способ выявления микроорганизмов - деструкторов ксенобиотиков

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ, включающий приготовление плотной питательной среды с ксенобиотиком, посев на нее исследуемой культуры микроорганизмов и культивирование с последующей оценкой их способности разлагать ксенобиотик по образованию видимой в присутствии индикатора зоны, отличающийся тем, что посев осуществляют параллельно на среду Е-8 с ксенобиотиком и контрольную среду без ксенобиотика, а в качестве индикатора используют соль 2,3,5-тетрафенилтетразолия хлорида, которую предварительно вводят в среду, оценку проводят по образованию зоны красного цвета и выявляют микроорганизмы-деструкторы ксенобиотиков при увеличении окрашенной зоны по сравнению с контролем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу выявления и отбора активных культур микроорганизмов, разлагающих ксенобиотики, представляющие экологическую опасность и может быть использовано для быстрой оценки самоочищающей способности почвы при интенсивном применении пестицидов.

Известные способы выявления и отбора включают выделение микроорганизмов непосредственно из почвы (воды) или из накопительных культур и оценку их способности трансформировать или разлагать ксенобиотики.

Однако эти методы трудоемки и длительны по времени, при их осуществлении расходуется значительное количество химических реактивов, что не позволяет использовать их для ускоренного скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков. Другие методы качественной оценки основаны на специфичности отдельных ксенобиотиков и не могут быть использованы для решения общих задач отбора микроорганизмов-деструкторов.

Наиболее близким по своей технической сущности аналогом к заявляемому является способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ, согласно которому агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли и ксенобиотик, засевают выделенными культурами микроорганизмов, выращивают их, затем обрабатывают культуральную среду водным раствором фенола и учитывают зоны просветления вокруг выросших колоний.

Задача изобретения сокращение времени и упрощение процесса выявления и отбора микроорганизмов-деструкторов пестицидов, снижение расхода химических реактивов для удешевления метода.

В известном способе готовят плотную питательную среду, содержащую ксенобиотик (как источник питания и энергии), засевают выделенные культуры микроорганизмов на эту среду, культивируют посев, а затем проводят анализ результатов путем обработки индикаторным раствором (фенолом) и учета зон просветления вокруг выросших колоний, которые и свидетельствуют о наличии микроорганизмов-деструкторов.

Предложенный способ отличается от известного тем, что посев проводят на питательную среду Е-8, куда вводят ксенобиотик и дополнительно вводят индикатор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). О наличии микроорганизмов-деструкторов будет свидетельствовать зона красного цвета, указывающая на образование восстановленного трифенилформазана (ТФФ) под действием микробной дегидрогеназы.

Использование в качестве реагента для индикации дегидрогеназной активности соли тетразолия известно.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с аналогом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что качественную оценку способности микроорганизмов разрушать ксенобиотик, осуществляют с помощью визуального наблюдения за изменением уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов по размерам зоны их роста на плотной питательной среде Е-8, окрашенной за счет цветной реакции с реактивом ТТХ, добавленного в среду и восстанавливающегося из бесцветной соли в соединении ТФФ красного цвета при окислительно-восстановительных реакциях микробного разложения ксенобиотика.

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". В аналоге качественную оценку способности микроорганизмов использовать ксенобиотик как источник питания и энергии проводят путем выращивания их и последующей обработки культуральной среды 3-5%-ным раствором фенола.

В заявляемом способе введение дополнительно в среду Е-8 на чашки Петри реактива ТТХ для обнаружения фермента дегидрогеназы, катализирующего окислительно-восстановительные реакции органических веществ, и образование красного окрашивания свидетельствует о деструкции ксенобиотика. Максимум окрашенной зоны по сравнению с контролем свидетельствует о максимуме дегидрогеназной активности микроорганизмов-деструкторов, а следовательно, и о деструкции ксенобиотика. Таким образом, выявление микроорганизмов-деструкторов в заявляемом техническом решении ведется визуально по уровню их дегидрогеназной активности. Это позволяет сделать вывод о соответствии нового отличительного признака критерию "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ выявления микроорганизмов-деструкторов пестицидов реализуется следующим образом.

Готовят питательную среду Е-8 следующего состава, г/л: KH₂PO₄ 0,7; (NH₄)₂HPO₄ 1,5; MgSO₄ 0,8; NaCl 0,5; агар 20,0; рН 5,5-5,7 (для грибных культур), рН 6,6-6,7 (для бактериальных культур). Среду стерилизуют в автоклаве при 3/4 атм. 20 мин. Для проявления дегидрогеназной активности в охлажденную после стерилизации среду стерильно добавляют 1% -ный раствор 2,3,5-ТТХ.

В опытах использовали культуры микроорганизмов, выделенные из почв участков с многолетним внесением сим-триазиновых гербицидов и фунгицида ридомила. На одну чашку можно посеять 4-12 культур микроорганизмов.

Статистически достоверные результаты получены при 5-7 повторностях каждого варианта.

П р и м е р 1. Опытный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится раствор гербицида атразина 0,6 мг/л (из расчета 1,5 кг/га д.в.) и по 20 мл среды Е-8 с ТТХ для определения дегидрогеназной активности. Контрольный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится по 20 мл среды Е-8 с ТТХ, но без атразина.

Чашки Петри экспонируют при комнатной температуре до полного застывания среды. На поверхность готовой среды опытного и контрольного вариантов производят посев уколом 6-ти суточной грибной культуры. Посевы инкубируют в термостате при 28^оС. Через 3, 6, 9, 12, 18 суток производят учет цветной реакции на дегидрогеназную активность исследуемого микроорганизма, измеряя диаметр окрашенной зоны.

Как видно из табл. 1, максимум диаметра окрашенной зоны культуры N 47 достигается через 12 суток и составляет в опытных вариантах 32 мм, в контрольных 12 мм. Величина диаметра окрашенной зоны культуры N 176 не превышает 11 мм за тот же период времени.

П р и м е р 2. Опытный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится раствор фунгицида ридомила 3,2 мг/л (из расчета 8 кг/га д.в.) и по 20 мл среды Е-8 с ТТХ для определения дегидрогеназной активности. Контрольный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится по 20 мл среды Е-8 с ТТХ, но без ридомила.

Чашки Петри экспонируют при комнатной температуре до полного застывания среды. На поверхность готовой среды опытного и контрольного вариантов размещают стерильные полые цилиндры диаметром 5 мм, в которые производят посев по 20 мкл суспензии 3-суточной бактериальной культуры (разведение 10², оптимальная плотность 0,10 нм). Посевы инкубируют в термостате при 28^оС. Через 3, 6, 9, 12 суток производят учет цветной реакции на дегидрогеназную активность исследуемого микроорганизма, измеряя диаметр окрашенной зоны.

Как видно из табл. 1, максимум диаметра окрашенной зоны культуры N 165 достигается на 9-ые сутки и составляет 18 мм, а культуры N 162 всего 8 мм. В контрольном варианте диаметр окрашенной зоны 5 мм.

Таким образом, исследуемые культуры микроорганизмов при наличии в среде ксенобиотиков атразина и ридомила проявляют различные уровни дегидрогеназной активности, что свидетельствует о различной способности этих культур разлагать ксенобиотики.

Для проверки достоверности предложенного способа провели исследования изменения суммарной дегидрогеназной активности в клетках тех же микроорганизмов после внесения в среду атразина и ридомила спектрофотометрическим методом.

Из табл. 2 видно, что дегидрогеназная активность культур микроорганизмов N 47 и N 165 выше, чем в контроле на 40% для атразина и на 11,2% для ридомила. Культуры N 176 и N 162 не активны по отношению к данным ксенобиотикам, о чем говорит понижение дегидрогеназной активности по сравнению с контролем.

Способность выделенных из почвы микроорганизмов разлагать атразин и ридомил проверялась также в жидкой минеральной среде Е-8 в колбах при перемешивании на качалке, убыль пестицидов в среде определяли количественно газохроматографическим или спектрофотометрическим методами (табл. 3).

Данные табл. 3 показывают, что разложение атразина осуществляет культура N 47, ридомила N 165, т.е. те же микроорганизмы, уровень дегидрогеназной активности которых значительно повышается при наличии в среде пестицидов (табл. 1).

Следовательно, данные табл. 2 и 3 подтверждают достоверность результатов, полученных по предлагаемому способу и представленных в табл. 1.

Таким образом, показатель уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов также можно использовать для выявления культур-деструкторов пестицидов.

Использование предлагаемого способа выявления культур-деструкторов ксенобиотиков обеспечивает следующие преимущества: позволяет выделить штаммы микроорганизмов, обладающих деструктивной активностью по отношению к пестицидам, представляющим экологическую опасность, и вследствие этого создать микробиологическую базу для охраны окружающей среды от загрязнения; значительно, от 1,5-8,0 месяцев до 9-12 суток, т.е. в 5-8 раз сокращается время выявления и отбора микроорганизмов, способных активно разрушать ксенобиотик, за счет сокращения числа аналитических операций; отпадает необходимость в использовании для анализа дорогостоящего оборудования; среди существующих методов выявления и отбора активных культур микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков, являющихся одним из источников загрязнения окружающей среды, предлагаемый способ более дешевый и простой.