способ получения полибактериофага

Формула изобретения

1. Способ получения полибактериофага путем сведения в один объем бактериофагов, полученных при выращивании в питательной среде бактерий и фагов, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют казеиново-кислотную среду с содержанием общего азота 1,96±0,10 мг/мл.

2. Способ получения полибактериофага по п.1, отличающийся тем, что в один объем сводят бактериофаги с титром по Аппельману не ниже 10^-5.

3. Способ получения полибактериофага по пп.1, 2, отличающийся тем, что в один объем сводят бактериофаги: стафилококковый, стрептококковый (энтерококковый), синегнойный, протейный, клебсиеллезный, сальмонеллезный, дизентерийный бактериофаг коли.

4. Способ получения полибактериофага по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что после сведения полибактериофагов в один объем проводят стерилизующую фильтрацию через мембраны с размером пор 0,2 мкм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к производству медицинских биологических препаратов на основе бактериофагов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения полибактериофага путем сведения в один объем бактериофагов, полученных после выращивания в жидкой питательной среде бактерий и фагов (патент РФ №2036232, опубл. 27.05.95).

Недостатком его является то, что для получения бактериофагов используют мясные питательные среды. Мясные среды дорогостоящи, нестандартны по составу и перегружены балластными веществами. Содержащиеся в них высокомолекулярные белки и пептиды затрудняют стадию фильтрации препарата. Освобождение от балластных веществ является одной из причин, заставляющих вводить в технологию изготовления бактериофагов стадию очистки, которая требует специального оборудования и снижает выход препарата.

Предлагаемым изобретением решается задача упрощение способа и повышение качества препарата. Для достижения этого технического результата сводят в один объем бактериофаги, полученные при выращивании в питательной среде бактерий и фагов, причем в качестве питательной среды используют казеиново-кислотную среду и в один объем сводят бактериофаги с титром по Аппельману не ниже 10^-5.

Отличительной особенностью предлагаемого решения является то, что в качестве питательной среды используют казеиново-кислотную среду и в один объем сводят бактериофаги с титром по Аппельману не ниже 10^-5.

Замена мясной среды для культивирования бактерий на казеиновую и сведения в готовый препарат стерильных нетоксичных бактериофагов с заданной специфической активностью упрощает технологию и повышает качество препарата.

Сущность способа заключается в следующем.

Культивирование бактерий проводят в питательных средах в стационарных условиях в реакторах или бутылях при одновременном внесении маточного бактериофага и посевной культуры. Каждый вид бактерий культивируется отдельно. При этом для культивирования используют казеиново-кислотную среду, в которой содержание белков в 5-10 раз меньше, чем в мясных средах (таблица 1), и полученные на ней фаголизаты (неочищенные) по азотистому составу приближаются к очищенным препаратам, полученным на мясных средах. Прозрачные фаголизаты фильтруют через каскад капроновых микропористых мембран с размером пор 3,0; 1,0; 0,8; 0,2 мкм. Для получения полибактериофага сводят в один объем бактериофаги, предварительно отконтролированные по всем нормируемым показателям: рН, токсичность, специфическая активность, стерильность, что гарантирует получение препарата с заданными свойствами. Титр по Аппельману для всех бактериофагов, входящих в полибактериофаг, должен быть не ниже 10^-5.

Пример 1. Способ получения полибактериофага шестикомпонентного (секстафаг).

Каждый вид бактериофагов культивируют отдельно, но условия получения бактериофагов являются общими для всех. Для получения каждого вида бактериофага берут не менее 30 штаммов. Агаровые культуры производственных штаммов засевают во флаконы с казеиново-кислотной средой (каждый штамм в отдельный флакон). Посевные культуры выращивают при температуре (36±1)°С в течение 6-18 ч. Концентрация микробных клеток составляет (1,5±0,5) млрд. в 1 мл. Фаголизаты получают в стационарных условиях в бутылях или реакторах на казеиново-кислотной среде при одновременном внесении микробной культуры из расчета (75±25) млн на 1 мл среды и маточного бактериофага в количестве 0,2% от объема засеваемой среды. Культивирование ведут при температуре (36±1)°С до полного лизиса культуры. Прозрачные фаголизаты фильтруют через каскад мембран капроновых микропористых с размером пор 3,0; 1,0; 0,8; 0,2 мкм. До сведения монофаги контролируют по следующим показателям: цветность, рН, стерильность, токсичность, специфическая активность.

Отконтролированные бактериофаги стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки, протея, клебсиелл с титром по Аппельману не ниже 10^-5 сводят в один объем в равных соотношениях. В таблице 2 приведена характеристика 9 серий секстафага, полученных в производственных условиях. Данный способ позволяет получать комплексный препарат с высокой активностью всех входящих в него фагов. Представленные данные указывают, что все фаги лизируют подавляющее количество тестовых культур в разведениях 10⁶ и выше.

Пример 2. Способ получения полибактериофага восьмикомпонентного (энтерофаг). Каждый вид бактериофага, входящего в энтерофаг, культивируют отдельно, но условия получения бактериофагов являются общими для всех культур, как описано в примере 1.

Отконтролированные бактериофаги дизентерии, сальмонелл, стафилококка, энтерококка, синегнойной палочки, кишечной палочки, протея и клебсиелл сливают в один объем в равных соотношениях. Приготовлено пять экспериментальных серий энтерофага (для сведения использованы бактериофаги производственных серий). Специфическая активность (по Аппельману) для каждого вида бактериофага, сведенного в энтерофаг, осталась в том же порядке, что и до сведения. Активность бактериофагов в энтерофаге не ниже 10^-5. Таким образом, предложенный способ является простым, эффективным и экономичным и позволяет стабильно получать комплексные бактериофаги с высокими титрами для всех входящих в них фагов.

Таблица 1 Азотистый состав питательных сред и получаемых на них бактериофагов.
№ п/п	Исследуемая проба	Азот, мг/мл
		общий	белковый
1	Бульон Мартена	2,83±0,43	0,237±0,042
2	Бактериофаг стафилококковый на бульоне Мартена НПО “Биомед” 1995 г. с.89 бут. 11	2,95	0,13
3	Казеиново-кислотная среда	1,96±0,10	0,040±0,025
4	Секстафаг серии 1-9, неочищенный(предлагаемый способ)	1,54±0,26	0,032±0,017
5	Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий с.74. Уфа	1,29	0,012

Таблица 2 Характеристика производственных серии секстафага (НПО “Биомед”)
№ сер	рн	Цветность по шкале	Стерильность	Токсичность	Специфическая активность бактериофагов по Аппельману, количество штаммов - титр
					стафилококка	стрептококка	синегн. палочки	кишечн. палочки	протея	клебсиелл
1	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен	3-10-5	1-10-5	4-10-5	1-10-5	4-10-5	1-10-5
					2->10-6	6->10-6	1-10-6	5-10-6	2-10-6	2-10 -6
					2-10-6		2->10-6	1->10-6	1->10-6	4->10-6
2	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен	1-10-5		1-10-5	2-10-5	3-10-5
					1-10-6	7->10-6	3-10-6	4-10-6	3-10-6	7->10 -6
					5->10-6		3->10 -6	1->10-6	1->10 -6
3	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен	2-10-5	1-10-6	3-10-6	1-10 -5	1-10-5
					4-10-6	6->10-6	4->10-6	4-10-6	5-10-6	7->10 -6
					1-10-6			2->10 -6	1->10-6
4	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен	3-10-5	2-10-6	1-10-5	4-10-5	4-10 -5
					3-10-6	5->10-6	1-10-6	2-10-6	2-10-6	7->-6
					1->10 -6		5->10-6	1->10 -6	1->10-6
5	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен	3-10-5	1-10-6	2-10-5	3-10-5	3-10 -5	4-10-6
					4-10-6	6->10 -6	2-10-6	4-10-6	2-10-6	3->10-6
							3->10-6		2->10 -6
6	7,3	4Б	стерилен	нетоксичен	6-10-6	1-10-6	3-10-6	4-10 -6	1-10-5
					1->10-6	6->10-6	4->10-6	3->10-6	1-10-6	7->10 -6
									5->10 -6
7	7,4	3Б	стерилен	нетоксичен	2-10-5		1-10-5	1-10-5	2-10-6	1–10-5
					4-10-6	7->10-6	2-10-6	2-10-6	5->10-6	6->10 -6
					1->10-6		4->10 -6	4->10-6
8	7,3	4Б	стерилен	нетоксичен	1-10-6	4-10-5	3-10-5	2-10-5	1-105	1-10-6
					6->10-6	3-10-6	2-10-6	2-10-6	5-10-6	6->10 -6
							2->10-6	3->10 -6	1->10-6
9	7,4	4Б	стерилен	нетоксичен		1-10-5	3-10-5	2-10-5	1-10-5	1-105
					7->10-6	5-10-6	1-10-6	3-10-6	4-10-6	2-10-6
						1->10 -6	3->10-6	2->10 -6	2->10-6	4->10-6