вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция и их применение

Классы МПК:C12N9/12 переносящие фосфорсодержащие группы, например киназы (27)
C12N15/54 трансферазы (2)
A61K38/45 трансферазы (2)
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):КНЕХТ Вольфганг (SE),
МУНК-ПЕТЕРСЕН Биргитте (DK),
ПИСКУР Юре (SE)
Приоритеты:
подача заявки:
2001-05-07
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Предложены новые мутантные формы мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы Drosophila melanogaster (Dm-dNK) с измененными по сравнению с ферментом дикого типа кинетическими свойствами, экспрессия которых в клетке обеспечивает возможность снижения летальной для клетки дозы (LD100 ) по меньшей мере одного используемого в качестве пролекарства нуклеозидного аналога, выбранного из группы: AZT, ara-A, ara-C, ddC, ddA и 2 CdA. Описаны кодирующие варианты Dm-dNK нуклеотидные последовательности; раскрыты включающие их векторные конструкции, способ получения мутантных форм фермента и применение новых белков и полинуклеотидов в составе фармкомпозиций. Использование настоящего изобретения позволяет повысить эффективность и избирательность действия целого ряда известных цитотоксических и противовирусных препаратов. 6 с. и 1 з.п.ф-лы, 2 ил., 2 табл.

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

Формула изобретения

1. Выделенный вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, предназначенный для снижения летальной для клетки дозы по меньшей мере одного нуклеозидного аналога, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в dNK нумерации, выбранную из группы, состоящей из

- Dm-dNK/M51T/T168A/N220S;

- Dm-dNK/T62A/V167A/N321S;

- Dm-dNK/N91D/N134D;

- Dm-dNK/N100D/N134D;

- Dm-dNK/N100D/N134D/N318D/L347P;

- Dm-dNK/N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N;

- Dm-dNK/I102T/N318D;

- Dm-dNK/N114D/M217V/Y281H;

- Dm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N;

- Dm-dNK/M139V/N318D/L347P;

- Dm-dNK/V167A;

- Dm-dNK/V167A/I199M/N216S/M217V/D316N;

- Dm-dNK/V167A/N318D/L347P;

- Dm-dNK/T168A;

- Dm-dNK/T168A/N318D/L347P;

- Dm-dNK/T168A/I199M/N216S/M217V/D316N;

- Dm-dNK/I199M/V214A/N216S/M217V/D316N;

- Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N;

- Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N;

- Dm-dNK/S222W/F334L;

- Dm-dNK/Y228C/V277A/K309R; и

- Dm-dNK/N318D/L347P.

2. Выделенный мутированный полинуклеотид, кодирующий вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы по п.1.

3. Векторная конструкция для экспрессии мутантной мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, содержащая полинуклеотид по п.2.

4. Вектор по п.3, представляющий собой вирусный вектор, в частности вектор на основе вируса простого герпеса, аденовирусный вектор, вирусный вектор, ассоциированный с аденовирусом, или ретровирусный вектор.

5. Способ сенсибилизации клетки к по меньшей мере одному нуклеозидному аналогу, выбранному из группы, состоящей из AZT (3'-азидо-3'-тимидина), ara-А (аденозин-арабинозида; Vivarabine), ara-С (цитидин-арабинозида), 2',3'-дидезоксицитидина (ddC), 2',3'-дидезоксиаденозина (ddA), и 2-хлоро-2'-дезоксиаденозина (2CdA), который включает в себя стадии, на которых (1) трансфицируют указанную клетку полинуклеотидной последовательностью по п.2, кодирующей фермент, который способствует превращению указанного нуклеозидного аналога в (цитотоксическое) лекарственное средство; и (2) доставляют указанный нуклеозидный аналог в указанную клетку; где указанная клетка является более чувствительной к указанному (цитотоксическому) лекарственному средству, чем к указанному нуклеозидному аналогу.

6. Фармацевтическая композиция для обеспечения дезоксирибонуклеозидкиназной активности, содержащая мутированный полинуклеотид по п.2 или вектор по любому из пп.3 и 4 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

7. Фармацевтическая композиция, имеющая дезоксирибонуклеозидкиназную активность, содержащая терапевтически эффективное количество варианта фермента по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым вариантам мультисубстратных дезоксирибонуклеозидкиназ. Более конкретно, в данном изобретении предложены новые варианты дезоксирибонуклеозидкиназ, полученных от насекомых или низших позвоночных, в частности от Drosophila melanogaster, от Bombyx mori или от Xenopus laevis, новые полинуклеотиды, кодирующие варианты мультисубстратных нуклеозидкиназ, векторные конструкции, содержащие полинуклеотид, клетки-хозяева, несущие полинуклеотид или вектор, способы сенсибилизации клеток к пролекарствам, способ ингибирования патогенных агентов у теплокровных животных и фармацевтические композиции, содержащие варианты дезоксирибонуклеозидкиназ по изобретению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) образуется четырьмя дезоксирибонуклеозидтрифосфатами, получаемыми de novo и путем утилизации отходов метаболизма. Ключевым ферментом de novo пути является рибонуклеотидредуктаза, которая катализирует восстановление 2'-ОН группы нуклеозиддифосфатов, а ключевыми ферментами утилизации отходов метаболизма являются дезоксирибонуклеозидкиназы, которые фосфорилируют дезоксирибонуклеозиды в соответствующие дезоксирибонуклеозид-монофосфаты.

Дезоксирибонуклеозидкиназы из различных организмов различаются своей субстратной специфичностью, регуляцией генной экспрессии и клеточной локализацией. В клетках млекопитающих имеются четыре фермента с перекрывающимися специфичностями, тимидинкиназы 1 (ТК1) и 2 (ТК2), дезоксицитидинкиназа (dCK) и дезоксигуанозинкиназа (dGK), которые фосфорилируют пуриновые и пиримидиновые дезоксирибонуклеозиды. ТК1 и ТК2 являются пиримидинспецифичными и фосфорилируют дезоксиуридин (dUrd) и тимидин (dThd), a TK2 также фосфорилирует дезоксицитидин (dCyd).

dCK фосфорилирует dCyd, дезоксиаденозин (dAdo) и дезоксигуанозин (dGuo), но не dThd. dGK фосфорилирует dGuo и dAdo. TK1 является цитозольной, а ТК2 и dGK локализованы в митохондриях, хотя последние сообщения свидетельствуют также о цитоплазматической локализации ТК2.

В прокариотических клетках набор дезоксирибонуклеозидкиназ установлен не очень хорошо. Представляется, что у Е.coli присутствует только одна дезоксирибонуклеозидкиназа, которая была охарактеризована как ТК со сходством с TK1 млекопитающих. Представляется, что способность воздействовать на dCyd, dAdo и dGuo отсутствует. У Lactobacillus acidophilus, которая является дефицитной по рибонуклеотидредуктазе, четыре дезоксирибонуклеозида фосфорилируются тремя ферментами. Кроме ТК, имеющей сходство с ТК Е.coli, имеются два киназных комплекса, которые фосфорилируют dCyd, dAdo и dGuo. Комплекс I представляет собой dCK/dAK, a комплекс II представляет собой dGK/dAK.

Некоторые вирусы несут ген ТК. Вирусы герпеса имеют ТК, которая тоже может фосфорилировать dCyd, так же как и ТМР и dCMP. Герпетические киназы с относительно широкой субстратной специфичностью имеют много общих признаков с ТК2, dCK и dGK млекопитающих. В поксвирусах (poxviruses) закодирована ТК, очень похожая на TK1 млекопитающих.

До сих пор, однако, ни одна из известных вирусных, бактериальных или эукариотических дезоксирибонуклеозидкиназ не продемонстрировала фосфорилирования всех четырех дезоксирибонуклеозидов.

Недавно была выделена дезоксирибонуклеозидкиназа из Drosophila melanogaster, названная Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназа, Dm-dNK [Munch-Petersen В, Piskur J, and вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 L: Four Deoxynucleoside kinase Activities from Drosophila melanogaster Are Contained within a Single Monomeric Enzyme, a New Multifunctional Deoxynucleoside Kinase; J. Biol. Chem. 1998 273 (7) 3926-3931]. Затем соответствующий ген клонировали и сверхэкспрессировали [Munch-Petersen В, Knecht W, Lenz С, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 L and Piskur J: Functional expression of a multi-substrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679].

Киназа из Drosophila обладала способностью фосфорилировать все четыре дезоксирибонуклеозида. Это резко контрастирует со всеми известными дезоксирибонуклеозидкиназами, которые обладают различными, хотя и частично перекрывающимися субстратными специфичностями.

Каталитическая скорость дезоксирибонуклеозидного фосфорилирования посредством Dm-dNK была, в зависимости от субстрата, в 4-20000 раз выше, чем известная скорость для любой из дезоксирибонуклеозидкиназ млекопитающих. Метаболизм тимидина был в 70 раз выше, чем катализируемый тимидинкиназой (ТК) вируса 1 простого герпеса (HSV1). Кроме того, Dm-dNK была способна фосфорилировать широкий круг нуклеозидных аналогов, применяемых в химиотерапии рака или для борьбы с вирусными инфекциями.

Уникальные кинетические свойства Dm-dNK делают этот фермент интересным как для биотехнологического, так и для медицинского применения.

Например, ddNTPs, используемые для секвенирования, и dNTPs, используемые для ПЦР реакций (полимеразная цепная реакция), получают путем химического синтеза с токсичными химикатами, дающего ряд побочных продуктов. Эффективный ферментативный синтез монофосфатов из (ди)-дезоксирибонуклеозидов может стать одной из ключевых стадий ферментативного получения нуклеотидов, и Dm-dNK с ее широкой допустимостью субстратов и высокими каталитическими скоростями представляется очевидным кандидатом для решения этой задачи.

Дополнительным примером является применение дезоксирибонуклеозидкиназ в качестве суицидных генов в генной терапии рака или в генетической фармако-модуляционной терапии вирусных инфекций. Основной концепцией здесь является трансдукция раковых или инфицированных вирусом клеток геном, кодирующим HSV1-TK, и последующее воздействие на них нуклеозидным аналогом. Активацию нуклеозидного аналога в цитотоксическое или противовирусное соединение делает возможной трансдуцированная киназа. Эта концепция продемонстрировала усиление эффектов цитотоксических или противовирусных аналогов в сочетании с HSV1-TK, человеческой дезоксицитидинкиназой (dCK) и человеческой дезоксигуанозинкиназой (dGK). Ключевой стадией в активации большинства нуклеозидных аналогов является превращение в монофосфат.

Следовательно, кинетические свойства ферментов, катализирующих эту стадию, важны как для эффективности, так и для селективности этих лекарственных средств, и существует необходимость в выявлении лучших ферментов для дальнейшего развития этой терапевтической концепции. Dm-dNK с ее уникальными кинетическими свойствами была предложена в качестве кандидата для этой цели [Johansson M, Van Rompay A R, Degreves В, Balzarini J and Karlsson A: Cloning and characterization of multisubstrate deoxynucleoside kinase of Drosophilla melanogaster, J. Biol. Chem. 1999 274 (34) 23814-23819; и Munch-Petersen et al.; J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679].

Недавно в попытке найти лучшие комбинации суицидный ген-пролекарство для генной терапии методами генной инженерии были получены мутанты HSV1-TK с улучшенной специфичностью к нуклеозидным аналогам 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидину (Зидовудин, Retrovir®, AZT), ганцикловиру (Cytovene®, GCV) и ацикловиру (Zovirax®, ACV) путем опосредованного праймером случайного мутагенеза или перестановки семейства ДНК [Black M E, Newcomb T G, Wilson H M P and Loeb L A: Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 3523529; Christians F С, Scapozza L, Crameri A, Folkers G and Stemmer W P C: Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling; Nat. Biotechnol. 1999 17 259-264; and Kokoris M S, Sabo P, Adman E T and Black M E: Enhancement of tumor ablation by selected HSV-1 thymidine kinase mutant; Gene Therapy 1999 6 1415-1426].

Нуклеозидные аналоги с изменениями в 2'-дезоксирибозной группировке являются важными лекарственными средствами в медицине и предшественниками нуклеотидов, часто применяемых в биотехнологии.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является получение новых вариантов дезоксирибонуклеозидкиназ с увеличенными относительными каталитическими эффективностями в отношении разных субстратов. Эта задача решается тем, что предложены новые варианты мультисубстратных дезоксирибонуклеозидкиназ.

Соответственно, в первом аспекте данного изобретения предложены выделенные мутированные полинуклеотиды, кодирующие мультисубстратные дезоксирибонуклеозидкиназные ферменты, причем мутированный полинуклеотид по сравнению с немутированным полинуклеотидом при трансформации в бактериальную или эукариотическую клетку снижает по меньшей мере в 4 раза летальную дозу (LD100) по меньшей мере одного нуклеозидного аналога.

В другом аспекте изобретения предложены выделенные варианты дезоксирибонуклеозидкиназ, кодируемые полинуклеотидом по данному изобретению.

В третьем аспекте изобретения предложены векторные конструкции, содержащие полинуклеотид по данному изобретению.

В четвертом аспекте изобретения предложены линии упаковывающих клеток, способные продуцировать инфекционный вирион, содержащий вирусный вектор по данному изобретению.

В пятом аспекте изобретения предложены клетки-хозяева, несущие мутированный полинуклеотид по изобретению или вектор по изобретению.

В шестом аспекте изобретения предложены способы сенсибилизации клеток к пролекарствам, которые включают в себя стадии, на которых указанную клетку трансфицируют полинуклеотидной последовательностью по изобретению, кодирующей фермент, который способствует превращению указанного пролекарства в (цитотоксическое) лекарственное средство; и доставляют указанное пролекарство в указанную клетку; где указанная клетка является более чувствительной к указанному (цитотоксическому) лекарственному средству, чем к указанному пролекарству.

В седьмом аспекте изобретения предложены способы ингибирования патогенных агентов у теплокровных животных, при которых указанным животным вводят мутированный полинуклеотид по изобретению или вектор по изобретению.

В восьмом аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие мутированный полинуклеотид по изобретению или вектор по изобретению.

В девятом аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие вариант фермента по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Другие объекты станут очевидны специалисту в данной области техники из следующего подробного описания и примеров.

ПОДРОБНОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Мутантные Полинуклеотиды

В первом аспекте в данном изобретении предложены выделенные мутированные полинуклеотиды, кодирующие дезоксирибонуклеозидкиназные ферменты насекомых и низших позвоночных.

Мутантные полинуклеотиды по изобретению включают в себя ДНК, кДНК (комплементарная ДНК) и РНК последовательности, а также антисмысловые последовательности и включают в себя природные, синтетические и целенаправленно обработанные полинуклеотиды. Мутантные полинуклеотиды по изобретению также включают в себя последовательности, которые являются вырожденными вследствие генетического кода.

При определении здесь, термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, предпочтительно по меньшей мере 15 оснований длиной. Под "выделенным полинуклеотидом" подразумевается полинуклеотид, который не является непосредственно соприкасающимся с обеими кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно соприкасается (одна на 5' конце и одна на 3' конце) в природном геноме организма, из которого он получен. Этот термин, таким образом, включает в себя рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор экспрессии, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует в виде отдельной молекулы, например кДНК, независимой от других последовательностей.

При определении здесь, мутантный полинуклеотид представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается одним или более чем одним нуклеотидным положением по сравнению с немутированной (природной, дикого типа или родительской) нуклеотидной последовательностью. Мутированный полинуклеотид по изобретению может, в частности, содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант нуклеозидкиназы, имеющий аминокислотную последовательность, которая изменена в одном или более чем одном положении по сравнению с природным, дикого типа или родительским киназным ферментом.

В предпочтительном воплощении мутированные полинуклеотиды содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант нуклеозидкиназы, имеющий аминокислотную последовательность, которая изменена в одном или более чем одном положении, расположенном в безмотивных участках и/или только в одном мотивном участке, как определено в табл. 1 ниже.

В другом предпочтительном воплощении мутированный полинуклеотид по изобретению при трансформации в бактериальную или эукариотическую клетку способен снижать по меньшей мере в 4 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 8 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз летальную дозу (LD100) по меньшей мере одного нуклеозидного аналога по сравнению с немутированным (дикого типа) полинуклеотидом. В более предпочтительном воплощении нуклеозидный аналог представляет собой ацикловир (9-[2-гидрокси-этокси]-метил-гуанозин), буцикловир (buciclovir), фамцикловир, ганцикловир (9-[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил-метил]-гуанозин), пенцикловир, валцикловир, трифтортимидин, AZT (3'-азидо-3'-дезокситимидин), AIU (5'-иодо-5'-амино-2',5'-дидезоксиуридин), ara-А (аденозин-арабинозид; Vivarabine), ara-C (цитидин-арабинозид), ara-G (9-бета-D-арабинофуранозилгуанин), ara-Т, 1-бета-D-арабинофуранозилтимин, 5-этил-2'-дезоксиуридин, 5-иодо-5'-амино-2,5'-дидезоксиуридин, 1-[2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабино-фуранозил]-5-иодоурацил, идоксуридин (5-иодо-2'-дезоксиуридин), флударабин (2-фтороаденин-9-бета-D-арабинофуранозид), генцитабин, 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезокситимидин (ddT), 2',3'-дидезоксиаденозин (ddA), 2',3'-дидезоксигуанозин (ddG), 2-хлоро-2'-дезоксиаденозин (2CdA), 5-фтородезоксиуридин, BVaraU ((E)-5-(2-бромовинил)-1-бета-D-арабинофуранозилурацил), BVDU (5-бромовинил-дезоксиуридин), FIAU (1-(2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодоурацил), 3ТС (2'-дезокси-3'-тиацитидин), dFdC гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин), dFdG (2',2'-дифтородезоксигуанозин) или d4T (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин).

В еще одном предпочтительном воплощении мутированный полинуклеотид по изобретению при трансформации в бактериальную или эукариотическую клетку способен снижать по меньшей мере в 4 раза, предпочтительно по меньшей мере в 8 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз летальную дозу (LD100) по меньшей мере двух разных нуклеозидных аналогов, которые основаны на двух разных сахарных группировках и двух разных группировках оснований.

В предпочтительном воплощении мутированный полинуклеотид по изобретению имеет ДНК последовательность, представленную как SEQ ID NOS:9 или 11.

Варианты ферментов

В другом аспекте в изобретении предложены по существу чистые варианты дезоксирибонуклеозидкиназ.

В контексте данного изобретения, термин "вариант фермента" относится к полипептиду (или белку), имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности природного, родительского фермента или фермента дикого типа по одному или более чем одному аминокислотному положению, то есть его первичная аминокислотная последовательность изменена. Такие варианты ферментов включают в себя варианты, более подробно описанные ниже, а также консервативные замены, сплайс-варианты, изоформы, гомологи из других видов и полиморфизмы.

Новые варианты ферментов по изобретению можно, в частности, получить из мутированного полинуклеотида по изобретению, используя стандартную методику рекомбинантной ДНК.

В предпочтительном воплощении варианты ферментов по изобретению получены из мультисубстратной киназы. При определении здесь термин "мультисубстратный" относится к дезоксирибонуклеозидкиназному ферменту, способному обладать возможностью фосфорилировать все четыре природных нуклеозида, dC, dA, dG и dT (Thd). Способность фосфорилировать все четыре природных нуклеозида можно определить по соотношению максимальной специфической ферментативной активности (ферментативная активность/количество фермента) для dT и для любого из этих нуклеозидов (максимальная специфическая ферментативная активность для dT/максимальная специфическая ферментативная активность для dC, dG или dA). Это соотношение предпочтительно находится в пределах от 0,01 до 100.

В предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа изменен следующим образом:

1) соотношение "Kcat m(субстрат)/Кcat m(нуклеозидный аналог)" (то есть соотношение между, с одной стороны, "kcat/K m" для по меньшей мере одного природного субстрата и, с другой стороны, "kcat/K m" для по меньшей мере одного нуклеозидного аналога) уменьшено по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 20 раз; и/или

2) ингибирование по типу обратной связи дезоксирибонуклеозидтрифосфатом (dNTP) и, в частности, тимидинтрифосфатом (ТТР) уменьшено по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, при определении по его значению IC50 , используя 2 или 10 мкМ тимидина (dThd) в качестве субстрата.

В предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа снижает по меньшей мере в 4 раза, предпочтительно по меньшей мере в 8 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз летальную дозу (LD100 ) по меньшей мере двух разных нуклеозидных аналогов, которые основаны на двух разных сахарных группировках и двух разных группировках оснований.

dNK система нумерации

В контексте данного изобретения аминокислотные остатки (а также основания нуклеиновых кислот) указаны с использованием установленных однобуквенных символов.

При выравнивании аминокислотных последовательностей известных дезоксирибонуклеозидкиназных ферментов можно использовать определенную систему нумерации аминокислот, при помощи которой возможно однозначно присвоить номер аминокислотного положения любому аминокислотному остатку в любом нуклеозидкиназном ферменте, аминокислотная последовательность которого известна.

Такое выравнивание представлено в табл. 1 ниже. В этой таблице первый N-концевой аминокислотный остаток (то есть метионин; М) Dm-dNK имеет номер 51, а последний С-концевой аминокислотный остаток (то есть аргинин; R) Dm-dNK имеет номер 358.

В контексте данного изобретения эта система нумерации названа dNK системой нумерации.

При описании различных вариантов ферментов, полученных или предполагаемых согласно изобретению, для простоты упоминания использовали следующую номенклатуру:

Исходная аминокислота/Положение/Замещающая аминокислота

Согласно этой номенклатуре замена аланином валина в положении 167 обозначают "V167A".

Делецию метионина в положении 51 обозначают "М51".

Вставку дополнительного аминокислотного остатка, в данном примере аргинина, например, по соседству с положением 62, можно обозначить "T62TR" или "вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 63R" (предполагается, что в аминокислотной последовательности, используемой для установления системы нумерации, нет никакого положения для этого положения).

Вставку аминокислотного остатка, в данном примере глутамина, в положении, которое существует в установленной системе нумерации, но где никакой аминокислотный остаток в действительности не присутствует, можно обозначить "-116Q".

В таком случае "Dm-dNK/l199M/N216S/M217V/D316N" обозначает конкретный вариант, который может быть получен из Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназы путем замены метионином изолейцина в положении 199, и замены серином аспарагина в положении 216, и замены валином метионина в положении 217, и замены аспарагином аспарагиновой кислоты в положении 316, причем положения определены в соответствии с табл. 1 ниже.

Другие варианты ферментов, полученные из одного или разных источников, определяют аналогичным образом.

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

Dm-dNK Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназа [Munch-Petersen B, Knecht W, Lenz C, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 L and Piskur J. J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679; GenBank ACCN AF226281;

Представлена как SEQ ID NO: 1].

Bm-dNK Bombyx mori дезоксирибонуклеозидкиназа [GenBank ACCN AF226281; Представлена как SEQ ID NO:3, получена, как описано в Примере 3].

Xen-dNK Xenopus laevis дезоксирибонуклеозидкиназа [GenBank ACCN

AF250861; Представлена как SEQ ID NO: 5, получена, как описано в Примере 3].

hu-TK2 Человеческая тимидинкиназа 2 [GenBank ACCN 000142; Johansson M & Karlsson A; J. Biol. Chem. 1997 272 (13) 8454-8458].

hu-dGK Человеческая дезоксигуанозинкиназа [GenBank ACCN Q16854; Johansson M & Karlsson A; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996 93 (14) 7258-7262]

hu-dCK Человеческая дезоксицитидинкиназа [GenBank ACCN P27707; Chottiner, E. G., et al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991 88 (4) 1531-1535]

HSV1-TK тимидинкиназа вируса Herpes simplex [GenBank ACCN CAA23742; McKnight SL; Nucleic Acids Res. 1980 8 (24) 5949-5964]

"Мотив" означает сохраняющийся мотив аминокислот

- указывает на отсутствие (нет) аминокислоты в этом положении.

* указывает положения, где есть единичный, полностью сохраняющийся остаток.

. указывает на то, что одна из следующих "консервативных" групп полностью сохраняется:

-STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY или FYW.

В другом предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа мутирован:

(1) в безмотивном и/или несохраняющемся участке; и/или

(2) только в одном мотиве и/или сохраняющемся участке; и/или

(3) в любом сохраняющемся положении.

В еще одном предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа мутирован:

(1) в безмотивном участке; и/или

(2) только в одном мотивном участке; и/или

(3) в любом сохраняющемся положении.

При определении здесь мотивный участок обозначает любые из положений, локализованные в пределах любого из пяти мотивных участков, определенных в табл. 1 выше. Безмотивный участок представляет собой любой участок, содержащий аминокислотные остатки, не принадлежащие мотивному участку, как он определен выше.

При определении здесь сохраняющиеся положения представляют собой положения и участки, содержащие аминокислотные остатки, обозначенные звездочкой (*) или точкой (.) в табл. 1. В предпочтительном воплощении сохраняющийся участок выбирают из участков, содержащих аминокислотные остатки, обозначенные только звездочкой (*), то есть содержащие один полностью сохраняющийся остаток. Несохраняющийся участок представляет собой любой участок, содержащий аминокислотные остатки, не принадлежащие сохраняющимся положениям, как они определены выше.

В другом предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа несет мутацию (включая замены, вставки и делеции) в одном или более чем одном из следующих положений: 51, 62, 82, 91, 100, 102, 107, 112, 114, 134, 138, 139, 140, 164, 167, 168, 171, 199, 202, 207, 211, 213, 214, 216, 217, 220, 222, 228, 229, 274, 277, 281, 283, 284, 307, 309, 316, 318, 321, 334, 347 и 352 (dNK нумерация).

В более предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа содержит замену, консервативную по отношению к G80, N81, I82, G83, S84, G85, К86, Т87, Т88, Е107, Р108, V109, Е110, К111, W112, Y140, Q164, Е201, R202, S203, С210, Y211, С212, Р258, R265, I266, R267, Q268, R269, А270, R271, Е274, L279, L282 или L293 (dNK нумерация).

При определении здесь термин "консервативные замены" обозначает замену аминокислотного остатка другим, биологически сходным остатком. Примеры консервативных замен включают в себя

(1) замену неполярными или гидрофобными остатками, такими как аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, метионин, фенилаланин или триптофан, друг друга, в частности замену аланином, лейцином, изолейцином, валином или пролином друг друга; или

(2) замену одним нейтральным (незаряженным) полярным остатком, таким как серин, треонин, тирозин, аспарагин, глутамин или цистеин, другого остатка, в частности замену аргинином лизина, глутаминовой кислотой аспарагиновой кислоты, или глутамином аспарагина; или

(3) замену положительно заряженным остатком, таким как лизин, аргинин или гистидин, другого такого остатка; или

(4) замену отрицательно заряженным остатком, таким как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, другого такого остатка.

Термин консервативная замена также включает в себя использование замещающего аминокислотного остатка вместо родительского аминокислотного остатка при условии, что антитела, вырабатываемые к замещенному полипептиду, также являются иммунореактивными в отношении незамещенного полипептида.

В еще более предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа содержит одно или более чем одно из следующих изменений М51Т; Т62А; N91D; N100D; 1102Т; N114D; N134D; N134S; L138S; M139L; M139V; V167A; V167S; V167M; Т168А; M171R; I199М; A207D; V214A; N216S; M217V; N220S; S222W; Y228C; N229S; V277A; Y281H; S307P; K309R; D316N; N318D; N321S; F334L; L347P; и K352N (dNK нумерация).

В еще более предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению по сравнению с ферментом дикого типа содержит следующие изменения:

M51T/T168A/N220S;

T62A/V167A/N321S;

N91D/N134D;

N100D/N134D;

N100D/N134D/N318D/L347P;

N100D/N134D/I199M/N216S/M217WD316N;

I102T/N318D;

N114D/M217V/Y281H;

N134S/L138S/M139L/K352N;

M139V/N318D/L347P;

V167A/M171R/A207D;

V167S/M171R/A207D;

V167A/I199M/N216S/M217WD316N;

V167A/N318D/L347P;

T168A/N318D/L347P;

Т168A/I199M/N216S/M217WD316N;

M171R/A207D;

I199M/V214A/N216S/M217V/D316N;

I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N;

I199M/N216S/M217V/D316N;

S222W/F334L;

Y228C/V277A/K309R; или N318D/L347Pi

(dNK нумерация).

В предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению получен из человеческой тимидинкиназы 2 (hu-TK2); или человеческой дезоксигуанозинкиназы (hu-dGK); или человеческой дезоксицитидинкиназы (hu-dCK); или тимидинкиназы вируса Herpes simplex (HSV1-TK).

В другом предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению получен от насекомого или низшего позвоночного, в частности из Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназы (Dm-dNK), или Bombyx mori дезоксирибонуклеозидкиназы (Bm-dNK), или Xenopus laevis дезоксирибонуклеозидкиназы (Xen-dNK), или Anopheles gambia дезоксирибонуклеозидкиназы.

В более предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению представляет собой

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

В другом предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению представляет собой

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

В третьем предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению представляет собой

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

Гибридные ферменты

В особенно предпочтительном воплощении вариант дезоксирибонуклеозидкиназ по изобретению может представлять собой гибридную дезоксирибонуклеозидкиназу, полученную из двух или более чем двух мультисубстратных дезоксирибонуклеозидкиназ насекомых.

Гибридная дезоксирибонуклеозидкиназа по изобретению должна содержать по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15, еще более предпочтительно по меньшей мере 20, наиболее предпочтительно по меньшей мере 25 последовательных аминокислот, полученных из каждой мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы насекомых.

В предпочтительном воплощении гибридный киназный фермент получен из Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназы и/или Bombyx mori дезоксирибонуклеозидкиназы, и/или Xenopus laevis дезоксирибонуклеозидкиназы, и/или Anopheles gambia дезоксирибонуклеозидкиназы.

В более предпочтительном воплощении гибридный киназный фермент по изобретению получен из Drosophila melanogaster дезоксирибонуклеозидкиназы и Bombyx mori дезоксирибонуклеозидкиназы и содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:10, или аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:12.

Рекомбинантные векторы

В другом аспекте изобретения предложен рекомбинантный вектор, содержащий мутантный полинуклеотид по изобретению.

При определении здесь рекомбинантный вектор представляет собой экспрессирующий переносчик или рекомбинантную экспрессирующую конструкцию, используемую для введения полинуклеотидов в желаемую клетку. Вектор экспрессии может представлять собой вирусный вектор или плазмидный вектор, в который полинуклеотид по изобретению может быть встроен в прямой или обратной ориентации. Этот вектор также может представлять собой искусственный ген.

Подходящие экспрессирующие переносчики включают в себя, но не ограничены ими, эукариотические векторы, прокариотические векторы, например бактериальные линейные или кольцевые плазмиды, вирусные векторы, комплексы ДНК-белок, например комплексы ДНК-моноклональное антитело, и рецепторно-опосредованные векторы. Вектор, в частности, может находиться в липосоме.

Предпочтительные бактериальные векторы включают в себя рQЕ30, pQE70, pQE60, pQE-9 (доступный от Quigen); pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (доступный от Stratagene); pGEX-2T, PKK223-3, pKK233-3, pDR540 и pRIT5 (доступный от Pharmacia) и pASK75 (доступный от Biometra).

Предпочтительные эукариотические векторы включают в себя pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (доступный от Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (доступный от Pharmacia) и pTEJ-8 [FEBS Lett. 1990 267 289-294], и pcDNA-3 (доступный от Invitrogen). Предпочтительные дрожжевые векторы включают в себя pYES2 (доступный от Invitrogen).

Предпочтительные вирусные векторы включают в себя векторы на основе вируса простого герпеса (herpes simplex), аденовирусные векторы, ассоциированные с аденовирусом вирусные векторы, поксвекторы, парвовирусные векторы, бакуловирусные векторы и ретровирусные векторы.

Однако можно использовать любую другую плазмиду или вектор, если они реплицируемы и жизнеспособны в продуцирующем хозяине.

Вектор экспрессии может дополнительно содержать регуляторные последовательности в работоспособной комбинации с полинуклеотидной последовательностью по изобретению. При определении здесь, термин "в работоспособной комбинации" означает, что работающие элементы, то есть ген(ы) и регуляторные последовательности, работоспособным образом соединены так, чтобы осуществлять желаемую экспрессию. Промоторы являются примерами таких регуляторных последовательностей.

В предпочтительном воплощении вектор по изобретению содержит промотор, работоспособным образом соединенный с полинуклеотидом.

Регуляторные элементы можно выбирать из любого желаемого источника, а вектор можно получить, используя стандартные методики, известные в данной области техники, например описанные Sambrook et al. [Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989].

В предпочтительном воплощении вектор представляет собой вирусный вектор, в частности вектор на основе вируса простого герпеса (herpes simplex), аденовирусный вектор, ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор или ретровирусный вектор. Естественно, что выбор вектора и его регуляторных элементов зависит от целей экспрессии и находится на усмотрении специалистов в данной области техники.

В еще одном аспекте изобретения предложены линии упаковывающих клеток, способных продуцировать инфекционный вирион, содержащий вирусный вектор по изобретению.

Клетки-хозяева/продуцирующие клетки

В еще одном аспекте данного изобретения предложена продуцирующая клетка, генетически измененная так, что она содержат полинуклеотидную последовательность по изобретению и/или рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению. Клетка по изобретению может быть, в частности, генетически измененной так, чтобы временно или постоянно экспрессировать, сверх-экспрессировать или соэкспрессировать полипептид по изобретению. Способы осуществления временной и постоянной экспрессии известны в данной области техники.

Полинуклеотиды по изобретению можно встраивать в векторы экспрессии, например плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и работоспособным образом соединять с последовательностями, контролирующими экспрессию, путем лигирования таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с последовательностями, контролирующими экспрессию. Подходящие последовательности, контролирующие экспрессию, включают в себя промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, инициаторные кодоны, сигналы сплайсинга интронов и терминирующие кодоны, все поддерживаемые в правильной рамке считывания полинуклеотида по изобретению с тем, чтобы обеспечить возможность правильной трансляции мРНК. Последовательности, контролирующие экспрессию, могут также включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности партнеров по слиянию.

Промотор может представлять собой, в частности, конститутивный и индуцибельный промотор. При клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как pL бактериофага вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 , plac, ptrp, ptac (ptrp-lac гибридный промотор). При клонировании в системах млекопитающих можно использовать промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих, например промотор убиквитина, ТК промотор или промотор металлотионеинов, или из вирусов млекопитающих, например ретровирусный длинный концевой повтор, аденовирусный поздний промотор или 7.5К промотор вируса коровьей оспы. Промоторы, полученные при помощи методов рекомбинантной ДНК или синтетических методов, также можно использовать для обеспечения транскрипции полинуклеотида по данному изобретению.

Подходящие векторы экспрессии обычно содержат ориджин экспрессии, промотор, а также специфические гены, которые делают возможной фенотипическую селекцию трансформированных клеток, и включают в себя такие векторы, как вектор экспрессии на основе Т7 для экспрессии в бактериях [Rosenberg et al; Gene 1987 56 125], pTEJ-8, pUbi1Z, pcDNA-3 и pMSXND векторы экспрессии для экспрессии в клетках млекопитающих [Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 1988 263 3521], векторы, полученные из бакуловирусов, для экспрессии в клетках насекомых, и ооцитный вектор экспрессии PTLN [Lorenz С, Pusch М & Jentsch Т J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366].

В предпочтительном воплощении клетка по изобретению представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающих, например клетку человека, клетку собаки, клетку обезьяны, клетку крысы или клетку мыши, ооцит или дрожжевую клетку. Клетка по изобретению может представлять собой, без ограничения, клетку почки человеческого эмбриона (НЕК), например НЕК 293 клетку, ВНК21 клетку, клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку ооцита Xenopus laevis (XLO). В другом воплощении клетка по изобретению представляет собой грибную клетку, например клетку нитчатого гриба. В другом предпочтительном воплощении клетка представляет собой клетку насекомого, наиболее предпочтительно Sf9 клетку. Дополнительными предпочтительными клетками млекопитающих по изобретению являются клеточные линии РС12, HiB5, RN33b и человеческие невральные клетки-предшественники. Наиболее предпочтительными являются человеческие клетки.

Когда клетка по изобретению представляет собой эукариотическую клетку, введение гетерологичного полинуклеотида по изобретению можно, в частности, осуществить путем инфицирования (используя вирусный вектор), путем трансфекции (используя плазмидный вектор), используя осаждение фосфатом кальция, микроинъекцию, электропорацию, липофекцию или другие физико-химические методы, известные в данной области техники.

В более предпочтительном воплощении выделенную полинуклеотидную последовательность по изобретению и/или рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению трансфицируют в клетку-хозяин млекопитающего, невральную клетку-предшественника, астроцит, Т-клетку, гемопоэтическую стволовую клетку, неделящуюся клетку или церебральную эндотелиальную клетку, содержащую по меньшей мере одну молекулу ДНК, способную опосредовать клеточную иммортализацию и/или трансформацию.

Активацию эндогенного гена в клетке-хозяине можно осуществить путем введения регуляторных элементов, в частности, путем введения промотора, способного воздействовать на транскрипцию эндогенного гена, кодирующего вариант фермента по изобретению.

Способ получения полипептидов

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения выделенного варианта фермента по изобретению. В способе по изобретению подходящую продуцирующую клетку изменяют генно-инженерным путем посредством введения экзогенных полинуклеотидов, чтобы сделать возможной экспрессию варианта фермента, и эту клетку культивируют в условиях, дающих возможность продуцирования полипептида с последующим извлечением желаемого полипептида.

Полинуклеотид по изобретению можно ввести в желаемую продуцирующую или хозяйскую клетку способами, известными в данной области техники, например описанными Sambrook et al. [Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989]. Можно применять любую методику, которая облегчает введение экзогенных полинуклеотидов в желаемую клетку, включая такие методы, как трансдукция, трансфекция, трансформация, инфицирование и так далее.

Полинуклеотид по изобретению можно, в частности, получить при помощи сайт-направленного мутагенеза или даже при помощи случайного мутагенеза.

Полинуклеотид по изобретению может быть получен из любого подходящего источника. Полинуклеотид по изобретению предпочтительно получают от насекомого или низшего позвоночного. В более предпочтительном воплощении полинуклеотид по изобретению получают на основе любой общедоступной библиотеки кДНК.

В предпочтительном воплощении полинуклеотид по изобретению можно получить, используя ПЦР праймеры, описанные в рабочих примерах и представленные как SEQ ID NOS: 7-8 и 13-20.

Выделенный полинуклеотид по изобретению можно получить способами, известными в данной области техники, например описанными в рабочих примерах ниже.

Биологическая активность

В противоположность большинству известных дезоксирибонуклеозидкиназ, которые обладают различными, хотя и частично перекрывающимися субстратными специфичностями и эффективностями, варианты дезоксирибонуклеозидкиназ по изобретению демонстрируют увеличенные относительные эффективности по отношению к разным субстратам по сравнению с ферментом дикого типа.

В предпочтительном воплощении соотношение "k cat (каталитическая константа)/Кm (субстрат)/Кcatm (нуклеозидный аналог)" (то есть соотношение между, с одной стороны, "kcat/Km " для по меньшей мере одного нативного субстрата и, с другой стороны, "kcat/Km " для по меньшей мере одного нуклеозидного аналога) снижено по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 20 раз.

При определении здесь считают, что вариант киназного фермента обладает увеличенной чувствительностью, если его фосфорилирующая активность увеличивается более чем однократно по сравнению с ферментом дикого типа (родительским) в отношении одного или более чем одного его субстрата.

В предпочтительном воплощении другой субстрат представляет собой нуклеозидный аналог. Предпочтительные нуклеозидные аналоги включают в себя ацикловир (9-[2-гидрокси-этокси]-метил-гуанозин), буцикловир (buciclovir), фамцикловир, ганцикловир (9-[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил-метил]-гуанозин), пенцикловир, валцикловир, трифтортимидин, AZT (3'-азидо-3'-тимидин), AIU (5'-иодо-5'-амино-2',5'-дидезоксиуридин), ara-А (аденозин-арабинозид; Vivarabine), ara-С (цитидин-арабинозид), ara-G (9-бета-D-арабинофуранозилгуанин), ara-Т, 1-бета-D-арабинофуранозилтимин, 5-этил-2'-дезоксиуридин, 5-иодо-5'-амино-2,5'-дидезоксиуридин, 1-[2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабинофуранозил]-5-иодоурацил, идоксуридин (5-иодо-2'-дезоксиуридин), флударабин (2-фтороаденин-9-бета-D-Арабинофуранозид), генцитабин, 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезокситимидин (ddT), 2',3'-дидезоксиаденозин (ddA), 2',3'-дидезоксигуанозин (ddG), 2-хлоро-2'-дезоксиаденозин (2CdA), 5-фтородезоксиуридин, BVaraU ((E)-5-(2-бромовинил)-1-бета-D-арабинофуранозилурацил), BVDU (5-бромовинил-дезоксиуридин), FIAU (1-(2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодоурацил), 3ТС (2'-дезокси-3'-тиацитидин), dFdC гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин), dFdG гемцитабин (2',2'-дифтородезоксигуанозин), или d4T (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин).

Генная терапия возникла недавно как новый способ терапевтического вмешательства для лечения различных видов рака. Кроме того, этот подход можно применять для борьбы с вирусными инфекциями, и он находит применение в трансплантационной технологии. Основой данной терапии является то, что ген киназы вводят в клетки-мишени, где этот ген будет экспрессироваться. Введенная киназа затем может специфически активировать безвредные в других обстоятельствах пролекарства, которые в активированной форме являются токсичными и приведут либо к гибели клетки, либо к ингибированию вирусной репликации.

Дезоксинуклеозидные аналоги, такие как AZT (Zidovudine (зидовудин), Retrovir®), ddC (Zalcitabine (залцитабин), Hivid®) или AraC (Cytarabine (цитарабин)), широко используют для лечения раковых и инфицированных вирусом пациентов. В клетках-мишенях эти пролекарства должны быть анаболизированы в их трифосфатную форму, чтобы стать токсичными и привести к гибели клеток или к ингибированию вирусной репликации. Лимитирующей скорость стадией в этом активационном процессе является фосфорилирование в нуклеозидмонофосфат. Однако фосфорилирование многих нуклеозидных аналогов в клетках-мишенях часто является неэффективным, либо оно также осуществляется неспецифически в нецелевых клетках.

Эффективность и селективность этих лекарственных средств можно значительно увеличить, используя активирующие пролекарство гены, кодирующие варианты дезоксирибонуклеозидкиназ по настоящему изобретению.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложены способы сенсибилизации клеток к пролекарствам, включающие в себя стадии, на которых

(1) трансфицируют указанную клетку полинуклеотидной последовательностью по изобретению, кодирующей фермент, который стимулирует превращение указанного пролекарства в (цитотоксическое) лекарственное средство; и

(2) доставляют указанное пролекарство в указанную клетку;

где указанная клетка является более чувствительной к указанному (цитотоксическому) лекарственному средству, чем к указанному пролекарству.

В предпочтительном воплощении данного аспекта пролекарство является нуклеозидным аналогом. В более предпочтительном воплощении нуклеозидный аналог представляет собой ацикловир (9-[2-гидрокси-этокси]-метил-гуанозин), буцикловир (buciclovir), фамцикловир, ганцикловир (9-[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил-метил]-гуанозин), пенцикловир, валцикловир, трифтортимидин, AZT (3'-азидо-3'-тимидин), AIU (5'-иодо-5'-амино-2',5'-дидезоксиуридин), ara-А (аденозин-арабинозид; Vivarabine), ara-C (цитидин-арабинозид), ara-G (9-бета-D-арабинофуранозилгуанин), ara-Т, 1-бета-D-арабинофуранозилтимин, 5-этил-2'-дезоксиуридин, 5-иодо-5'-амино-2,5'-дидезоксиуридин, 1-[2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабино-фуранозил]-5-иодоурацил, идоксуридин (5-иодо-2'-дезоксиуридин), флударабин (2-фтороаденин-9-бета-D-арабинофуранозид), генцитабин, 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезокситимидин (ddT), 2',3'- дидезоксиаденозин (ddA), 2',3'-дидезоксигуанозин (ddG), 2-хлоро-2'-дезоксиаденозин (2CdA), 5-фтородезоксиуридин, BVaraU ((Е)-5-(2-бромовинил)-1-бета-D-арабинофуранозилурацил), BVDU (5-бромовинил-дезоксиуридин), FIAU (1-(2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодоурацил), 3ТС (2'-дезокси-3'-тиацитидин), dFdC гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин), dFdG (2',2'-дифтородезоксигуанозин) или d4T (2 1,3'-дидегидро-3'-дезокситимидин).

В другом аспекте изобретения предложены средства и способы для борьбы с патогенными агентами у субъекта, где субъект может, в частности, являться теплокровным животным, включая человека.

В предпочтительном воплощении изобретения предложен способ ингибирования патогенного агента у теплокровного животного, при котором указанному животному вводят полинуклеотидную последовательность по изобретению или вектор по изобретению.

В более предпочтительном воплощении полинуклеотидную последовательность или указанный вектор вводят in vivo.

В другом предпочтительном воплощении патогенный агент представляет собой вирус, бактерию или паразита.

В еще одном предпочтительном воплощении патогенный агент представляет собой опухолевую клетку или аутореактивную иммунную клетку.

Способ по изобретению для ингибирования патогенного агента у теплокровного животного дополнительно включает в себя стадию, на которой вводят нуклеозидный аналог указанному теплокровному животному.

В предпочтительном воплощении нуклеозидный аналог представляет собой ацикловир (9-[2-гидрокси-этокси]-метил-гуанозин), буцикловир (buciclovir), фамцикловир, ганцикловир (9-[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил-метил]-гуанозин), пенцикловир, валцикловир, трифтортимидин, AZT (3'-азидо-3'-тимидин), AIU (5'-иодо-5'-амино-2',5'-дидезоксиуридин), ara-А (аденозин-арабинозид; Vivarabine), ara-С (цитидин-арабинозид), ara-G (9-бета-D-арабинофуранозилгуанин), ara-Т, 1-бета-D-арабинофуранозилтимин, 5-этил-2'-дезоксиуридин, 5-иодо-5'-амино-2,5'-дидезоксиуридин, 1-[2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабино-фуранозил]-5-иодоурацил, идоксуридин (5-иодо-2'-дезоксиуридин), флударабин (2-фтороаденин-9-бета-D-арабинофуранозид), генцитабин, 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезокситимидин (ddT), 2',3'-дидезоксиаденозин (ddA), 2',3'-дидезоксигуанозин (ddG), 2-хлоро-2'-дезоксиаденозин (2CdA), 5-фтородезоксиуридин, BVaraU ((E)-5-(2-бромовинил)-1-бета-D-арабинофуранозилурацил), BVDU (5-бромовинил-дезоксиуридин), FIAU (1-(2-дезокси-2-фторо-бета-D-арабинофуранозил)-5-иодоурацил), 3ТС (2'-дезокси-3'-тиацитидин), dFdC гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин), dFdG (2',2'-дифтородезоксигуанозин) или d4T (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин).

Фармацевтические композиции

В другом аспекте изобретения предложены новые фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество варианта фермента по изобретению.

Для применения в терапии вариант фермента по изобретению можно вводить в любой подходящей форме. В предпочтительном воплощении вариант фермента по изобретению включен в фармацевтическую композицию совместно с одним или более чем одним адъювантом, эксципиентом, носителем и/или разбавителем, и такая фармацевтическая композиция приготовлена специалистом с использованием подходящих способов, известных в данной области техники.

Такие фармацевтические композиции могут содержать вариант фермента по изобретению или его антитела. Эту композицию можно вводить саму по себе или в комбинации с одним или более чем одним агентом, лекарственным средством или гормоном.

Фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить любым подходящим путем, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, внутриоболочечное, внутрижелудочковое, чрескожное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, антеральное, местное, подъязычное или ректальное введение, внутриротовое, вагинальное, внутриглазничное, интрацеребральное, внутричерепное, интраспинальное, внутрижелудочковое, внутриполостное, внутрикапсульное, внутрилегочное введение, введение через слизистые оболочки или путем ингаляции.

Дополнительные подробности по методикам приготовления препаратов и введению можно найти в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

Активный ингредиент можно вводить в одной или нескольких дозах в сутки. Предложенные в настоящее время целесообразные дозировки находятся между 0,5 нг варианта фермента/кг массы тела и приблизительно 50 мкг/кг на введение, и от приблизительно 1,0 нг/кг до приблизительно 100 мкг/кг в сутки.

Вводимую дозу, конечно, следует внимательно корректировать с учетом возраста, массы и состояния индивидуума, которого лечат, а также пути введения, лекарственной формы и режима, и желаемого результата, и точную дозировку конечно следует определять врачу.

В дополнительных воплощениях вариант фермента по изобретению можно вводить путем генетической доставки, используя клеточные линии и векторы, как описано ниже в способах лечения. Для получения таких терапевтических клеточных линий полинуклеотиды по изобретению можно встраивать в вектор экспрессии, например плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и работоспособным образом соединять с последовательностями, контролирующими экспрессию, путем лигирования таким образом, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась в условиях, совместимых с контролирующими экспрессию последовательностями. Подходящие контролирующие экспрессию последовательности включают в себя промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, инициирующие кодоны, сигналы сплайсинга интронов и терминирующие кодоны, все поддерживаемые в правильной рамке считывания полинуклеотидов по изобретению таким образом, чтобы обеспечить возможность правильной трансляции мРНК. Последовательности, контролирующие экспрессию, могут также включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности партнеров по слиянию.

Способы лечения

Настоящее изобретение, которое относится к полинуклеотидам и белкам, полипептидам, пептидным фрагментам или полученным из них производным, а также к антителам, направленным против таких белков, пептидов или производных, можно применять для лечения или облегчения расстройства или заболевания живого животного организма, включая человека, которое чувствительно к действию цитотоксического агента.

Это расстройство, заболевание или состояние, в частности, может представлять собой рак или вирусную инфекцию.

Варианты ферментов по настоящему изобретению можно использовать непосредственно посредством, например, инъецируемых, имплантируемых или проглатываемых фармацевтических композиций для лечения патологического процесса, чувствительного к варианту фермента.

Полинуклеотид по изобретению, включая его комплементарные последовательности, можно использовать для экспрессии варианта фермента по изобретению. Этого можно достичь при помощи клеточных линий, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные по изобретению, или при помощи вирусных векторов, кодирующих такие белки, пептиды или производные по изобретению, или при помощи клеток-хозяев, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные. Эти клетки, векторы и композиции можно вводить для лечения областей-мишеней, чтобы воздействовать на болезненный процесс, чувствительный к цитотоксическим агентам.

Подходящие векторы экспрессии можно получить из лентивирусов, ретровирусов, аденовирусов, вирусов герпеса и оспы или из различных продуцируемых бактериями плазмид, и их можно использовать для in vivo доставки нуклеотидных последовательностей в целый организм или целевой орган, ткань или клеточную популяцию. Другие способы включают в себя, но не ограничены ими, липосомную трансфекцию, электропорацию, трансфекцию пептидами-переносчиками, содержащими ядерные или иначе локализованные сигналы, и генную доставку при помощи медленно высвобождающих систем. В еще одном аспекте изобретения, "антисмысловые" нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеотиду по изобретению или его частям, можно использовать для ингибирования или усиления экспрессии варианта фермента.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к способу лечения или облегчения расстройства, заболевания или состояния живого животного организма, включая человека, чувствительного к действию цитотоксических агентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано со ссылкой на сопутствующие графические материалы, где:

фиг.1 показывает влияние концентраций нуклеотидных аналогов [РТР и 8-оксо-dGTP; 2,5, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0, 100,0 и 200,0 мкМ соответственно] в мутагенной ПЦР на ТК активность [относительное количество колоний на ТК селективных чашках (0-60%)]; и

фиг.2А-Г показывают кинетические кривые ингибирования фосфорилирования тимидина соединением ТТР. Начальные скорости rDm-dNK (фиг.2А) и rMuD (фиг.2Б) показаны как функция изменяющегося dThd при фиксированных ТТР концентрациях. Двойные обратные графики тех же самых данных (фиг.2В для rDmdNK; и фиг.2Г для rMuD) показывают тип ингибирования [фиг.2А и 2В:вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 0 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 9,8 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 29,3 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 48,9 мкМ ТТР; Фиг.2Б и 2Г: вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 0 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 500 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 1000 мкМ ТТР, вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 2000 мкМ ТТР]. Сплошные линии представляют собой наилучшие соответствия уравнениям, рассчитанные, как описано в Примере 2 (Анализ кинетических данных).

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение далее проиллюстрировано ссылками на следующие примеры, которые не предназначены для какого-либо ограничения заявленного объема изобретения.

Пример 1

ПЦР-индуцированные Dm-dNK варианты

Для получения мутантных киназных форм применяли подход направленной эволюции, основанный на мутагенной ПЦР. Открытую рамку считывания (ORF) Dm-dNK подвергали мутагенезу, используя разные концентрации нуклеотидных аналогов, и изучали влияние разных концентраций нуклеотидных аналогов. Подвергнутые мутагенезу ПЦР фрагменты лигировали в экспрессирующую плазмиду и затем трансформировали в дефицитный по ТК штамм Е.coli KY895.

Случайный мутагенез и конструирование библиотеки мутантов

Вектор экспрессии pGEX-2T-rDm-dNK [Munch-Peterson et al., J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679] использовали в качестве матрицы для ПЦР мутагенеза.

Открытую рамку считывания (ORF) для Dm-dNK амплифицировали, используя следующие праймеры:

Dm-TK3: 5'-CGCGGATCCATGGCGGAGGCAGCATCCT-3' (SEQ ID NO:7);

и

Dm-TK4: 5'-CGGAATTCTTATCTGGCGACCCTCTGGCGT-3' (SEQ ID NO:8).

ПЦР выполняли в 2 стадии. Первую ПЦР проводили в образцах 20 мкл с 0,15 единицами Taq полимеразы от Amersham Corp. в подаваемом буфере. Использовали матричную ДНК 10 фмоль, праймеры по 20 пмоль каждый, dNTPs по 0,2 мМ каждого. Нуклеотидные аналоги 6-(2-дезокси-вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 -D-эритропентофуранозил)-3,4-дигидро-8Н-пиримидо-[4,5С][1,2]оксазин-7-он-5'-трифосфат (dPTP) и 2'-дезокси-8-гидроксигуанозин-5'-трифосфат (8-оксо-dGTP), оба доступные от Amersham Corp., были представлены в концентрациях, как показано на фиг.1.

Условия ПЦР были следующими: Денатурация при 94°С в течение 5 минут, 25 циклов при 94°С в течение 45 секунд, 50°С в течение 45 секунд, 72°С в течение 2 минут и заключительная пролонгация при 72°С в течение 10 минут.

ПЦР продукты очищали набором для ПЦР очистки от Boehringer Mannheim и элюировали в 80 мкл 5 мМ смеси Tris (трис(гидроксиметил)аминометан)/HCl рН 7,5. 40 мкл этого элюата использовали во второй ПЦР без нуклеотидных аналогов, которую проводили в объеме 65 мкл с 0,5 единицами Taq полимеразы, 65 пмоль каждого праймера, 0,2 мМ каждого dNTP. Условия ПЦР были такими же, как в первой ПЦР, но циклизацию выполняли только за 15 циклов.

Подвергнутые мутагенезу ПЦР фрагменты очищали при помощи ПЦР набора от Boehringer Mannheim, разрезали с помощью BamHI и EcoRI и субклонировали в сайт множественного клонирования плазмидного вектора pGEX-2T. Штамм KY895 Е. coli, дефицитный по ТК [F- tdk-1 ilv] [Igarashi К, Hiraga S & Yura Т: A deoxythymidine kinase deficient mutant of Escherichia coli. II. Mapping and transduction studies with phage Ф80; Genetics 1967 57 643-654], подвергали электротрансформации со смесью для лигирования, используя стандартные методики, и наносили на LB-ампициллиновые (100 мкг/мл) чашки.

Относительное количество колоний, несущих рециркуляризованный вектор, определяли при помощи ПЦР колоний случайно выбранных клонов.

Степень мутагенности

Исследовали влияние разных концентраций нуклеотидных аналогов в мутагенной ПЦР. Степень мутагенности оценивали как потерю ТК активности. Это выполняли путем получения реплик по меньшей мере 500 колоний с LB-ампицилиновых чашек на ТК селективные чашки [Black M E, Newcomb T G, Wilson Н М Р & Loeb L A: Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 3525-3529] и подсчета числа колоний, выживших на ТК селективных чашках. Результаты корректировали на рециркуляризацию вектора.

Отбор мутантов

Сначала колонии отбирали по восстановленной ТК активности при помощи получения их реплик на ТК селективных чашках [Black M E, Newcomb Т G, Wilson Н М Р & Loeb L A: Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 3523-3529]. Только мутанты, комплементирующие ТК отрицательный штамм E. coli KY895, дают начало колониям на этой селективной среде.

Ночные культуры этих колоний разбавляли в 200 раз в 10%-ном глицерине и капли по 2 мкл этого разведения наносили пятнами на чашки с минимальной средой М9 [Ausubel F, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A & Struhl К (Eds.): Short protocols in molecular biology; Willey, USA, 3rd Edition, 1995, p.1-2], обогащенной 0,2% глюкозы, 40 мкг/мл изолейцина, 40 мкг/мл валина, 100 мкг/мл ампициллина и содержащей нуклеозидные аналоги или не содержащей их.

Для первого скрининга 200 мкл 2,5 мМ AraC, 500 мкМ AZT, 500 мкМ ddA или 25 мМ ddC равномерно наносили на поверхность чашки диаметром 8,5 см, содержащей 10 мл затвердевшей среды. Рост колоний контролировали визуально через 24 часа при 37°С. Из клонов, не растущих на чашках, содержащих нуклеозидный аналог, но нормально растущих на чашках, не содержащих нуклеозидный аналог, выделяли плазмиду и ретрансформировали в KY895. Эти клоны повторно тестировали, чтобы проверить природный фенотип плазмиды.

Пример 2

Характеристика вариантов ферментов

Секвенирование

Секвенирование при помощи дидезоксинуклеотидного метода Сэнджера (Sanger) осуществляли вручную, используя набор для циклического секвенирования с меченным радиоактивным изотопом терминатором Thermo Sequenase и Р 33 меченые ddNTP (Amersham Corp.) на очищенных плазмидах.

Определение LD100 (in vivo характеристика)

Все клоны с повышенной чувствительностью к по меньшей мере одному нуклеозидному аналогу тестировали на М9 чашках с логарифмическим разведением нуклеозидных аналогов для определения летальной дозы (LD100) нуклеозидных аналогов, при которой не отмечается рост бактерий. Чашки с концентрацией в пределах 10-1000 мкМ AraA, 3,16-1000 мкМ AraC; 0,01-100 мкМ AZT; 0,316-31,6 мкМ ddA; 0,0316-100 мкМ 2CdA или 10-3500 мкМ ddC использовали для определения LD100 (концентрации, которая вызывает 100%-ную летальность) предполагаемых мутантов.

Чашки готовили, смешивая среду с аналогами при возможно более низкой температуре перед заливанием чашек.

Результаты этих испытаний представлены в табл. 2 ниже.

вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453 вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий   его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция   и их применение, патент № 2297453

Экспрессия и очистка белка (in vitro характеристика)

В штамме Е.coli BL21 (Pharmacia Biotech, Sweden) была достигнута более высокая экспрессия, чем в клетках KY895. Экспрессию и очистку расщепленной тромбином рекомбинантного Dm-dNK дикого типа или мутантного MuD выполняли, как описано Munch-Petersen et al. [J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679]. Очищенные белки обозначены как rDm-dNK или rMuD.

Анализы ферментов

Активности нуклеозидкиназ определяли путем измерений начальной скорости на основании четырех временных образцов при помощи анализа с DE-81 фильтровальной бумагой, используя меченные тритием субстраты. Альтернативно продуцирование ADP (аденозиндифосфата) измеряли при помощи спектрометрического анализа. Оба анализа выполняли, как описано Munch-Petersen et al. U. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679].

Анализ кинетических данных

Кинетические данные оценивали, как описано в Knecht et al. [Knecht W, Bergjohann U, Gonski S, Kirschbaum B, Loffler M: Functional expression of a fragment of human dihydroorotate dehydrogenase by means of the baculovirus expression vector system, and kinetic investigation of the purified recombinant enzyme; Eur. J. Biochem. 1996 240 (1) 292-301] при помощи нелинейного регрессионного анализа, используя уравнение Михаэлиса-Ментена v=Vmax×[S]/(K m+[S]).

Концентрации, дающие 50%-ное ингибирование ферментной активности (IC50), определяли, применяя уравнение v1=v 0/(1+[I]IC50) к скоростям реакции в присутствии изменяющихся концентраций ингибитора [I]. v 1 и v0 представляют собой скорости в присутствии или отсутствии ингибитора соответственно.

Для определения типа ингибирования значения V max и Km определяли при 3 разных концентрациях ингибитора. Отклонения значений V max и Km по сравнению с константами для неингибированной ферментативной реакции рассматривали для определения того, было ли ингибирование конкурентным, внеконкурентным или неконкурентным.

Как только модель ингибирования была установлена, к полному набору данных подбирали неизмененное уравнение для неконкурентного ингибирования v=Vmax ×[S]/{Km×(1+[I]/K jc)+(1+[I]/Kju)×[S]}. K jc представляет собой константу конкурентного ингибирования, Kju представляет собой константу внеконкурентного ингибирования [Liebecg С: IUBMB Biochemical nomenclature and related documents; Portland Press, London, 1992].

Пример 3

Определение последовательности

Программу BLAST (the Basic local alignment search tool, процедура основного локального множественного выравнивания) использовали для поиска в общедоступных библиотеках "экспрессируемых ярлыков последовательностей" (EST, expressed sequence tag) в базе данных GenBank в Национальном Институте Биотехнологической Информации (National Institute for Biotechnology information) и для идентификации ESTs, которые кодируют ферменты, сходные с Dm-dNK (GenBank ACCN AF226281). Таким образом были идентифицированы ESTs ACCN AU004911 из Bombyx mori и ACCN AW159435 из Xenopus laevis.

ESTs получали от Genome Research Group, National Institute of Radiobiological Sciences, Anagawa 4-9-1, Inage, Chiba 263-8555, Japan (ACCN AU004911) и из Lita Annenberg Hazen Genome Sequencing Center, Cold Spring Harbor Laboratory, PO Box 100, Cold Spring Harbor, NY 11724, USA (AW159435). Полную открытую рамку считывания дезоксирибонуклеозидкиназ, кодируемых этими двумя ESTs, определяли путем секвенирования ДНК (смотри Пример 2).

Полные открытые рамки считывания затем представили в GenBank, и они получили обозначения ACCN AF226281 (Bombyx mori дезоксирибонуклеозидкиназа, представленная как SEQ ID NO:3) и ACCN AF250861 (Xenopus laevis дезоксирибонуклеозидкиназа, представленная как SEQ ID NO:5).

Пример 4

Гибридные ферменты

Данный пример описывает конструирование гибридных ферментов в векторе экспрессии pGEX-2T (pGEX-2T-rdmk/bmk и pGEX-2T-rbmk/dmk соответственно).

Экспрессирующаяся плазмида pGEX-2T-rBm-dNK была сконструирована по существу так, как описано Munch-Petersen et al. [Munch-Petersen et al. J. Biol. Chem. 2000 275 (9) 6673-6679] для pGEX-2T-rDm-dNK, используя праймеры Bmfor 1 и Bmrev1 и кДНК для Bombyx mori киназы, полученную, как описано в Примере 3, в качестве матрицы.

Были выполнены следующие первые ПЦР:

 bmk/dmk1 bmk/dmk2dmk/bmk1dmk/bmk2
Праймер 1pGEX-2T forpGEX-2Trev pGEX-2Tfor pGEX-2Trev
Праймер 2bmk-Nterm dmk-Cterm dmk-Ntermbmk-C term
Матрица pGEX-2T-rBm-dNKpGEX-2T-rDm-dNK pGEX-2T-rDm-dNKpGEX-2T-rBm-dNK

Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов при 94°С в течение 1 минуты, 50°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты и заключительная элонгация в течение 10 минут при 72°С.

Полученные в результате фрагменты из всех четырех ПЦР очищали при помощи набора для ПЦР очистки (PCR Purification Kit) от Boehringer Mannheim.

Затем выполняли следующие вторые ПЦР:

 bmk/dmk dmk/bmk
Праймер 1 BmforlDm-ТКЗ (SEQ ID NO:7)
Праймер 2 Dm-TK4 (SEQ ID NO:8)Bmrev 1
Матрица bmk/dmk1 и bmk/dmk2 из первых ПЦРdmk/bmk1 и dmk/bmk2

Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов при 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 5 минут и 72°С в течение 1 минуты и заключительная элонгация в течение 10 минут при 72°С.

Полученные в результате фрагменты вырезали, очищали и субклонировали в вектор экспрессии, полученный так, как описано в Примере 1.

Праймеры:

Dm-ТК3 (SEQ ID NO:7);

Dm-TK4 (SEQ ID NO:8);

pGEX-2T for: 5'-acg ttt ggt ggt ggc gac ca -3' (SEQ ID NO:13);

pGEX-2Trev: 5'- ctc cgg gag ctg cat gtg tc -3' (SEQ ID NO:14);

bmk-N term: 5'- cta aaa atg gag cgc tcc att agc ttt act gga gtt gg -3' (SEQ ID NO:15);

dmk-Cterm : 5'- cca gta aag cta atg gag cgc tcc att ttt agc gc -3' (SEQ ID NO:16);

dmk-Nterm: 5'- gaa taa tga tcg ctc cat tat ttt tag ctt ctt gt -3' (SEQ ID NO:17);

bmk-Cterm: 5'- aag cta aaa ata atg gag cga tca tta ttc agt gc -3' (SEQ ID NO:18);

Bmfor1:5'- tat cgc gga tcc atg agt gcc aac aat gtt aaa cca ttc ace -3' (SEQ ID NO:19);

и Bmrev1.:5'- ccg gaa ttc gtc gac tta taa gat cct cat gtg agg tgt gat ctt g -3' (SEQ ID NO:20).

Класс C12N9/12 переносящие фосфорсодержащие группы, например киназы (27)

специфические и высокоафинные связывающие белки, содержащие модифицированные sh3-домены киназы fyn -  патент 2478707 (10.04.2013)
способ in vitro определения прогноза развития заболевания у больного раком и способ in vitro мониторинга эффекта терапии, назначаемой больному раком -  патент 2434946 (27.11.2011)
рекомбинантная плазмидная днк, содержащая последовательность зрелой стафилокиназы staphylococcus aureus с заменами кодонов k74, e75 и r77 на триплеты, кодирующие ala, штамм escherichia coli mz09 и способ получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы с заменами кодонов k74, e75 и r77 на триплеты, кодирующие ala -  патент 2422153 (27.06.2011)
растительные тимидинкиназы и их применение -  патент 2339695 (27.11.2008)
гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки системы фосфоенолпируват-сахар-фосфотрансферазы -  патент 2326170 (10.06.2008)
способ амплификации днк, способ клонирования второй кднк и способ обратной транскрипции днк -  патент 2297454 (20.04.2007)
мутации enos, используемые для генной терапии и терапевтического скрининга -  патент 2257226 (27.07.2005)
гомологи (atr) полипептида rad3, полинуклеотиды и связанные с ними способы и материалы -  патент 2252256 (20.05.2005)
рекомбинантная термостабильная днк-полимераза, способ ее получения и применение -  патент 2238978 (27.10.2004)
модифицированная термостабильная днк-полимераза, способ её получения и применение -  патент 2235773 (10.09.2004)

Класс C12N15/54 трансферазы (2)

гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование -  патент 2514655 (27.04.2014)
новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты -  патент 2507263 (20.02.2014)
способ синтеза белка с модифицированным профилем n-гликозилирования в растениях -  патент 2499053 (20.11.2013)
гомологи глицерин-3-фосфатацилтрансферазы (гфат) и их использование -  патент 2485179 (20.06.2013)
генетически кодируемые флюоресцентные кумариновые аминокислоты -  патент 2473690 (27.01.2013)
эпигенетический регуляторный комплекс для контроля экспрессии генов -  патент 2462512 (27.09.2012)
способ получения полиненасыщенных жирных кислот в трансгенных растениях -  патент 2449007 (27.04.2012)
способы получения симвастатина -  патент 2447152 (10.04.2012)
синтетаза жирных кислот, кодирующий ее полинуклеотид и их применение -  патент 2444572 (10.03.2012)
применение и получение стабильной при хранении нейтральной металлопротеиназы -  патент 2433182 (10.11.2011)

Класс A61K38/45 трансферазы (2)

Наверх