способ оценки эффективности лечения ишемической болезни сердца

Формула изобретения

Способ оценки эффективности лечения ишемической болезни сердца путем исследования липидов сыворотки крови до и после лечения, отличающийся тем, что дополнительно определяют уровень модифицированных ЛП(а) путем инкубации 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови больного с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и затем внесения пробы в лунку в геле арагозы с площадью основания 420 мм для электрофореза и последующей денситометрии и при снижении уровня модифицированных ЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение ишемической болезни сердца как эффективное.

Описание изобретения к патенту

Способ относится к области медицины и может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы оценки эффективности лечения ИБС путем оценки уровня липопротеинов (ЛП) крови (А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. 1995, Питерпресс, стр. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном теле (Н. Н. Шацкая. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. Методы исследований в профпатологии. М., 1988, стр. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП (а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лабораторные методы исследования. Под редакцией В.В. Меньшикова. М. : Медицина, 1987, с. 248-249).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить модифицированные ЛП(а), кроме ЛПНП, ЛПОНП. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови, не подготовленного для выявления модифицированных ЛП. Концентрация ЛП(а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 220 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови или преципитатов сыворотки крови для исследования.

Целью способа является повышение точности.

Указанная цель достигается техническим решением, представляющим собой проведение дополнительной обработки сыворотки крови 7% ПЭГ-6000 с последующей инкубацией 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови красителем суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате и исследованием 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом, последующей денситометрией фракций модифицированных ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

Новым в данном способе является дополнительная обработка сыворотки крови 7% ПЭГ-6000, последующая инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови красителем суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате, исследование 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом; денситометрия фракций модифицированных ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

Для получения ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови используется 7% ПЭГ-6000. Известно, что 8% ПЭГ-6000 является предельной концентрацией для получения преципитатов сыворотки крови, содержащих иммунные комплексы и не содержащих грубодисперсных белков сыворотки крови. Применение 6% ПЭГ-6000 не позволяет полностью осадить иммунные комплексы сыворотки крови. Поэтому для повышения точности способа экспериментальным путем была выбрана 7% концентрация ПЭГ-6000, позволяющая, с одной стороны, полностью осадить иммунные комплексы (ИК) сыворотки крови с гарантией отсутствия грубодисперсных (высокомолекулярных) белков сыворотки крови, а с другой стороны, позволяющая полностью осадить ИК, присутствующие в сыворотке крови. Так, в случае концентрации ИК в сыворотке крови, равной 2,5 г/л, эта же концентрация ИК выявлялась в 7% ПЭГ-6000 преципитате крови, с результатом 3%, что связано с увеличением числа манипуляций, а не с изменением концентрации ИК в преципитатах сыворотки крови.

Дополнительная инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с красителем суданом Б повышает сродство красителя к ЛП крови, а увеличение объема взятого для исследований образца крови позволяет выявить модифицированные ЛП(а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях, что позволяет повысить точность способа и получить желаемый результат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие классы модифицированных ЛП: ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а) (мЛПНП, мЛПОНП, мЛП(а)) и проводить последующую денситометрию фракций модифицированных ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

В случае снижения уровня модифицированных ЛП(а) у больных ИБС после лечения на 50% и более терапию заболевания считают эффективной. Впервые эффективность терапии ИБС оценивалась по изменению уровня модифицированных ЛП(а) после денситометрии электрофореграммы модифицированных ЛП крови.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "практическая применимость", "изобретательский уровень".

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию модифицированных ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови, относящийся к апо-B-содержащим липопротеннам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре--ЛП (sinking pre--Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре--ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС - 14%, ФЛ - 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания - противосвертывания крови. При росте концентрации как ЛП(а), так и его модифицированных форм в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре aпo(a) сиаловых кислот, ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с -ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин и его модифицированные формы гетерогенны. Все это свидетельствует об особой роли мЛП(а) в атерогенезе.

мЛП(а) может взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на B,Е - активность ГМК - Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длиннее, чем у ЛПНП и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л, и обычными методами исследования ЛП(а) определить невозможно. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^а, II^б типами гиперлипопротеидемий, при которых достаточно часто выявляются модифицированные ЛП. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а) и его модифицированных форм. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Результаты мировых популяционных исследований показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза. У здоровых лиц в 7% ПЭГ-6000 преципитатах крови модифицированные ЛП отсутствуют Модифицированные ЛПН, ЛПОПН, ЛП(а) могут появляться в их составе при атеросклерозе.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а).

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения модифицированных ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции модифицированных ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лаб. Дело, 1980, 5, стр. 287-290).

Метод основан на электрофоретической подвижности модифицированных ЛП крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных чертежей.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:

1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 мин, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;

2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55^oС; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 204 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;

3) к 1 мл сыворотки крови добавляют 40 мл 7% ПЭГ-6000, инкубируют 1 час при 20^oС, центрифугируют 40 мин при 18000 g. Осадок дважды промывают фосфатным буфером с рН 7,25. Раствор преципитата используют для электрофоретического исследования;

4) к 0,25 мл 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;

5) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА.

У пациентов I группы до лечения выявились модифицированные ЛПНП и ЛПОНП (фиг.3, 4).

У 22 пациентов II группы до лечения с наличием гиперхолестеролемии (ГХС) в пределах 7,5-14,6 ммоль/л холестерола в крови (среднее значение ХС 9,80,7 ммоль/л), кроме фракций модифицированных ЛПНП и ЛПОНП в зоне между мЛПНП и мЛПОНП выявлена фракция мЛП(а).

В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца с суданом Б 1 ч в темном термостате при температуре 40^oС и внесения его в лунку 220мм либо только увеличения объема лунки до 420мм без дополнительной инкубации пробы фракции мЛПНП и мЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а мЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно (фиг.5, 6).

У остальных пациентов этой группы фракция мЛП(а) не выявлена. Их было 7 человек из 29 больных ИБС.

После лечения ИБС через 24 дня у пациентов I группы фракции модифицированные ЛПНП и ЛПОНП были менее интенсивными (фиг.7 и 8).

После лечения ИБС через 24 дня у пациентов II группы выявились менее интенсивно выраженные фракции модифицированных ЛПНП и ЛПОНП, как и в предыдущей группе. Фракция же мЛП(а) либо полностью отсутствовала у 15 пациентов, либо ее интенсивность снижалась более чем на 50% и более чем у 7 больных ИБС этой группы (см. клинические примеры). Среднее значение:

6) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;

7) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика на хроматограмме по формуле S= hB1/2h, где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине ею высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции ЛП, если она есть по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракции модифицированных ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции модифицированных ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

В группе контроля в 7% ПЭГ-6000 преципитатах сыворотки крови в случае использования способа-прототипа (n=10) и предлагаемого способа (n=12) не выявлены модифицированные ЛП (фиг.1 и 2).

Нами обследованы 2 группы больных ИБС по 12 для способа-прототипа - I группа и 29 пациентов - II группа для проведения электрофореза ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с помощью предлагаемого способа снижения уровня мЛП(а) у вольных ИБС этой группы после лечения по сравнению с исходным составило 625%. Результаты лабораторного исследования анализировались в комплексе с клиническими данными. Заключение специалистов - лечение ИБС эффективное, о чем свидетельствуют не только данные клинического обследования пациентов, но и результаты лабораторных анализов.

Пример 1. Больной Г., 42 года, история болезни 117, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца колющего характера, иррадиирующие под лопатку. На ЭКГ выявлены рубцовые изменения в миокарде. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине усиления загрудинных болей. АД 150/100 мм рт.ст., пульс в покое 63 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:

ХС общий - 7,9 м моль/л

Триацилглицериды - 1,5 ммоль/л

ХСЛПВП - 1,1 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови по способу-прототипу представлены на фиг.9, а по предлагаемому способу на фиг.10. Выявлены фракции мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а).

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФКШ.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:

ХС общий - 6,2 ммоль/л

Триацилглицериды - 1,1 ммоль/л

ХСЛПВП - 1,4 ммоль/л.

При электрофоретическом исследовании ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови по предлагаемому способу фракции ЛП не выявлены. Фиг.11 содержит только линию старта.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь, стенокардия напряжения, ФК II. Заключение: лечение эффективное.

Пример 2. Больной К., 51 лет, история болезни 124, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска с жалобами на боли в области сердца, иррадиирующие под лопатку. На ЭКГ явления ишемии миокарда. ВЭМ прекращена при нагрузке 60 Вт по причине загрудинной боли и одышки. АД 150/110 мм рт.ст., пульс в покое 64 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:

ХС общий - 8,7 ммоль/л

Триацилглицериды - 1,3 ммоль/л

ХС ЛПВП - 0,9 ммоль/л.

Результаты электрофореза 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови выявили наличие мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а) (фиг.12). Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 74%, мЛПОНП - 20%, мЛП(а) - 6%.

Диагноз при поступлении: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:

ХС общий - 6,5 ммоль/л

Триацилглицериды - 1,0 ммоль/л

ХСЛПВП - 1,3 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования мЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.13.

Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 78%, мЛПОНП - 20%, мЛП(а) - 2%.

Диагноз при выписке: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Снижение уровня мЛП(а) на 67% по сравнению с исходным свидетельствовало об эффективности лечения ИБС.

Итак, при применении способа-прототипа оценка эффективности терапии ИБС проводилась по клинической картине заболевания и уровню липидов крови без выявления мЛП, что свидетельствовало о недостаточной точности способа (см. фиг. 7 и 8). Оценка эффективности терапии по способу-прототипу не превышала 60%.

У 7 пациентов II группы из 29 человек мЛП(а) не были выявлены, поэтому оценка эффективности терапии в этой подгруппе пациентов проводилась по клинико-лабораторным данным. У остальных 22 больных ИБС фракция мЛП(а) была выявлена и точность определения эффективности лечения ИБС составила в этой подгруппе 100%, т.к. после лечения фракция мЛП(а) либо не выявлялась, либо снижалась на 50% и более. Способ применен у 51 пациента.

Применение предлагаемого способа определения эффективности лечения ИБС в отличие от способа прототипа позволило выявить дополнительную фракцию модифицированных ЛП(а), оценить ее снижение после проведенной курсовой терапии ИБС и повысить точность способа. С помощью способа-прототипа такие результаты получить не удалось, т.к. фракцию мЛП(а) выявить было невозможно ни до, ни после лечения. Ложноположительных случаев оценки эффективности лечения ИБС не наблюдалось. При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов и может быть внедрен в клиническую практику.