штамм "г 244/11" вируса блютанга 14 серотипа для вирусологических исследований, изготовления вакцинных и диагностических препаратов

Формула изобретения

Штамм «Г244/11» вируса блютанга 14 серотипа, семейства Reoviridae рода Orbivirus, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под инв. № 3032, для вирусологических исследований, изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и представляет собой штамм Г244/11 вируса блютанга (БТ), используемый в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против блютанга 14 серотипа и контроля их иммуногенности, а также изготовления антигенов для диагностических наборов.

Вирус блютанга (катаральной лихорадки овец) относится к сем. Reoviridae, род Orbivirus, содержит линейную двуспиральную РНК, состоящую из 10 сегментов, диаметром 70-80 нм.

В настоящее время известно о 26 серотипах вируса блютанга. Для России проблема блютанга стала наиболее актуальной в связи с широкомасштабным импортом племенного крупного рогатого скота из неблагополучных по данному заболеванию стран западной Европы и возможным ввозом вирусоносителей. Блютанг включен в перечень болезней, подлежащих регистрации в МЭБ, и в «Перечень карантинных и особо опасных болезней животных» в России. В связи с продолжительной виремией и отсутствием явных клинических признаков, КРС считают основным резервуаром вируса.

При экспедиционных эпизоотологических обследованиях южных приграничных территорий в отобранных пробах сывороток крови овец были обнаружены специфические антитела к вирусу блютанга, однако клинических признаков болезни не было обнаружено (1). В республике Бурятия, в местности Тапхар у овец была установлена болезнь с симптомами и признаками, характерными для БТ и высокими уровнями заболеваемости и летальности (2). Тогда же был выделен вирус, который размножался в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-60) в титре 6,5-7,0 lg ЦПД 50/мл, почки зеленой мартышки (VERO) в титре 5,0-6,0 lg ЦПД 50/мл, почки овцы (ПО) в титре 5,0-6,0 lg ЦПД 50/мл. При типировании в реакции нейтрализации (РН) этот штамм отнесли к 16-му серотипу (прототип). В России разработана инактивированная гидроокисьалюминиевая вакцина на основе 16-го серотипа вируса блютанга, которая была успешно применена в Бурятии при ликвидации вспышки блютанга (4). Однако эта вакцина не может защитить животных от заражения вирусом блютанга 14 серотипа, так как нейтрализующие антитела вырабатываются в организме и защищают только от заражения гомологичным серотипом вируса блютанга, поэтому вирус-вакцину изготавливают только из тех серотипов, которые циркулируют в данной местности (3).

Целью настоящего изобретения является получение нового производственного вирулентного штамма вируса блютанга, выделенного в Российской Федерации и обладающего стабильными культуральными свойствами и высокой биологической и антигенной активностью, для конструирования биопрепаратов, в частности вакцин против блютанга 14 серотипа и контроля их иммуногенности, а также изготовления антигенов для диагностических наборов.

Поставленная цель достигается получением штамма «Г244/11» вируса блютанга, выделенного от племенной нетели из хозяйства Смоленской области. Вирус выделили с использованием куриных эмбрионов и культур клеток, затем идентифицировали его прямым вариантом МФА и типировали реакцией нейтрализации с сыворотками, специфическими к 25 серотипам вируса блютанга. Этот штамм размножается в культурах клеток почки сайги (ПС) в титре 6,5-7,5 lg ЦПД 50/мл, VERO - в титре 5,5-6,5 lg ЦПД 50/мл, при внутривенном введении куриным эмбрионам (КЭ) в титре 4,5-5,5 lg ЭЛД 50/мл. При типировании в РН с постоянной дозой сыворотки по индексу нейтрализации штамм отнесен к 14 серотипу вируса блютанга.

Штамм является новым, ранее неизвестным, выделенным на территории РФ, обозначен как штамм Г244/11 и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под № 3032.

Новый штамм Г244/11 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают округлые частицы, имеющие икосаэдрический тип симметрии, размером от 68 до 70 нм.

Культуральные свойства. Штамм размножается в перевиваемых линиях клеток гомологичного и гетерологичного происхождения: ПО, ПС, почки сирийского хомячка (ВНК-21/13), ПСГК-60, VERO, и др. Репродукция вируса сопровождается цитопатическим действием, приводящим к полной деструкции монослоя на 3-5 сутки культивирования.

Инфекционная активность. Накопление вируса в зависимости от культуральной системы, множественности заражения и длительности культивирования составляет 5,5-7,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Патогенность для лабораторных животных. Штамм вызывает гибель 11-12 дневных КЭ на 2-5 сутки после внутривенного заражения.

Антигенные свойства. Вирусоспецифические антигены, общие для всех серотипов вируса блютанга, выявляются в реакции преципитации, связывания комплемента, иммунофлуоресценции и др.

Типовая принадлежность. Типирование выделенного вируса проводили в РН с постоянной дозой сыворотки (5). Использовали 96-луночные микропланшеты Costar с односуточной культурой клеток VERO, нормальную и специфическую к 25 серотипам вируса БТ сыворотку овец, а также сыворотки, специфичные к антигенно-родственным заболеваниям, вызываемым вирусами эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО) и болезни Ибараки (БИ). В таблице 1 приведены результаты типирования выделенного изолята в РН на уровне 3 пассажа на культуре клеток VERO с постоянной дозой сыворотки. При этом определяли индекс нейтрализации (ИН), который выражает максимальное количество инфекционных доз, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с контрольной (отрицательной) сывороткой. Логарифм индекса нейтрализации вычисляют по разности логарифмических показателей титра вируса в контроле (с отрицательной сывороткой) и в присутствии сыворотки.

Таблица 1
Результаты типирования выделенного изолята по индексу нейтрализации
№ п/п	Наименование сывороток	Титр вируса (lg ТЦД50 /мл)		Индекс нейтр (ИН)
1	CC* против вируса блютанга 1 серотипа	4,25		0,25
2	CC против вируса блютанга 2 серотипа	4,50		0
3	CC против вируса блютанга 3 серотипа	4,25		0,25
4	CC против вируса блютанга 4 серотипа	4,50		0
5	CC против вируса блютанга 5 серотипа	4,75		0
6	CC против вируса блютанга 6 серотипа	4,50		0
7	CC против вируса блютанга 7 серотипа	4,75		0
8	CC против вируса блютанга 8 серотипа	4,75		0
9	CC против вируса блютанга 9 серотипа	4,00		0,50
10	CC против вируса блютанга 10 серотипа	4,25		0,25
11	CC против вируса блютанга 11 серотипа	4,75		0
12	CC против вируса блютанга 12 серотипа	4,50		0
13	CC против вируса блютанга 13 серотипа	4,50		0
14	CC против вируса блютанга 14 серотипа	1,50		3,0
15	CC против вируса блютанга 15 серотипа	4,75		0
16	CC против вируса блютанга 16 серотипа	4,75		0
17	CC против вируса блютанга 17 серотипа	4,75		0
18	CC против вируса блютанга 18 серотипа		4,50	0
19	CC против вируса блютанга 19 серотипа		4,50	0
20	CC против вируса блютанга 20 серотипа		4,25	0,25
21	CC против вируса блютанга 21 серотипа		3,75	0,75
22	CC против вируса блютанга 22 серотипа		4,50	0
23	CC против вируса блютанга 23 серотипа		4,25	0,25
24	CC против вируса блютанга 24 серотипа		4,25	0,25
25	CC против вируса блютанга 25 серотипа (нет)**		-	-
26	CC против вируса блютанга 26 серотипа		4,50	0
27	CC против вируса болезни Ибараки		4,50	0
28	CC против вируса ЭГБО 1 серотипа		4,50	0
29	CC против вируса ЭГБО 2 серотипа		4,50	0
30	HC*** овцы		4,50	0
31	HC фетальная плода КРС		4,50	0
* - CC - специфическая сыворотка
** - Вирус выделен и идентифицирован только у коз, нет сыворотки
*** - HC - нормальная сыворотка

Логарифм ИН до 1 считают отрицательным, от 1 до 2 - сомнительным, равным и более 2 - положительным. Полученные результаты однозначно подтверждают как принадлежность выделенного изолята к вирусу блютанга, так и его чистоту от антигенно-родственных вирусов ЭГБО и болезни Ибараки. Наибольший индекс нейтрализации (3,0 lg) наблюдали с сывороткой, специфичной к 14-му серотипу вируса блютанга. Индексы нейтрализации выделенного штамма сыворотками, специфичными к остальным двадцати четырем серотипам вируса блютанга, и гетерологичными сыворотками не превышал 0,75 lg. Следовательно, выделенный штамм вируса блютанга идентифицирован и типирован как вирус блютанга 14 серотипа.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей. Штамм хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°C и «освежают» пассированием в культуре клеток один раз в 10 лет.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Лиофилизированный штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Накопление вируса в культуре клеток VERO и ПС.

В табл.2 приведены сведения по культивированию штамма «Г244/11» вируса блютанга в монослое культур клеток VERO, ПС и ВНК-21 (суспензионный трофовариант).

Таблица 2
Наименование культуры клеток	Накопление вируса блютанга штамма Г244/11 (lg ЦПД50/мл )
	1 пассаж	2 пассаж	3 пассаж	4 пассаж	5 пассаж
VERO	1,5	4,0	4,5-5,5	5,5-6,0	5,5-6,0
ПС (после 2 пассажей на VERO)	5,5-6,0	6,0-6,5	6,5-7,0	6,5-7,5	6,5-7,5
ВПК-21/13 (после 2 пассажей на VERO)	5,0-5,5	6,0-6,25	6,5-7,0	6,5-7,5	6,5-7,5

Как следует из табл.2, титры выделенного вируса в культуре клеток VERO на уровне пятого пассажа составили 5,5-6,0 lg ЦПД 50/мл, в культуре клеток ПС на уровне пятого пассажа 6,5-7,5 lg ЦПД 50/мл, в культуре клеток ВПК-21/13 на уровне пятого пассажа 6,5-7,5 lg ЦПД 50/мл, что обеспечивает возможность приготовления сырья для инактивированной вакцины.

Пример 2. Приготовление культурального специфического антигена вируса блютанга штамм Г244/11.

Суспензионную культуру клеток ВНК 21/13 в количестве 10 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/мл заражали вирусом блютанга штамм Г244/11 с множественностью заражения 0,01 ТЦД₅₀/кл. Поддерживающая среда - 0,25% ФГМ 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Вирус культивировали при (37,0±0,5)°C, поддерживая pH среды в пределах 7,0-7,4 в течение 40-60 часов до появления в суспензии 30% мертвых клеток. После этого клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 30 мин и готовили лизат инфицированных клеток. С этой целью к осадку добавляли дистиллированную воду до 100 мл, ресуспендировали и замораживали при минус (20,0±5,0)°C. После оттаивания обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспендировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали -пропиолактоном. С этой целью к 200 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до (37,0±0,5)°C, вносили 0,2 мл -пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили -пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 часов при (4,0±2,0)°C. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток ВПК 21/13. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях длительного связывания комплемента (1:64-1:256) и диффузионной преципитации (1:2-1:4).

Пример 3. Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья из вируса блютанга штамм Г244/11 с применением суспензионного метода культивирования.

Для получения производственного вируса суспензионные клетки ВПК 21/13 (посевная концентрация клеток 300-500 тыс/мл) в среде 0,25 ФГМ-С на солевом растворе Эрла помещают в реактор (10-50 л) и выращивают при (37,0±0,5)°C и постоянном перемешивании в течение 2-3 сут до увеличения клеточной концентрации в до (1-2)×10⁶ кл/мл. Затем суспензию клеток указанной концентрации заражают вирусом блютанга 14 серотипа и инкубируют при температуре (37,0±0,5)°C. В течение 48-72 ч отбирают пробы на определение жизнеспособности клеток в суспензии, затем производят подсчет в камере Горяева после окрашивания 0,5% водным раствором трипанового синего по общепринятой методике. При обнаружении (80±10,0)% нежизнеспособных клеток, культивирование прекращают и отбирают пробы вируса для определения инфекционной активности и отсутствия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье вируса блютанга 14 серотипа с исходной биологической активностью 5,5-7,0 lg ТЦД₅₀ /см³, инактивируют препаратом A-24, добавляют масляный адъювант - остальное до 100 мас.%, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Культуральное инактивированное сырье
14 серотипа вируса блютанга	30,00
А-24	0,02
Монтанид ISA-70	остальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Содержание антигена в вакцине составляет 30%.

Пример 4. Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья из вируса блютанга штамм Г244/11 с применением роллерного метода культивирования.

Для получения культурального вируссодержащего сырья вирусом блютанга (штамм Г244/11) заражают элективную клеточную культуру ПС или Vero, выращенную в роллерных бутылях, с множественностью 0,01-0,001 ТЦД₅₀/клетка, и инкубируют при (37,0±0,5)°C в течение 48-72 часов до проявления характерных цитопатических изменений и поражении 90-100% клеточного монослоя. Затем содержимое бутылей объединяют и определяют инфекционность вирусного материала титрованием в культуре клеток. Затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 6,5 lg ТЦД₅₀ /мл вносят препарат A-24, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°C 48 ч.

К полученному таким образом инактивированному сырью добавляют масляный адъювант - остальное до 100%, тщательно перемешивают, пропускают через коллоидную мельницу для эмульгирования и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, масс %:

Культуральное инактивированное сырье

14 серотипа вируса блютанга	50,00
A-24	0,02
Масляный адъювант	остальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Содержание антигена в вакцине составляет 50%.

Вакцину вводят по 1,5 см³ подкожно 4 овцам или по 3 см³ 2 нетелям в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. РН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128), использование культуры клеток Vero или ВНК-21/13. Вакцина вызывала образование BH-антител у испытуемых животных в титрах 1:8-1:16. Вакцину считают иммуногенной, если она индуцирует образование вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:4 против гомологичного серотипа вируса, включенного в состав вакцины.

Источники информации

1. Серологический мониторинг катаральной лихорадки овец / А.Ю. Чичикин, А.Л. Семенихин, А.А. Коломыцев, А.А. Стрижаков, М.Б. Новикова, А.В. Луницин, А.В. Книзе // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. - Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. Владимир: ОПИиНИ ВНИИЗЖ. - 1995. - С.167.

2. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец / И.Ф. Вишняков, А.А. Стрижаков, М.Б. Новикова, А.В. Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов, В.И. Балышева, К.С. Волокитина // Ветеринария. - 1995. - № 4. - С.20-25.

3. Катаральная лихорадка овец (КЛО, блютанг, синий язык) // Пятьдесят лет борьбы с особо опасными болезнями животных / Рос. акад. с.-х. наук; ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; ред. кол.: Д.В. Колбасов (гл. ред.) [и др.] - Владимир: Атлас. - 2008. - С.52-54.

4. Серологическое обследование жвачных в Бурятии через семь лет после вспышки блютанга / Стрижаков А.А., Новикова М.Б., Цыбанов С.Ж., Муруева Г.Б. // Междунар. науч.-практ. конф. "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзот. зооантропоноз. болезнями животных": Сб. ст. - Покров, 2000, - С.63-64.

5. BLUETONGUE // Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edition, 2004 CHAPTER 2.1.9. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_summry.htm/. - Загл. с экрана.