервале 1-500 мМ, например в интервале 1-300 мМ, или в интервале 10-200 мМ, или в интервале 20-150 мМ, в зависимости от эффекта, который любые другие компоненты могут оказывать на тоничность и ионную силу.

В одном воплощении композиция является изотонической; в другом является гипертонической.

Термин «изотоническая» означает «изотоническая с сывороткой крови», т.е. при приблизительно 300±50 миллиосмоль/кг. Подразумевают что тоничность представляет собой величину осмоляльности раствора до введения. Полагают что термин «гипертоническая» обозначает уровни осмоляльности выше физиологического уровня сыворотки крови, такие уровни выше 300±50 миллиосмоль/кг.

Композиция может также включать неионное поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества (также известные как детергенты) обычно включают те агенты, которые защищают белок от воздействий на границе раздела воздух / раствор и от воздействий на границе раздела раствор / поверхность (например, приводящих к агрегации белка).

Характерными представителями неионных поверхностно-активных веществ являются полисорбаты, полоксамеры, алкиловые эфиры полиоксиэтилена, полиэтилен / полипропилен блоксополимеры, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтилен стеараты и полиоксиэтилированные касторовые масла.

Иллюстрирующими примерами неионных поверхностно-активных веществ являются Твин®, полисорбат 20, полисорбат 80, Brij-35 (додециловый эфир полиоксиэтилена), полоксамер 188, полоксамер 407, ПЭГ800, полиолы плюроники®, полиокси-23-лауриловый эфир, Myrj 49 и Кремофор А.

В одном воплощении неионное поверхностно-активное вещество присутствует в количестве 0,005-2,0% по массе.

В дополнительном воплощении композиция, кроме того, содержит антиоксидант (6). В разных воплощениях антиоксидант выбран из группы, состоящей из L-метионина, D-метионина, аналогов метионина, метионинсодержащих пептидов, метионин-гомологов, аскорбиновой кислоты, цистеина, гомоцистеина, глутатиона, цистина и цистатионина. В предпочтительном воплощении антиоксидант представляет собой L-метионин.

Обычно концентрация антиоксиданта (6) находится в интервале 0,1-5,0 мг/мл, например в интервале 0,1-4,0 мг/мл, в интервале 0,1-3,0 мг/мл, в интервале 0,1-2,0 мг/мл или в интервале 0,5-2,0 мг/мл.

В конкретных воплощениях композиция не включает антиоксидант; вместо этого чувствительность полипетида фактора VII к окислению регулируется удалением атмосферного воздуха. Конечно, применение антиоксиданта также можно сочетать с удалением атмосферного воздуха.

Считается, что подходящие водные растворы, пригодные для контейнеров по изобретению, предпочтительно имеют концентрацию активированного полипептида фактора VII более 5 мг/мл или более 6 мг/мл, например более 7 мг/мл, или более 8 мг/мл, или более 9 мг/мл, или даже более 10 мг/мл.

Предпочтительна солюбилизированная композиция в контейнере, где активированный полипептид фактора VII является «стабильным», как определено здесь.

Разные воплощения закрытого контейнера представляются особенно интересными, например:

(1) Контейнер, как определено здесь, где водный раствор содержит:

по меньшей мере 2,5 мг на 1 мл объема контейнера активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

(2) Контейнер, как определено здесь, где водный раствор содержит:

по меньшей мере 2,5 мг на 1 мл объема контейнера активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент (3а), выбранный из солей кальция, в концентрации в пределах по меньшей мере 15 мМ;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

(3) Контейнер, как определено здесь, где водный раствор содержит:

по меньшей мере 2,5 мг на 1 мл объема контейнера активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент на основе двухвалентного металла первого переходного периода (36), где молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3б) и полипептидом FVII составляет больше 0,5;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ; и

(4) Контейнер, как определено здесь, где водный раствор содержит:

по меньшей мере 2,5 мг на 1 мл объема контейнера активированного полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), пригодный для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5;

по меньшей мере один стабилизирующий агент бензамидин / аргинин-типа (3в), где молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3в) и полипептидом FVII составляет больше 0,1;

где ионная сила водного раствора составляет по меньшей мере 50 мМ.

Композиция в сухой форме

В другом воплощении композиция находится в сухой форме; в частности композиция содержит влаги приблизительно не более 3%. Предпочтительно композиция находится в лиофилизированной форме.

Чтобы сделать композицию устойчивой к разрушению и силам трения в связи с процессом сушки вымораживанием, композиция преимущественно должна включать по меньшей мере один стабилизирующий агент, в частности по меньшей мере один стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из а) комбинации антиоксиданта и маннита; б) комбинации метионина и полиола; в) комбинации сахарида и маннита; г) комбинации сахарозы и полиола и д) метионина.

Стабилизация лиофилизированных композиций активированных полипептидов фактора VII описана более подробно в WO 2004/000347, который включен сюда путем ссылки.

Перед применением продукта лиофилизированную композицию восстанавливают в жидкость, пригодную для рассматриваемого терапевтического применения, обычно в водный буфер. Подобный водный буфер может содержать водный растворитель, буфер (2), один или более стабилизирующих агентов (3), один или более модификаторов тоничности (5), один или более модификаторов ионной силы (4), антиоксидант (6) и т.п., как описано выше.

В частности контейнер (с его «сухой» композицией) дает контейнер, как определено выше, после восстановления композиции с водным раствором.

Предпочтительна сухая композиция в контейнере, где активированный полипептид фактора VII является «стабильным», как определено здесь.

Получение контейнера, содержащего композицию активированного полипептида фактора VII

Закрытый контейнер по изобретению можно получить разными способами, как будет понятно из следующего. Обычно способы получения закрытого контейнера включают стадии, при которых (1) создают активированный полипетид фактора VII в концентрированной форме; (2) загружают по меньшей мере часть концентрированного полипептида фактора VII (обычно в растворе) в контейнер, если он уже не находится в подходящем контейнере, так, чтобы контейнер содержал активированный полипетид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера; (3) возможно лиофилизируют концентрированный полипептид фактора VII и (4) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

Дополнение (1)

Примеры разных подходящих способов получения концентрата полипептида фактора VII описаны далее.

Дополнение (2)

Загружают по меньшей мере часть концентрированного полипептида фактора VII (концентрат) в контейнер, если он уже не находится в подходящем контейнере, так, чтобы контейнер содержал активированный полипетид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера. Перед загрузкой или применительно к загрузке концентрат можно модифицировать, добавляя буфер (2), один или более стабилизирующих агентов (3), один или более модификаторов тоничности (5), один или более модификаторов ионной силы (4), антиоксидант (6) и т.п., как описано выше, и продукт можно затем очистить, например, хроматографическими способами, механическими способами (например, фильтрацией, такой как стерилизующая фильтрация или вирусная фильтрация), чтобы получить подходящий продукт для хранения в контейнере. Подобный закрытый контейнер предпочтительно является таким, как определено выше.

Дополнение (3)

В некоторых важных воплощениях концентрат (возможно после модификации, как описано выше в (2)) можно после загрузки в контейнер подвергнуть сушке вымораживанием, чтобы получить сухой продукт для хранения (см. также выше), который можно восстановить, как описано выше.

Обычно контейнер представляет собой флакон, карпулу, шприц и т.п. В одном воплощении контейнер имеет по меньшей мере два отделения (например, карпула), где первое отделение содержит активированный полипептид фактора VII. В варианте этого активированный полипептид фактора VII из первого отделения находится в лиофилизированной форме, а второе отделение содержит водный растворитель для указанного активированного полипептида фактора VII. В другом варианте этого активированный полипептид фактора VII из первого отделения находится в водном растворе, а второе отделение содержит водный растворитель для указанного активированного полипептида фактора VII. В обоих случаях цель состоит в получении готовой к применению композиции, как определено выше.

Дополнение (4)

В качестве заключительной стадии контейнер закрывают или запечатывают традиционными способами, чтобы получить закрытый контейнер, например чтобы создать флакон, карпулу и т.п. На контейнер можно затем наклеить этикетку и упаковать.

Анионообменная хроматография (АIЕС)

В одном важном варианте концентрат получают с анионообменным материалом, включая промывку и/или элюирование буфером с установленным рН.

Согласно данному аспекту изобретения, несомненно, возможно получить концентрацию полипептида фактора VII вплоть до по меньшей мере 16 мг/мл, см. также экспериментальный раздел, и, следовательно, предвидеть, что дополнительная оптимизация согласно приведенным здесь рекомендациям сделает возможным приготовить концентрации, пригодные для получения закрытых контейнеров, как определено здесь, где количество активированного полипептида фактора VII находится в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера.

В одном основном варианте способ концентрирования лекарственной субстанции полипептида фактора VII, указанной лекарственной субстанции, включает стадии, при которых:

(а) соединяют лекарственную субстанцию с анионообменным материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанной лекарственной субстанции с указанным анионообменным материалом (данная стадия также обозначена как «загрузка»);

(б) промывают указанный анионообменный материал промывным буфером, имеющим рН в интервале 5,5-7,0, или альтернативно в интервале 8,5-9,5 в присутствии 1-7 мМ Са²⁺, и

(в) элюируют указанный анионообменный материал с элюирующим буфером, имеющим рН в интервале 3,0-7,0, и собирают более концентрированный по сравнению с загрузкой раствор полипептида фактора VII в виде элюата.

Необходимое требование для получения концентрированного полипептида фактора VII с помощью AIEC заключается в увеличении элюирующей силы при сохранении оптимальной растворимости полипептида фактора VII в ходе промывки и элюирования. Например, это достигают:

(а) поддерживая рН в процессе загрузки при приблизительно 5,5-7,0, или альтернативно в интервале 8,5-9,5 в присутствии 1-7 мМ Са²⁺;

(б) сохраняя ионную силу в ходе промывки при 40-250 мМ (например, NaCl), предпочтительно при 75-100 мМ (ионная сила выше 150 мМ может вызвать «выделение» полипептида фактора VII);

(в) увеличивая концентрацию кальция и/или ионную силу (например, NaCl) в процессе элюирования и/или уменьшая рН в процессе элюирования, например от интервала 5,0-7,0 до интервала 3,0-4,9, в виде градиента или ступенчато.

Не ограничиваясь этим, способ AIEC особенно пригоден для лекарственных веществ полипептида фактора VII в «промышленном масштабе» (или «крупном масштабе»). Под термином «промышленный масштаб» обычно имеют в виду процессы, где объем жидких композиций полипептида фактора VII составляет по меньшей мере 100 л, так по меньшей мере 500 л, например по меньшей мере 1000 л или по меньшей мере 5000 л, или где вес композиций составляет по меньшей мере 100 кг, так по меньшей мере 500 кг, например по меньшей мере 1000 кг или по меньшей мере 5000 кг.

Стадия (а) - Соединение лекарственной субстанции с анионообменным материалом

На первой стадии способа лекарственную субстанцию полипептида фактора VII соединяют с анионообменным материалом. Цель состоит в том, чтобы облегчить связывание части указанной лекарственной субстанции полипептида фактора VII с указанным анионообменным материалом.

Под термином «часть» применительно к стадии (а) подразумевают по меньшей мере 30% (т.е. 30-100%) массы полипептида фактора VII, присутствующего в лекарственной субстанции полипептида фактора VII. Следует понимать, что в большинстве случаев желательно связать значительно больше чем 30% массы полипептидов фактора VII, например по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 70%, или преобладающую часть. Под термином «преобладающая часть» понимают по меньшей мере 90% массы полипептида фактора VII, присутствующего в лекарственной субстанции полипептида фактора VII. Предпочтительно чтобы даже большая часть становилась связанной с анионообменным материалом, например по меньшей мере 95% массы, или по меньшей мере 98% массы, или по меньшей мере 99% массы, или даже по существу вся масса полипептида фактора VII, присутствующего в лекарственной субстанции полипептида фактора VII.

Лекарственная субстанция полипептида фактора VII обычно образуется в ходе процесса промышленного производства, например из клеточной культуры, клонированного животного (например: коров, свиней, овец, коз и рыб) или насекомых, или тому подобного, в особенности из клеточной культуры.

Анионообменный материал предпочтительно является сильным анионообменным материалом, например анионообменным материалом, имеющим четвертичные аммонийные группы. Промышленными примерами подобных материалов являются Q-Sepharose Fast Flow, Q-Sepharose High Performance и Mono Q от Amersham Biosciences, POROS HQ 50 от PerSeptive Biosystems и Toyopeari Super Q от Tosoh Biosciences.

Наиболее распространено размещение анионообменного материала в формате колонки. Конечно, также возможно размещение в комплектном контейнере.

Лекарственную субстанцию полипептида фактора VII обычно получают непосредственно из предшествующей стадии очистки или из предшествующей стадии очистки с последующим регулированием рН, ионной силы, хелатообразования двухвалентных ионов металла и т.п., что необходимо.

рН лекарственной субстанции до и после внесения в анионообменный материал влияет на образование продуктов расщепления, таких как дeзGla-фактор VII, и расщепление тяжелой цепи. Таким образом, предпочтительно чтобы лекарственная субстанция находилась в жидкой форме и имела рН в диапазоне 5,5-7,0, например 5,7-6,5, в особенности 5,8-6,5 или 5,5-6,2 после внесения в анионообменный материал. При значениях рН ниже приблизительно 5,5 проявляется тенденция к образованию димеров особенно в отсутствии кальция. Альтернативно, загрузочный раствор имеет рН в диапазоне 8,5-9,5 в присутствии небольших количеств кальция, например 1-7 мМ.

Обычно электропроводность находится в диапазоне 2-30 мС/см, таком как 5-15 мС/см. Температура лекарственной субстанции обычно составляет 0-15°С, например приблизительно 2-10°С.

Температура анионообменного материала со связанным полипептидом фактора VII обычно составляет 0-15°С, так приблизительно 2-10°С, например поддерживается в установленном диапазоне при использовании охлаждающей рубашки и растворов регулируемой температуры.

Соединение лекарственной субстанции полипептида фактора VII обычно осуществляют согласно общепринятым правилам, т.е. концентрация, температура, ионная сила и т.п. лекарственной субстанции могут быть такими, как обычно, и анионообменный материал может быть промыт и уравновешен перед внесением так, как принято.

Загружают полипептид фактора VII обычно в интервале 10-40 г, например 15-30 г, полипептида фактора VII на литр матрицы (анионообменный материал во влажной форме), и лекарственная субстанция обычно вносится при потоке 3-200 объемов колонки в час.

Стадия (б) - Стадия промывки

После связывания лекарственной субстанции полипептида фактора VII с анионообменными материалами осуществляют стадию промывки (б), чтобы получить достаточную ионную силу для оптимальной растворимости полипептида фактора VII перед началом элюирования. Данная стадия также обеспечивает удаление дeзGla-фактора VII, когда выполняется при рН<7,0.

Данная стадия промывки (б) предпочтительно осуществляется с промывным буфером, имеющим рН в диапазоне 5,5-7,0. В некоторых интересных воплощениях промывной буфер имеет рН самое большее 6,8, или самое большее 6,7, или самое большее 6,6, или самое большее 6,5, или самое большее 6,4.

Предпочтительно рН находится в диапазоне 5,7-6,5, в особенности 5,8-6,5 или 5,5-6,2. В некоторых интересных воплощениях, таких как загрузка в присутствии небольших количеств кальция вплоть до 7 мМ, рН в процессе промывки изменяется от приблизительно рН 9,0 до рН 5,5-7,0.

Стадию промывки (б) обычно проводят при потоке 3-200 объемов колонки в час.

Промывной буфер обычно представляет собой водный раствор, включающий буферный агент, обычно буферный агент, содержащий по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из кислот и солей MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, гистидина, имидазола, глицина, глицилглицина, глицинамида, фосфорной кислоты, уксусной кислоты (например, ацетата натрия), молочной кислоты, глутаровой кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты и янтарной кислоты. Следует понимать, что буферный агент может содержать смесь двух или более компонентов, где смесь будет обеспечивать значение рН в установленном диапазоне. В качестве примеров можно привести уксусную кислоту и ацетат натрия и т.п.

Промывной буфер может также содержать соли и т.п., обычно концентрации анионов которых недостаточно, чтобы осуществить элюирование полипептида фактора VII из колонки, например, что соответствует ионной силе 40-250 мМ. При рН 6,0 промывной буфер может содержать композицию 50-250 мМ NaCl, приблизительно 10 мМ гистидина (буферный агент), рН 6,0. Во всех случаях важно, чтобы ионная сила промывного буфера была достаточно высокой, чтобы избежать возможного осаждения полипептида фактора VII, но не такой высокой, чтобы началось «выделение» полипептида фактора VII.

Следует понимать, что стадию промывки (б) можно осуществить, используя один, два или несколько разных промывных буферов или применяя градиентный промывной буфер.

Стадия (в) - Стадия элюирования

После стадии(й) промывки (б) анионообменный материал элюируют с элюирующим буфером и концентрированную лекарственную субстанцию полипептида фактора VII собирают в виде элюата.

Для стадии элюирования (в) возможно большое количество вариаций. Если элюирование осуществляется довольно быстро, то образование значительных количеств дeзGla-фактора VII и расщепление тяжелой цепи можно подавить, даже если элюирование проводится при рН выше 7,0. Однако для избежания образования дeзGla-фактора VII и расщепления тяжелой цепи предпочтительно, чтобы элюирующий буфер также имел рН в диапазоне 3,0-7,0, например в диапазоне 4,0-7,0. В некоторых интересных воплощениях элюирующий буфер имеет рН самое большее 6,8, или самое большее 6,7, или самое большее 6,6, или самое большее 6,5, или самое большее 6,4.

По-видимому, присутствие ионов кальция в количестве 5-25 мМ уменьшает расщепление, см. также комментарии ниже относительно ионной силы.

Стадию элюирования (в) обычно проводят при потоке 3-200 объемов колонки в час.

Элюирование может быть выполнено несколькими способами, например с элюирующим буфером, содержащим двухвалентный катион(ы), в ходе проведения конкурентного элюирования, используя высокую концентрацию определенных анионов, или при применении градиента рН, или сочетанием вышесказанного.

В одном воплощении элюирование осуществляют посредством элюирующего буфера, содержащего один или более двухвалентных катионов. Концентрация двухвалентного катиона(ов) обычно составляет по меньшей мере 5 мМ, например по меньшей мере 10 мМ, например по меньшей мере 15 мМ или даже по меньшей мере 30 мМ.

Двухвалентный катион(ы) предпочтительно вкпючает(ют) по меньшей мере один двухвалентный катион, выбранный из группы, состоящей из Са²⁺, Sr²⁺, Mg²⁺ и Ва ²⁺. Подобные двухвалентные катионы имеют тенденцию присоединяться к Gla-домену полипептидов фактора VII и, таким образом, способствуют отделению лекарственной субстанции полипептида фактора VII от анионообменного материала. В одном предпочтительном воплощении двухвалентный катион(ы) включает(ют) Са²⁺.

Элюирующий буфер обычно имеет концентрацию двухвалентного катиона(ов) по меньшей мере 5 мМ, так в диапазоне 5-100 мМ, например в диапазоне 10-50 мМ.

В одном варианте элюирующий буфер представляет собой градиентный буфер относительно двухвалентного катиона(ов) (например, Са²⁺), например градиентный буфер, где начальная концентрация двухвалентного катиона(ов) (например, Са²⁺) находится в интервале 0-20 мМ и конечная концентрация двухвалентного катиона(ов) (например, Са²⁺) градиентного буфера находится в интервале 15-100 мМ.

В другом воплощении стадию элюирования (в) осуществляют в ходе конкурентного элюирования лекарственной субстанции с одним или более анионами, например моно-, двух- или трехвалентными анионами. Подобные анионы обычно выбирают из группы, состоящей из хлорида, ацетата, малоната, фосфата, карбоната, сульфата и нитрата; в особенности из хлорида (Cl^-), ацетата и малоната.

В одном варианте элюирующий буфер имеет концентрацию Cl^- в диапазоне 100-800 мМ, например 200-500 мМ. Альтернативно, элюирующий буфер представляет собой градиентный буфер относительно Cl ^-, например градиентный буфер, где начальная концентрация Cl^- находится в интервале 0-300 мМ и конечная концентрация Cl^- находится в интервале 300-1000 мМ.

В дополнительном варианте элюирующий буфер имеет концентрацию малоната в диапазоне 100-800 мМ, например 200-500 мМ. Альтернативно, элюирующий буфер представляет собой градиентный буфер относительно малоната, например градиентный буфер, где начальная концентрация малоната находится в интервале 0-300 мМ и конечная концентрация малоната находится в интервале 300-1000 мМ.

В еще дополнительном варианте элюирующий буфер имеет концентрацию ацетата в диапазоне 100-1000 мМ, например 400-800 мМ. Альтернативно, элюирующий буфер представляет собой градиентный буфер относительно ацетата, например градиентный буфер, где начальная концентрация ацетата находится в интервале 0-400 мМ и конечная концентрация ацетата находится в интервале 400-1000 мМ.

В еще другом воплощении элюирующий буфер представляет собой градиентный буфер относительно рН. В одном варианте этого начальный рН градиентного буфера находится в интервале 5,0-7,0 и конечный рН градиентного буфера находится в интервале 3,0-4,9.

В отношении стадии элюирования (в) вообще предпочтительно, чтобы ионная сила элюирующего буфера находилась в диапазоне 100-1000 мМ, таком как 200-800 мМ (например, NaCl).

Обычно анионообменный материал регенерируют с целью последующего применения в ходе последовательности стадий.

Настоящий способ особенно полезен для получения концентрированной лекарственной субстанции полипептида фактора VII, и если условия для стадий (а)-(в) относительно рН подобраны правильно, то даже возможно снизить до минимума образование продуктов расщепления структур полипептида фактора VII и, таким образом, увеличить общий выход способа, получая очень высокую концентрацию полипептида фактора VII.

Таким образом, предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой способ очистки лекарственной субстанции полипептида фактора VII, указанной лекарственной субстанции, содержащего элюат по меньшей мере 5 мг/мл полипептида фактора VII, указанный способ включает стадии, при которых:

(а) соединяют лекарственную субстанцию с анионообменным материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанной лекарственной субстанции с указанным анионообменным материалом, указанная лекарственная субстанция находится в жидкой форме и имеет рН в интервале 5,5-7,0, или альтернативно в интервале 8,5-9,5 в присутствии 1-7 мМ Са ²⁺;

(б) промывают указанный анионообменный материал промывным буфером, имеющим рН в интервале 5,5-7,0 и ионную силу в интервале 75-100 мМ NaCl; и

(в) элюируют указанный анионообменный материал с элюирующим буфером, элюирующий буфер имеет рН в интервале 2,0-7,0 и содержит двухвалентный катион, такой как кальций, элюирующий буфер обладает элюирующей силой по отношению к двухвалентному катиону 10-30 мМ в присутствии 100-300 мМ NaCl; при использовании исключительно двухвалентного катиона для элюирования концентрация должна составлять по меньшей мере 50 мМ, и собирают концентрированный раствор полипептида фактора VII в виде элюата, собранная очищенная лекарственная субстанция содержит концентрацию полипептида FVIIa по меньшей мере 5 мг/мл без заслуживающего внимания увеличения продуктов расщепления полипептида FVIIa.

Гидроксиапатит

В варианте вышеприведенного способа AIEC с соответствующими изменениями способ получения закрытого контейнера, содержащего активированный полипептид фактора VII, включает с необходимыми поправками стадии, при которых:

(а) соединяют раствор, содержащий полипептид фактора VII, с гидроксиапатитовым материалом при условиях, которые способствуют связыванию части указанного полипептида фактора VII с указанным гидроксиапатитовым материалом (например, загружают приблизительно до 15 мг/мл геля в присутствии 10 мМ кальция);

(б) возможно промывают указанный гидроксиапатитовый материал промывным буфером (например, первым промывным буфером 0,1 М фосфата, рН 6,8, и затем 10 мМ фосфата, рН 6,8);

(в) элюируют указанный гидроксиапатитовый материал с элюирующим буфером, имеющим рН в интервале 5,5-7,0, и собирают элюат активированного полипептида фактора VII;

(г) загружают по меньшей мере часть элюата в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют элюат; и (е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер. В одном варианте этого было возможно получить массовую концентрацию 8 мг/мл.

Ультрафильтрация

Ультрафильтрация (UF) представляет собой управляемый давлением, основывающийся на мембране способ разделения, применяемый для разделения чрезвычайно мелких частиц и растворенных молекул в жидкостях. Определяющим основанием для разделения является молекулярный размер, хотя другие факторы, такие как форма и заряд молекул, также могут иметь значение. Молекулы больше, чем мембранные поры, будут удерживаться на поверхности мембраны и накапливаться в процессе ультрафильтрации. Можно использовать насос для создания непрерывного потока раствора через мембрану, предотвращая нарастание накопленных молекул на поверхности мембраны, и для создания необходимого давления, чтобы вытеснить воду (или жидкость) и небольшие молекулы, такие как компоненты буфера, через поры мембраны.

Свойства удерживания ультрафильтрационных мембран выражают в виде отсечения по молекулярной массе (MWCO). Данное значение относится к приблизительной молекулярной массе (MW) разбавленного шаровидного растворенного вещества (т.е. обычного белка), 90% которого удерживается мембраной. Однако форма молекул может оказывать непосредственное влияние на удерживание его мембраной. Например, линейные молекулы, подобные ДНК, могут проникать через поры, которые будут удерживать шаровидные частицы такой же молекулярной массы.

Начальная композиция, которую концентрируют в ходе процесса ультрафильтрации, является обычно той же природы, что и начальная композиция процесса АIЕС, описанного выше. Ионная сила обычно находится в диапазоне 40-250 мМ, и желательно включить один или более вспомогательных агентов, таких как углеводы (например, сахароза, маннит и т.п.), а также буферы, модификаторы тоничности и модификаторы ионной силы, как описано выше для конечной композиции. рН начальной композиции обычно находится в интервале 5,5-7,0, в особенности в интервале 5,5-6,5. Осаждение полипептида фактора VII часто наблюдается при рН ниже 5,5. Альтернативно, рН может находиться в диапазоне 9,0-10,0. В большинстве случаев предпочтительно проводить процесс при низкой температуре, например в интервале 0-15°C, таком как примерно 2-10°С.

Существует три основных применения ультрафильтрации:

1. Концентрированно. Ультрафильтрация является чрезвычайно эффективным способом концентрирования разбавленного белка (обычно свыше 90% извлечения).

2. Обессоливание и буферный обмен (диафильтрация). Ультрафильтрация обеспечивает очень удобный и эффективный способ для удаления или обмена солями, удаления детергентов, отделения свободных молекул от связанных, удаления низкомолекулярных веществ или быстрого изменения ионной или рН среды.

3. Фракционирование. Ультрафильтрация не осуществляет четкого разделения двух молекул с похожими молекулярными массами. Молекулы, которые будут разделены, должны отличаться по размеру по меньшей мере на один порядок величины (10Х) для эффективного разделения.

Для более полного описания ультрафильтрации см., например, "Microfiltration and ultrafiltration. Principles and Applications" («Микрофильтрация и ультрафильтрация. Основы и применение»), Leos J. Zeman и Andrew L. Zydney. Marcel Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York (1996).

Таким образом, контейнер по изобретению также можно получить способом, включающим стадии, при которых:

(а) подвергают раствор, содержащий полипептид фактора VII, ультрафильтрации и/или диафильтрации, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(б) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера;

(в) возможно лиофилизируют раствор; и

(г) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

Осаждение

Концентрирование белков можно осуществить, осаждая белки и затем растворяя осадок в меньшем объеме того же самого или нового буфера. Осаждение можно выполнить, регулируя рН и/или добавляя осаждающий агент. Однако осаждающие агенты могут воздействовать на белки (денатурация, например органические растворители) и могут оказываться в осадке и таким образом в растворе после повторного растворения осадка. Некоторые осаждающие агенты являются очень мягкими к белкам и могут даже стабилизировать белки, и оставшиеся осаждающие агенты можно впоследствии удалить, например, в ходе обессоливания, диафильтрации (изменение буфера), диализации или сушки сублимацией (удаление органических растворителей, подобных этанолу).

ПЭГ представляет собой высокорастворимый незаряженный воспламеняющийся полимер с очень незначительной тенденцией денатурировать белки или без нее. Следовательно, белки можно осадить с помощью ПЭГ безопасным и мягким способом, не увеличивая электропроводность.

Общепринятый основной способ осаждения белка заключается в высаливании при высокой концентрации соли, обычно сульфата аммония, (NH₄) ₂SO₄, из-за его высокой растворимости. Сульфат аммония также предпочтителен, так как не взаимодействует с белками и может даже оказывать стабилизирующее действие на белки.

Температура, при которой осуществляют процессы, обычно составляет 0-15°С, так примерно 2-10°С.

Таким образом, контейнер по изобретению также можно получить способом, включающим стадии, при которых:

(а) объединяют насыщенный раствор сульфата аммония с раствором, содержащим полипептид фактора VII, чтобы облегчить осаждение полипептида фактора VII;

(б) повторно растворяют выпавший в осадок полипептид фактора VII в водном растворителе, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(в) возможно обессоливают указанный концентрированный раствор;

(г) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют раствор; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

Лиофилизация

Лиофилизацию, или сушку вымораживанием, осуществляют, используя простой принцип физики, названный сублимацией. Сублимация представляет собой переход вещества из твердого состояния в парообразное, минуя промежуточную жидкую фазу. Чтобы извлечь воду из замороженного раствора, например белков, в ходе способа лиофилизации:

1. Замораживают раствор, чтобы вода в растворе стала льдом;

2. Под вакуумом сублимируют лед непосредственно в водяной пар;

3. Отводят водяной пар;

4. Как только лед сублимирован, растворенные вещества (белки) высушивают вымораживанием, и они могут быть восстановлены.

Для более полного описания сушки вымораживанием см., например, «Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products» (Сушка сублимацией/ лиофилизация фармацевтических и биологических препаратов), второе издание, Серия: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, том: 137, Marcel Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York (2004).

Таким образом, контейнер по изобретению также можно получить способом, включающим стадии, при которых:

(а) лиофилизируют раствор, содержащий полипептид фактора VII, чтобы получить композицию полипептида фактора VII, содержащую приблизительно не более 3% влаги;

(б) повторно растворяют лиофилизированный полипептид фактора VII в водном растворителе, чтобы получить концентрированный раствор полипептида фактора VII;

(в) возможно обессоливают указанный концентрированный раствор;

(г) загружают по меньшей мере часть концентрированного раствора в контейнер так, чтобы контейнер содержал активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема контейнера;

(д) возможно лиофилизируют раствор; и

(е) запечатывают контейнер, чтобы получить закрытый контейнер.

Применение контейнера, содержащего композицию активированного полипептида фактора VII

Фармацевтические продукты, представленные закрытыми контейнерами, особенно полезны для терапевтических применений, при которых довольно большое количество активированного полипептида фактора VII можно обеспечить одним контейнером. Таким образом, по настоящему изобретению в особенности предложены фармацевтические продукты, как определено здесь, для применения в качестве лекарства, а именно для применения в качестве лекарства для лечения чувствительного к фактору VII синдрома, такого как, например, нарушения свертываемости крови, включая вызванные дефицитом факторов свертывания крови (например, гемофилия А, гемофилия В, дефицит коагулирующего фактора XI, дефицит коагулирующего фактора VII); вызванные тромбоцитопенией, или болезнью Виллебранда, или ингибиторами факторов свертывания крови, и кровоизлияние в мозг или чрезмерное кровотечение по любой причине. Препараты также можно вводить пациентам в сочетании с хирургической операцией или другими повреждениями, или пациентам, проходящим антикоагулянтное лечение, в особенности, когда подобные состояния требуют дозу больше, чем 40 мкг/кг веса тела.

Термин «лечение» означает ведение и забота о субъекте, например млекопитающем, в особенности человеке, с целью противодействия заболеванию, состоянию или расстройству и включает введение полипептида фактора VII, чтобы предотвратить начало симптомов или осложнений, или облегчить симптомы или осложнения, или устранить заболевание, состояние или расстройство. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие полипептид фактора VII, можно вводить парентерально субъектам при необходимости подобного лечения. Парентеральное введение можно осуществлять в ходе подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции посредством шприца, возможно шприц-ручки. Альтернативно, парентеральное введение можно осуществлять с помощью инфузионного насоса.

В важных воплощениях фармацевтическая композиция приспособлена к подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции согласно способам, известным из уровня техники.

Набор и способ применения этого набора

Принимая во внимание вышеизложенное, по настоящему изобретению также предложен набор, включающий новый контейнер, определенный выше. Таким образом, по настоящему изобретению предложен набор, включающий (1) закрытый первый контейнер, содержащий твердую фармацевтическую композицию активированного полипептида фактора VII, и (2) второй контейнер, содержащий жидкий водный растворитель для указанной твердой фармацевтической композиции, где первый контейнер включает композицию, содержащую активированный полипептид фактора VII в диапазоне 2,5-90 мг на 1 мл объема первого контейнера.

Первый контейнер, композиция и активированный полипептид фактора VII вообще и в частности являются такими, как определено выше для закрытого контейнера.

В одном воплощении первый контейнер и второй контейнер расположены в виде карпулы, где одно отделение соответствует первому контейнеру и другое смежное отделение соответствует второму контейнеру.

По настоящему изобретению также предложены медицинское применение этого набора, способ получения готовой к применению жидкой водной фармацевтической композиции активированного полипептида фактора VII из набора, как определено выше, способ, при котором смешивают твердую фармацевтическую композицию первого контейнера с по меньшей мере фракцией жидкого водного растворителя второго контейнера, чтобы образовалась готовая к применению жидкая водная фармацевтическая композиция активированного полипептида фактора VII.

В одном варианте способа по существу весь жидкий водный растворитель второго контейнера смешивают с твердой фармацевтической композицией первого контейнера.

Активированный полипептид фактора VII

Используемые здесь термины «FVII», «полипептид фактора VII» или «полипептид FVII» означают любой белок, содержащий аминокислотную последовательность 1-406 человеческого фактора VIIa дикого типа (т.е. полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США № 4784950), его варианты, а также родственные фактору VII полипептиды, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII. Они включают варианты FVII, родственные фактору VII полипептиды, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII, проявляющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность относительно человеческого фактора VIIa дикого типа.

Предполагается, что термин «фактор VII» охватывает полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также те, которые протеолитически обрабатывали с получением их соответствующих биоактивных форм, которые можно обозначить как фактор VIIa. Обычно фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с получением фактора VIIa. Подобные варианты фактора VII могут проявлять разные свойства относительно фактора VII человека, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, измененную специфическую активность и тому подобное.

Как используется здесь, «человеческий FVIIa дикого типа» представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США № 4784950.

Как используется здесь, «родственные фактору VII полипептиды» охватывают полипептиды, включающие варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa по существу модифицирована, например уменьшена относительно активности фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают без ограничения фактор VII или фактор VIIa, в специфическую аминокислотную последовательность которых введены изменения, которые модифицируют или нарушают биоактивность полипептида.

Используемый здесь термин «производное фактора VII» предназначен для обозначения полипептида FVII, проявляющего по существу такую же или улучшенную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, в котором одна или более аминокислот исходного пептида генетически, и/или химически, и/или ферментативно модифицированы, например, путем алкилирования, гликозилирования, ПЭГилирования, ацилирования, образования эфира или образования амида или тому подобного. Он включает, не ограничиваясь этим, ПЭГилированный человеческий фактор VIIa, цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa и их варианты. Неограничивающие примеры производных фактора VII включают гликоПЭГилированные производные FVII, как раскрыто в WO 03/31464 и заявках на патент США US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 и US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); конъюгаты FVII, как раскрыто в WO 01/04287, заявке на патент США 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 02/02764, заявке на патент США 20030211094 (University of Minnesota).

Термин «улучшенная биологическая активность» относится к полипептидам FVII (1) по существу с такой же или увеличенной протеолитической активностью по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа, или (2) к полипептидам FVII по существу с такой же или увеличенной TF-связывающей активностью по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа или (3) к полипептидам FVII по существу с таким же или увеличенным временем полужизни в плазме крови по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа. Термин «ПЭГилированный человеческий фактор VIIa» означает человеческий фактор VIIa, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с полипептидом человеческого фактора VIIa. Следует понимать, что молекула ПЭГ может быть присоединена к любой части полипептида фактора VIIa, включая любой аминокислотный остаток или углеводный фрагмент полипептида фактора VIIa. Термин «цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa» означает фактор VIIa, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с сульфгидрильной группой цистеина, введенного в человеческий фактор VIIa.

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих по существу такую же или увеличенную протеолитическую активность по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа, включают S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты FVIIa, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, как раскрыто в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54, 1999); варианты FVII, как раскрыто в PCT/DK02/00189 (соответствует WO 02/077218); и варианты FVII, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, как раскрыто в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты FVII, содержащие модифицированный Gla-домен и проявляющие повышенное связывание с мембранами, как раскрыто в WO 99/20767, патентах США US 6017882 и US 6747003, заявке на патент США 20030100506 (University of Minnesota) и WO 00/66753, заявках на патент США US 20010018414, US 2004220106 и US 200131005, патентах США US 6762286 и US 6693075 (University of Minnesota); и варианты FVII, как раскрыто в WO 01/58935, патенте США US 6806063, заявке на патент США 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS) и WO 04/111242 (Maxygen ApS), а также в WO 04/108763 (Canadian Blood Services).

Неограничивающие примеры вариантов FVII, имеющих увеличенную биологическую активность по сравнению с FVIIa дикого типа, включают варианты FVII, как раскрыто в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (соответствует WO 03/027147), заявке на патент Дании РА 2002 01423 (соответствует WO 04/029090), заявке на патент Дании РА 2001 01627 (соответствует WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты FVIIa с повышенной активностью, как раскрыто в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst).

и FVII, содержащий замены, добавления или делеции в аминокислотной последовательности от 233Thr до 240Asn; FVII, содержащий замены, добавления или делеции в аминокислотной последовательности от 304Агд до 329Cys; и FVII, содержащий замены, добавления или делеции в аминокислотной последовательности от 153lle до 223Arg.

Для целей изобретения биологическую активность полипептидов фактора VII («биологическая активность фактора VII») можно определить количественно, измеряя способность препарата ускорять свертывание крови с использованием дефицитной по фактору VII плазмы и тромбопластина, как описано, например, в патенте США № 5997864. В этом анализе биологическую активность выражают в виде сокращения времени свертывания относительно контрольного образца и переводят в «единицы фактора VII» путем сравнения со стандартом смешанной сыворотки человека, содержащим 1 единицу/мл активности фактора VII. Альтернативно, биологическую активность фактора VIIa можно определить количественно

(1) Измеряя способность полипептида фактора VII образовывать активированный фактор Х (фактор Ха) в системе, содержащей TF (тканевый фактор), погруженный в липидную мембрану, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924. 1997);

(2) Измеряя гидролиз фактора Х в водной системе («анализ протеолиза in vitro» (анализ 2), ниже);

(3) Измеряя физическое связывание полипептида фактора VII с TF, используя прибор, основанный на поверхностном плазменном резонансе (Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997);

(4) Измеряя гидролиз синтетического субстрата под действием полипептида фактора VII («анализ гидролиза in vitro» (анализ 1), ниже); и

(5) Измеряя образование тромбина в TF-независимой in vitro системе («анализ образования тромбина» (анализ 3), ниже).

В некоторых воплощениях полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека, предпочтительно рекомбинантно полученный фактор VIIa человека.

В других воплощениях полипептид фактора VII представляет собой вариант последовательности фактора VII.

В некоторых воплощениях полипептид фактора VII имеет гликозилирование, отличное от человеческого фактора VII дикого типа.

В разных воплощениях, например тех, где полипептид фактора VII представляет собой родственный фактору VII полипептид или вариант последовательности фактора VII, соотношение между активностью полипептида фактора VII и активностью нативного фактора Vita человека (FVIIa дикого типа) составляет по меньшей мере приблизительно 1,25, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2,0 или 4,0, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 8,0, при проведении «анализа протеолиза in vitro» (анализ 2), как описано в настоящем описании.

В некоторых воплощениях полипептиды фактора VII представляют собой родственные фактору VII полипептиды, в особенности варианты, где соотношение между активностью указанного полипептида фактора VII и активностью нативного фактора VIIa человека (FVIIa дикого типа) составляет по меньшей мере приблизительно 1,25 при проведении «анализа гидролиза in vitro» (см. анализ 1 ниже); в других воплощениях соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 2,0; в дополнительных воплощениях соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 4,0.

Композиции по настоящему изобретению полезны в виде стабильных и предпочтительно готовых к применению композиций полипептидов фактора VII. Композиции обычно стабильны в течение по меньшей мере шести месяцев и предпочтительно вплоть до 36 месяцев, когда хранятся при температурах, находящихся в пределах от 2°С до 8°С.

Предполагают, что термин «стабильный» означает, что (1) после хранения в течение 6 месяцев при 2°С-8°С композиция сохраняет по меньшей мере 50% своей начальной биологической активности, как измерено в ходе одностадийного анализа свертывания (анализ 4), или (2) после хранения в течение 6 месяцев при 2°С-8°С увеличение содержания продуктов расщепления тяжелой цепи составляет самое большее 40% (мас./мас.) от начального содержания полипептида фактора VII.

Термин «начальное содержание» относится к количеству полипептида фактора VII, добавленного к композиции при получении композиции.

Предпочтительно стабильная композиция сохраняет по меньшей мере 70%, например по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% своей начальной биологической активности после хранения в течение 6 месяцев при 2°С - 8°С.

Предпочтительно в разных воплощениях увеличение содержания продуктов расщепления тяжелой цепи в стабильных композициях составляет приблизительно не более 30% (мас./мас.), приблизительно не более 25% (мас./мас.), приблизительно не более 20% (мас./мас.), приблизительно не более 15% (мас./мас.), приблизительно не более 10% (мас./мас.), приблизительно не более 5% (мас./мас.) или приблизительно не более 3% (мас./мас.) от начального содержания полипептида фактора VII.

В предпочтительном воплощении композиция (1) после хранения в течение 6 месяцев при 20°С - 28°С сохраняет по меньшей мере 50% своей начальной биологической активности, как измерено в ходе одностадийного анализа свертывания (анализ 4), или (2) после хранения в течение 6 месяцев при 20°С - 28°С увеличение содержания продуктов расщепления тяжелой цепи составляет самое большее 40% (мас./мас.) от начального содержания полипептида фактора VII. В более предпочтительном воплощении композиция (1) после хранения в течение 6 месяцев при 37°С - 43°С сохраняет по меньшей мере 50% своей начальной биологической активности, как измерено в ходе одностадийного анализа свертывания (анализ 4), или (2) после хранения в течение 6 месяцев при 37°С - 43°С увеличение содержания продуктов расщепления тяжелой цепи составляет самое большее 40% (мас./мас.) от начального содержания полипептида фактора VII.

Получение и очистка полипептидов фактора VII

Очищенный фактор VIIa человека, пригодный для применения по настоящему изобретению, предпочтительно получают по технологии рекомбинантных ДНК, например, как описали Hagen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, или как описано в европейском патенте № 0200421 (ZymoGenetics, Inc.).

Фактор VII можно также получить способами, описанными Broze и Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 и Hedner и Kisiel, J.Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983. Эти способы дают фактор VII без детектируемых количеств других факторов свертывания крови. Даже дополнительно очищенный препарат фактора VII можно получить, включая дополнительную гель-фильтрацию в качестве конечной стадии очистки. Фактор VII затем превращают в активированный фактор VIIa известными способами, например под действием нескольких разных белков плазмы, таких как фактор XIla, IXa или Ха. Альтернативно, как описали Bjoem et al. (Research Disclosure, 269, сентябрь 1986, стр.564-565), фактор VII можно полностью активировать, пропуская его через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) или подобную, или в ходе самоактивации в растворе.

Родственные фактору VII полипептиды можно получить в ходе модификации фактора VII дикого типа или рекомбинантной технологией. Родственные фактору VII полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью по сравнению с фактором VII дикого типа можно получить, модифицируя последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VII дикого типа, либо изменяя кодоны аминокислот, либо удаляя некоторые кодоны аминокислот в нуклеиновой аминокислоте, кодирующей природный фактор VII, известными способами, например в ходе сайт-специфического мутагенеза.

Квалифицированному специалисту в данной области должно быть очевидно, что замещения могут быть выполнены вне участков, определяющих функцию молекулы фактора VIIa, и все же приводить к активному полипептиду. Аминокислотные остатки, необходимые для активности полипептида фактора VII, и поэтому предпочтительно не подвергаемые замещению, можно определить согласно известным в данной области процедурам, таким как сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (см., например, Cunningham и Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем способе мутации вводятся в каждый положительно заряженный остаток молекулы и полученные в результате мутантные молекулы испытывают на коагулянте, соответственно на активность сшивания, чтобы установить аминокислотные остатки, которые определяют активность молекулы. Сайты взаимодействий субстрат-фермент также можно установить в ходе анализа трехмерной структуры, определяемой такими методами, как анализ ядерного магнитного резонанса, кристаллография или фотоаффинное мечение (см., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Введение мутации в последовательность нуклеиновой кислоты, чтобы заменить один нуклеотид на другой нуклеотид, можно выполнить в ходе сайт-направленного мутагенеза, используя любой способ, известный в данной области. Особенно подходит процедура, при которой используют вектор суперспиральной двухцепочечной ДНК со вставкой интересующего и двух синтетических праймеров, содержащих требуемую мутацию. Праймеры олигонуклеотидов, каждый комплементарен противоположной цепи вектора, вытягиваются при циклическом изменении температуры посредством Pfu ДНК полимеразы. При объединении праймеров образуется мутированная плазмида, содержащая неравномерно расположенные одноцепочечные разрывы. После циклического изменения температуры продукт обрабатывают Dpnl, который является специфическим для метилированной и полуметилированной ДНК, чтобы обработать матрицу родительской ДНК и выбрать содержащую мутацию, синтезированную ДНК. Также можно использовать другие процедуры, известные в данной области, для создания, распознавания и выделения вариантов, такие как, например, методы перемещения генов или фагового дисплея.

Отделение полипептидов от их клетки источника можно осуществить любым известным в данной области способом, включая без ограничения удаление среды клеточной культуры, содержащей требуемый продукт, из культуры адгезивных клеток, центрифугирование и фильтрацию, чтобы удалить неприлипающие клетки, и тому подобное.

Возможно, полипептиды фактора VII затем могут быть очищены. Очистку можно выполнить, используя любой известный в данной области способ, включая без ограничения аффинную хроматографию, такую как, например, на колонке с антителами к антифактору VII (см., например, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; и Thim et al., Biochem. 27: 7785, 1988); хроматографию гидрофобного взаимодействия; ионообменную хроматографию; эксклюзионную хроматографию; электрофоретические способы (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное. В общем см. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; и Protein Purification, J.C.Janson и Lars Ryden, редакторы, VCH Publishers, New York, 1989. После очистки препарат предпочтительно содержит менее 10% по массе, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% полипептидов не фактора VII, полученных из клетки-хозяина.

Если при получении концентрата полипептид фактора VII не полностью активирован, то полипептиды фактора VII можно активировать протеолитическим расщеплением, используя фактор XIIa или другие протеазы, имеющие трипсинподобную специфичность, такие как, например, фактор IXa, калликреин, фактор Ха и тромбин. См., например, Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, патент США № 4456591; и Meaner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983). Альтернативно, полипептиды фактора VII можно активировать, пропуская их через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q^® (Pharmacia) или подобную, или в ходе самоактивации в растворе.

ЭКСПЕРИМЕНТЫ

Общие методы

Анализы, пригодные для определения биологической активности полипептидов фактора VII

Полипептиды фактора VII, полезные согласно настоящему изобретению можно выбрать в ходе соответствующих анализов, которые можно выполнить в виде простых предварительных in vitro испытаний. Таким образом, настоящее описание раскрывает простой тест (озаглавленный «анализ гидролиза in vitro») на активность полипептидов фактора VII.

Анализ гидролиза in vitro (анализ 1)

Нативный (дикого типа) фактор VIIa и полипептид фактора VII (оба именуемые в дальнейшем как «фактор VIIa») могут быть исследованы на специфические активности. Также их можно анализировать параллельно, чтобы непосредственно сравнить их специфические активности. Анализ проводят на планшете микротитратора (MaxiSorp, Nunc, Дания). Хромогенный субстрат D-lle-Pro-Arg-п-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Швеция), конечная концентрация 1 мМ, добавляют к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки.

Поглощение при 405 нм измеряют непрерывно на планшет-ридере SpectraMax 340 (Molecular Devices, США). Поглощение, возникающее в течение 20-минутной инкубации, за вычетом поглощения в лунке холостой пробы, не содержащей фермент, используют для вычисления соотношения между активностями полипептида фактора VII и фактора VIIa дикого типа:

Соотношение = (А405 нм полипептида фактора VII) / (А405 нм фактора VIIa дикого типа)

На основании этого можно распознать полипептиды фактора VII с активностью ниже, сопоставимой или выше, чем нативного фактора VIIa, такие как, например, полипептиды фактора VII, где соотношение между активностью полипептида фактора VII и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет приблизительно 1,0 и больше 1,0.

Активность полипептидов фактора VII также можно измерить, используя физиологический субстрат, такой как фактор Х («анализ протеолиза in vitro»), соответственно при концентрации 100-1000 нм, причем образованный фактор Ха измеряют после добавления подходящего хромогенного субстрата (например, S-2765). Кроме того, анализ активности можно проводить при физиологической температуре.

Анализ протеолиза in vitro (анализ 2)

Нативный (дикого типа) фактор VIIa и полипептид фактора VII (оба именуемые в дальнейшем как «фактор VIIa») исследуют параллельно, чтобы непосредственно сравнить их специфические активности. Анализ проводят на планшете микротитратора (MaxiSorp, Nunc, Дания). Фактор VIIa (10 нМ) и фактор Х (0,8 микроМ) в 100 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки, инкубируют в течение 15 минут. Расщепление фактора Х затем останавливают, добавляя 50 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки. Количество образованного фактора Ха измеряют путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-п-нитроанилид (S-2765, Chromogenix, Швеция), конечная концентрация 0,5 мМ. Поглощение при 405 нм измеряют непрерывно на планшет-ридере SpectraMax 340 (Molecular Devices, США). Поглощение, возникающее в течение 10 минут, за вычетом поглощения в лунке холостой пробы, не содержащей FVIIa, используют для вычисления соотношения между протеолитическими активностями полипептида фактора VII и фактора VIIa дикого типа:

Соотношение = (А405 нм полипептида фактора VII) / (А405 нм фактора VIIa дикого типа)

На основании этого можно распознать полипептиды фактора VII с активностью ниже, сопоставимой или выше, чем нативного фактора VIIa, такие как, например, полипептиды фактора VII, где соотношение между активностью полипептида фактора VII и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет приблизительно 1,0 и больше 1,0.

Анализ образования тромбина (анализ 3)

Способность полипептидов фактора VII образовывать тромбин можно измерить в пробе (анализ 3), содержащей все соответствующие коагулирующие факторы и ингибиторы при фициологических концентрациях (за вычетом фактора VIII при имитации состояний гемофилии А) и активированные тромбоциты (как описано на стр.543 у Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, который включен сюда путем ссылки).

Одностадийный анализ коагуляции (анализ свертывания) (анализ 4)

Полипептиды фактора VII также можно исследовать на специфические активности («активность свертывания»), используя одностадийный анализ коагуляции (анализ 4). С этой целью исследуемый образец разбавляют 50 мМ PIPES-буфером (рН 7,2), 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки) и 40 мкл инкубируют с 40 мкл дефицитной по фактору VII плазмы и 80 мкл Инновина® (Innovin®, Dade-Behring; кат. № В4212-50). Времена коагуляции (времена свертывания) измеряют и сравнивают с градуировочной кривой, используя стандартный образец в параллельной группе анализов.

Расщепление тяжелой цепи и окисленные формы (анализ 5)

В нижеприведенных рабочих примерах содержание продуктов расщепления тяжелой цепи и содержание окисленных форм определяют обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), как описано ниже:

Обращенно-фазовую ВЭЖХ выполняли на запатентованной 4,5×250 мм колонке с бутилсвязанным силикагелем с размером частиц 5 мкм и размером пор 300 Å. Температура колонки: 70°С. А-буфер: 0,1% об./об. трифторуксусная кислота.

Б-буфер: 0,09% об./об. трифторуксусная кислота, 80% об./об. ацетонитрил. Колонку элюировали с линеным градиентом от Х до (Х+13)% Б в течение 30 минут. Х регулировали таким образом, чтобы FVIIa элюировался со временем удерживания приблизительно 26 минут.Скорость потока: 1,0 мл/мин. Детектирование: 214 нм. Загрузка: 25 мкг FVIIa.

Содержание агрегатов (анализ 6)

В нижеприведенных рабочих примерах содержание агрегатов определяют неденатурирующей эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC), как описано ниже:

Неденатурирующую эксклюзионную хроматографию выполняли на колонке Waters Protein Pak 300 SW, 7,5×300 мм, используя 0,2 М сульфат аммония, 5% 2-пропанол, рН 7,0, в качестве подвижной фазы. Скорость потока: 0,5 мл/мин. Детектирование: 215 нм. Загрузка: 25 мкг FVIIa.

Определение содержания структур полипептидов дeзGla-фактора VII

Содержание структур полипептидов дeзGla-фактора VII относительно структур полипептидов фактора VII полной длины определяют в ходе электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). 150 мкл образца добавляют к 50 мкл буфера для образца (невосстанавливающий, NuPAGE) и кипятят в течение 5 минут. 10 мкл образца вводят в 12% BisTris NuPAGE гель (Invitrogen). Гель пропускают при 200 вольтах, 120 мА в течение 55 минут. Гель окрашивают, используя раствор кумасси бриллиантового голубого, обесцвечивают и высушивают.Относительное содержание полипептидов дeзGla-фактора VII вычисляют как площадь полосы полипептида дeзGla-фактора VII, деленная на площади полосы полипептида фактора VII приблизительно 50 кДа и полосы полипептида дeзGla-фактора VII приблизительно 45 кДа.

Альтернативно, содержание структур полипептидов дeзGla-фактора VII можно определить анионообменной ВЭЖХ. Метод отделяет полипептиды фактора VII без Gla-домена от исходных полипептидов фактора VII. Содержание полипептидов фактора VII без Gla-домена выражают в % от площади пика, относящегося к полипептиду фактора VII. В качестве аналитической колонки используют DNAPac PA-100, 250×4 мм (Dionex Corp.). Колонку элюируют с линейным градиентом от 0-0,5 М ацетата аммония при рН 9,0 более 30 минут при потоке 1,0 мл/мин. Измеряют поглощение эффлюента при 280 нм.

Примеры

Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Данные примеры включены только в качестве иллюстрации и в любом случае не ограничивают объем заявленного изобретения.

Пример 1

Концентрирование выполняют на колонке для анионообменной хроматографии (AIEC) (1,6 см внутренний диаметр × 7,5 см длина = 15 мл объем колонки (CV)), заполненной материалом Amersham Q-sepharose (Q-сефароза) Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 50 мМ NaCl, 20 мМ тринатрия цитрат, рН 7,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем промывают 7 CV, используя 50 мМ NaCl, 20 мМ тринатрия цитрат, рН 7,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 50 мМ NaCl, 20 мМ тринатрия цитрата, рН 4,2. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 3,3 CV, и элюат доводят до рН 6,0 / NaOH. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 3,3 мг/мл.

Пример 2

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Amersham Q-sepharose Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем осуществляют 5 CV промывку 1, используя 175 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0, и 5 CV промывку 2, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 30 мМ CaCl₂, 50 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,9 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 6,1 мг/мл.

Пример 3

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Amersham Q-sepharose Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем промывают 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 30 мМ CaCl₂, 50 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,9 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 5,4 мг/мл.

Пример 4

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Amersham Q-sepharose Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, с последующей промывкой 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 10 мМ CaCl₂, 50 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 2,2 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 4,6 мг/мл.

Пример 5

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Amersham Q-sepharose Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, с последующей промывкой 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,4 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 9,1 мг/мл.

Пример 6

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Amersham Q-sepharose Fast Flow, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 12 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, с последующей промывкой 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 10 мМ CaCl₂, 200 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Полную очистку проводят при скорости потока 40 CV/ч и температуре 5°С. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,4 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 10,0 мг/мл.

Пример 7

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 11 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем промывают 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Приведение в равновесие, загрузку и промывку проводят при скорости потока 80 CV/ч и температуре 5°С. Элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,5 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 6,6 мг/мл.

Пример 8

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 11 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем промывают 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 10 мМ CaCl₂, 200 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Приведение в равновесие, загрузку и промывку проводят при скорости потока 80 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,4 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 16,0 мг/мл.

Пример 9

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Загружают 11 CV раствора, содержащего 1,4 мг/мл FVIIa, затем промывают 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 5 CV до 30 мМ CaCl₂ , 100 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Приведение в равновесие, загрузку и промывку проводят при скорости потока 80 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 3,0 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 8,2 мг/мл.

Пример 10

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂ , затем промывают 5 CV, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 5 CV до 30 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 2,9 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 7,8 мг/мл.

Пример 11

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂, затем осуществляют 5 CV промывку 1, используя 50 мМ NaCl, 10 мМ гистидин, рН 6,0, и 2 CV промывку 2, используя 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 5 CV до 50 мМ CaCl₂, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 3,2 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 7,3 мг/мл.

Пример 12

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂, затем осуществляют 5 CV промывку 1, используя 5 мМ CaCl₂, 10 мМ гистидин, рН 6,0, и 2 CV промывку 2, используя 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 5 CV до 50 мМ CaCl₂ , забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 3,2 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 6,4 мг/мл.

Пример 13

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 НО, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂, затем осуществляют 5 CV промывку 1, используя 5 мМ CaCl₂, 10 мМ гистидин, рН 6,0, и 2 CV промывку 2, используя 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя ступенчатый градиент до 50 мМ CaCl₂, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 1,3 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 16,0 мг/мл.

Пример 14

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂ , затем промывают 6 CV, используя 5 мМ CaCl₂, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 5 CV до 50 мМ CaCl₂, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 2,8 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 7,8 мг/мл.

Пример 15

Концентрирование выполняют на AIEC колонке (такой же размер, как прежде), заполненной материалом Applied Biosystems POROS 50 HQ, уравновешенной раствором, содержащим 10 мМ глицилглицин, 5 мМ CaCl₂, рН 9,0. Загружают 22 CV раствора, содержащего 0,7 мг/мл FVIIa и 5 мМ CaCl₂, затем промывают 6 CV, используя 5 мМ CaCl ₂, 10 мМ гистидин, рН 6,0. Элюирование осуществляют, используя линейный градиент свыше 2 CV до 50 мМ CaCl₂, забуференный при рН 6,0 10 мМ гистидином. Загрузку и промывку проводят при скорости потока 120 CV/ч и температуре 5°С, элюирование выполняют при 40 CV/ч. Пик продукта элюируется после приблизительно 2,0 CV. Концентрация элюата, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ, составляет 9,0 мг/мл.

Условия анализов и аналитические данные по элюату из вышеописанных примеров 1-15 показаны в таблице 1 (ниже).

Осаждение

Пример 16

К 250 мл основного раствора rFVIIa с концентрацией 1,2 мг rFVIIa / мл в буфере, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂, 10 мМ глицилглицин, рН 6,4, добавляли 112,5 г сульфата аммония (насыщенность 65%). После 15 минут легкого перемешивания раствор центрифугировали в течение 1 часа при приблизительно 4000 G (4500 об/мин) в Heraus Sorvall Labofuge при 4°С. Осадок растворяли в 30 мл буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ гистидин, рН 6,0, и фильтровали через 0,2 мкМ фильтр. Концентрация rFVIIa во вновь растворенном осадке составляла 8,3 мг/мл, измеренная по ОП₂₈₀, и 7,8 мг/мл, измеренная с помощью ОФ-ВЭЖХ. Уровень расщепления тяжелой цепи составлял 8,3% до осаждения и 8,5% после осаждения. Наблюдалось небольшое снижение в GD-FVIIa и незначительное увеличение в олигомерах / димерах при осаждении (таблица 2).

Таблица 2
Результаты анализов до и после осаждения с сульфатом аммония
Образец	Концентрация rVIIa, мг/мл	Расщепление тяжелой цепи, %	Окисление, %	GD-FVIIa,%	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %
Основной раствор до осаждения	1,2	8,3	3,9	3,9	0,05	1,0
Основной раствор после осаждения	7,8	8,5	2,0	2,0	0,04	1,6

Ультрафильтрация

Пример 17

Labscale TFF System (Millipore, снабженная Pellicon XL Filter Device (сетчатым фильтровальным устройством) с Biomax 30 кД мембраной (Millipore № RXB030A50)) использовали для ультрафильтрации (UF) 247 мл основного раствора rFVIIa. UF выполняли при 2-8°С с потоком через мембрану 20-30 мл/минута и давлением на входе 1-1,5 бар. Перед UF основной раствор содержал 1,2 мг/мл rFVIIa в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ глицилглицином, рН 6,05. К основному раствору добавляли цитрат до конечной концентрации 20 мМ и затем концентрировали на UF-системе до объема 80 мл. Диафильтрацию выполняли при постоянном объеме, используя 400 мл буфера, содержащего 200 мМ NaCl, 1 мМ цитрат, рН 6,0. После диафильтрации раствор концентрировали до объема 40 мл. Концентрация rFVIIa после диафильтрации / концентрирования составляла 6,3 мг/мл, измеренная как по ОП₂₈₀, так и с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Не наблюдалось значительного изменения в уровнях расщепления тяжелой цепи, GD-FVIIa или полимеров, но уровень олигомеров / димеров немного увеличивался (таблица 3).

Таблица 3
Результаты анализов до и после диафильтрации / концентрирования в ходе UF
Образец	Расщепление тяжелой цепи,%	GD-FVIIa, %	Окисление, %	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %	Концентрация rVIIa, мг/мл
Основной раствор до ультрафильтрации	9,5	4,6	2,1	0,03	1,0	1,2
Основной раствор после ультрафильтрации	9,6	4,8	2,0	0,02	1,6	6,3

Пример 18

Такую же UF-систему, как в примере 17, использовали для концентрирования основного раствора rFVIIa без диафильтрации. Перед концентрированием объем основного раствора rFVIIa составлял 189 мл, и концентрация rFVIIa составляла 1,1 мг/мл в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂, 10 мМ глицилглицином, рН 6,05. Добавляли CaCl₂ так, чтобы конечная концентрация CaCl₂ увеличилась в итоге до 30 мМ. После концентрирования в ходе UF объем раствора составлял 23 мл, и концентрация rFVIIa составляла 7,1 мг/мл, как измерено по ОП₂₈₀, и 7,6, как измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Не наблюдалось значительного изменения в уровнях расщепления тяжелой цепи, GD-FVIIa, полимеров или олигомеров / димеров до UF и после UF (таблица 4).

Таблица 4
Результаты анализов до и после добавления CaCl2 и концентрирования в ходе UF
Образец	Расщепление тяжелой цепи, %	GD-FVIIa, %	Окисление, %	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %	Концентрация rVIIa, мг/мл
Основной раствор до ультрафильтрации	9,5	4,3	2,2	0,06	0,8	1,1
Основной раствор после ультрафильтрации	9,6	4,3	2,3	0,05	0,8	7,6

Пример 19

Такую же UF-систему, как в примере 17, использовали для концентрирования основного раствора rFVIIa без диафильтрации. Перед концентрированием объем основного раствора rFVIIa составлял 188 мл, и концентрация rFVIIa составляла 1,1 мг/мл в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂, 10 мМ глицилглицином, рН 6,81. Добавляли сахарозу до конечной концентрации 3% (мас./мас.). После концентрирования в ходе UF объем раствора составлял 25 мл, и концентрация rFVIIa составляла 8,3 мг/мл, как измерено по ОП₂₈₀, и 8,8, как измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Не наблюдалось значительного изменения в уровнях расщепления тяжелой цепи, GD-FVIIa, полимеров или олигомеров / димеров до UF и после UF (таблица 5).

Таблица 5
Результаты анализов до и после добавления сахарозы и концентрирования в ходе UF
Образец	Расщепление тяжелой цепи, %	GD-FVIIa, %	Окисление, %	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %	Концентрация rVIIa, мг/мл
Основной раствор до ультрафильтрации	11,5	4,6	0,02	0,02	0,4	1,1
Основной раствор после ультрафильтрации	11,9	4,9	0,02	0,02	0,5	8,8

Пример 20

Концентрирование rFVIIa от 1,5 мг/мл до 12,0 мг/мл выполняли, как в примере 19, но с 3% (мас./мас.) маннитом, добавленным вместо сахарозы. Раствор визуально был прозрачным в ходе концентрирования, и не наблюдалось значительного изменения в уровнях расщепления тяжелой цепи, окисления, GD-FVIIa, полимеров или олигомеров / димеров до UF и после UF.

Пример 21

Такую же UF-систему, как в примере 17, использовали для концентрирования основного раствора rFVIIa без диафильтрации. Перед концентрированием объем основного раствора rFVIIa составлял 203 мл, и концентрация rFVIIa составляла 1,3 мг/мл в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂, 10 мМ глицилглицином, рН 6,62. Добавляли NaCl так, чтобы конечная концентрация NaCl увеличилась в итоге до 100 мМ. После концентрирования в ходе UF объем раствора составлял 19 мл, и концентрация rFVIIa составляла 11,6 мг/мл, как измерено по ОП ₂₈₀, и 11,7, как измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Не наблюдалось значительного изменения в уровнях расщепления тяжелой цепи, GD-FVIIa, полимеров или олигомеров / димеров до UF и после UF (таблица 6).

Таблица 6
Результаты анализов до и после добавления NaCl и концентрирования в ходе UF
Образец	Расщепление тяжелой цепи, %	GD-FVIIa, %	Окисление, %	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %	Концентрация rVIIa, мг/мл
Основной раствор до ультрафильтрации	11,0	4,8	2,2	0,07	0,5	1,3
Основной раствор после ультрафильтрации	11,7	5,3	2,2	0,02	0,7	11,7

Пример 22

Такую же UF-систему, как в примере 17, использовали для концентрирования основного раствора rFVIIa без диафильтрации. Перед UF основной раствор содержал 1,42 мг/мл rFVIIa в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ глицилглицином, рН 6,0. Добавляли CaCl₂ так, чтобы конечная концентрация CaCl₂ увеличилась в итоге до 30 мМ. Основной раствор концентрировали на UF-системе до концентрации 25,3 мг/мл, как измерено по ОП ₂₈₀, и 24,1 мг/мл, как измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Раствор визуально был прозрачным в ходе концентрирования, и ОП₆₀₀ увеличилась только до 0,014 в конце концентрирования. Значительное изменение в уровнях расщепления тяжелой цепи, окисления, GD-FVIIa, полимеров или олигомеров / димеров до UF и после UF не наблюдалось (таблица 7).

Таблица 7
Результаты анализов до и после добавления CaCl2 и концентрирования в ходе UF
Образец	Расщепление тяжелой цепи, %	Окисление, %	GD-FVIIa, %	Полимеры, %	Олигомеры/ димеры, %	Концентрация rVIIa, мг/мл
Основной раствор до ультрафильтрации	10,3	1,7	5,2	0,02	0,6	1,4
Основной раствор после ультрафильтрации	10,2	1,6	5,1	0,02	0,7	24,1

Пример 23

Labscale TFF System (Millipore), снабженная Pellicon XL Filter Device с Biomax 30 кД мембраной (Millipore № RXB030A50) использовали для ультрафильтрации (UF) 234 мл основного раствора rFVIIa. UF выполняли при 2-8°С с потоком через мембрану 20-30 мл/минута и давлением на входе 1-1,5 бар. Перед UF основной раствор содержал 1,3 мг/мл rFVIIa в буфере с 50 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ глицилглицином, рН 5,53. Основной раствор концентрировали на UF-системе и в ходе концентрирования наблюдали за внешним видом раствора, прозрачность образцов измеряли по ОП₆₀₀. Когда основной раствор концентрировали до 42 мл (рассчитанная концентрация 7,2 мг/мл), раствор становился визуально непрозрачным, и образовывался осадок в образце, который оставляли на всю ночь при 2-8°С. Когда раствор затем концентрировали до 34 мл (рассчитанная концентрация 8,9 мг/мл), осадок наблюдался отчетливо. ОП₆₀₀ увеличивалась незначительно в ходе первой части концентрирования, но увеличивалась резко, когда концентрированный раствор уменьшался до 34 мл (чертёж).

Во всех вышеприведенных примерах, относящихся к ультрафильтрации, значительное изменение в специфической активности (ME на мкг полипептида фактора VII), измеренной в ходе анализа свертывания (анализ 4), не наблюдалось.

Изготовление композиций и стабильность

Пример 24

Чтобы исследовать стабильность концентрированного препарата rFVIIa, изготавливали следующую композицию:

15 мг/мл rFVIIa (соответствует 3,9 мг rFVIIa на 1 мл объема флакона)

1,55 мг/мл гистидина

1,32 мг/мл глицилглицина

5,84 мг/мл хлорида натрия

1,47 мг/мл хлорида кальция

25,0 мг/мл маннита

10,0 мг/мл сахарозы

0,07 мг/мл Твин 80

рН=5,50

Композицию получали из очищенного основного раствора (15,6 мг/мл). К основному раствору добавляли эксципиенты, полученный в результате раствор стерильно фильтровали, используя стерилизованный мембранный фильтр (размер пор 0,2 микрона или эквивалентный). По 1,0 мл полученного в результате раствора помещали в стерильные стеклянные флаконы (примерно 3,86 мл). Флаконы сушили сублимацией, закупоривали и закрывали алюминиевыми защелкивающимися крышками.

При 25°С была следующая стабильность:

Анализ	Время хранения при 25°С (месяцы)
0	1	2	3	6
Димеры/олигомеры (%)	3,9	3,8	3,9	4,6	3,9
Полимеры (%)	<0,3	<0,3	0,3	<0,3	<0,3
Расщепление тяжелой цепи (%)	12,2	11,5	11,7	11,6	11,6
Окисление (%)	3,0	2,0	2,2	2,1	2,3
Активность свертывания (МЕ/мл)	788500	699600	718400	866600	934400
Анализ	Время хранения при 25°С (месяцы)
9	12
Димеры/олигомеры (%)	3,2	2,6
Полимеры (%)	<0,3	0,3
Расщепление тяжелой цепи (%)	11,9	11,6
Окисление (%)	2,4	2,6
Активность свертывания (МЕ/мл)	749700	770700

При 40°С была следующая стабильность:

Анализ	Время хранения при 40°С (месяцы)
0	1	2	3
Димеры/олигомеры (%)	3,9	4,2	4,2	4,8
Полимеры (%)	0,3	0,3	0,3	0,3
Расщепление тяжелой цепи (%)	12,2	11,5	11,7	11,6
Окисление (%)	3,0	2,2	2,4	2,3
Активность свертывания (МЕ/мл)	788500	734500	736800	719700

Пример 25

Чтобы исследовать стабильность концентрированного препарата rFVIIa, изготавливали следующую композицию:

20 мг/мл rFVIIa (соответствует 13,0 мг rFVIIa на 1 мл объема флакона)

2,34 мг/мл хлорида натрия

1,55 мг/мл гистидина

5,15 мг/мл хлорида кальция × 2 Н20

25,0 мг/мл маннита

10,0 мг/мл сахарозы

0,07 мг/мл Твин 80

0,5 мг/мл метионина

рН=6,00

Композицию получали из очищенного основного раствора (20 мг/мл). К основному раствору добавляли эксципиенты, полученный в результате раствор стерильно фильтровали, используя стерилизованный мембранный фильтр (размер пор 0,2 микрона или эквивалентный). По 2,5 мл полученного в результате раствора помещали в стерильные стеклянные флаконы (примерно 3,86 мл). Флаконы сушили сублимацией, закупоривали и закрывали алюминиевыми защелкивающимися крышками.

При 25°С была следующая стабильность:

Анализ	Время хранения при 25°С (месяцы)
0	3
Димеры/олигомеры (%)	3,5	3,7
Полимеры (%)	50,1	0,1
Расщепление тяжелой цепи (%)	9,2	9,1
Окисление (%)	1,3	1,5
Активность свертывания (МЕ/мл)	1097500	988500

Пример 26

Чтобы исследовать стабильность концентрированного препарата rFVIIa, изготавливали следующую композицию:

20 мг/мл rFVIIa (соответствует 20 мг rFVIIa на 1 мл объема картриджа)

1,55 мг/мл гистидина

5,15 мг/мл хлорида кальция × 2 H₂O

1,22 мг/мл ингибитора 0008

рН=6,50

Композицию получали из очищенного основного раствора (20 мг/мл). К основному раствору добавляли эксципиенты, полученный в результате раствор стерильно фильтровали, используя стерилизованный мембранный фильтр (размер пор 0,2 микрона или эквивалентный). 3,0 мл полученного в результате раствора помещали в стерильный стеклянный картридж (примерно 3,00 мл) и закрывали алюминиевой крышкой.

При 5°С была следующая стабильность:

Анализ	Время хранения при 5°С (месяцы)
0	1	2	3
Расщепление тяжелой цепи (%)	8,6	8,5	8,7	9,1
Окисление (%)	1,1	1,2	1,3	1,7
Активность свертывания (МЕ/мл)	932600	1019300	1017700	1022700

Пример 27

Чтобы исследовать стабильность концентрированного препарата rFVIIa, изготавливали следующую композицию:

5 мг/мл rFVIIa (соответствует 5 мг rFVIIa на 1 мл объема картриджа)

1,55 мг/мл гистидина

122,5 мг/мл хлорида кальция × 2 H₂O

2,45 мг/мл ацетата натрия

рН=6,50

Композицию получали из очищенного основного раствора (7,1 мг/мл). К основному раствору добавляли эксципиенты, полученный в результате раствор стерильно фильтровали, используя стерилизованный мембранный фильтр (размер пор 0,2 микрона или эквивалентный). 3,0 мл полученного в результате раствора помещали в стерильный стеклянный картридж (примерно 3,00 мл) и закрывали алюминиевой крышкой.

При 5°С была следующая стабильность:

Анализ	Время хранения при 5°С (месяцы)
0	1	2	3	6	12
Активность свертывания (МЕ/мл)	267500	260500	241100	258900	229300	205800