способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам

Формула изобретения

Способ определения чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции, к комплексным антибактериальным препаратам, характеризующийся тем, что проводят разведение антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг/мл в питательной среде с рН 7,2- 7,6, подготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, содержащие приготовленные разведения, вносят индикатор, в качестве которого используют 10 мкл 0,5% раствора бромкрезолового пурпурного, инкубируют в течение 3-4 ч, при достижении рН 5,2-6,8 среды проводят визуальную оценку роста бактерий и оценку окраски среды в лунке, по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую делают вывод о чувствительности бактерий к комплексным антибактериальным препаратам, при этом чувствительными считают бактерии, у которых отсутствует рост и изменение цвета питательной среды с антибактериальными препаратами, а устойчивыми считаются бактерии, у которых наблюдается рост и изменение цвета среды с антибактериальными препаратами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, ветеринарной микробиологии, и может найти применение для определения чувствительности выделенных из патологического материала (паренхиматозные органы, носовые, влагалищные смывы, сперма, молоко и т.д.) микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к любым сочетаниям антибактериальных препаратов или готовым комплексным.

Широкое, нерациональное применение антибактериальных препаратов в ветеринарной практике сопровождается увеличением устойчивости микроорганизмов к этим препаратам. Более половины культур возбудителей, выделенных от павших и больных животных, оказываются одновременно устойчивыми к 14-16 препаратам, а также повышается количество культур, усиливающих свой рост в присутствии целого ряда препаратов (Страчунский Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России //. Клиническая фармакология и терапия - 2000, № 2. - С.6 - 9. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей. - М.: Колосс, 2006).

В ветеринарной практике для антибактериальной терапии часто используют комплексные препараты, эффективность применения которых так же, как и отдельных компонентов препаратов, определяется чувствительностью к ним выделенных возбудителей инфекционных болезней.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам используют способ диффузии в агар с применением дисков, содержащих определенное количество (5, 10, 15, 30, 150, 300 мкг-ЕД) антибактериального препарата (МУК по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных. Утверждено ГУВМСХ СССР 30.09.1971).

Способ с использованием дисков прост в исполнении, но дает информацию только о бактериостатической активности конкретного антибактериального препарата. Он позволяет по диаметру зоны задержки роста (ЗЗР) определить минимальную подавляющую концентрацию антибактериального препарата в отношении испытуемой культуры возбудителя и классифицировать микроорганизмы на чувствительные с промежуточной чувствительностью и устойчивые (резистентные). Однако нельзя определить этим способом чувствительность резистентных микроорганизмов к действию широко используемых в ветеринарной практике комплексных препаратов из-за отсутствия стандартных бумажных дисков, содержащих одновременно два (или более) препарата.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ серийных разведений на жидкой питательной среде (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1973 г., с.177-178). Он заключается в том, что выделенная культура микроорганизма засевается в определенный объем среды (7-10 пробирок или чашек Петри на культуру), содержащей убывающие (от 125-500 до 0,03-0,1 мкг/мл) концентрации антибактериального препарата (или нескольких препаратов). Способ серийных разведений в жидкой питательной среде позволяет установить не только минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), но и определить бактерицидную концентрацию (БАК) испытуемого препарата в отношении выделенного микроорганизма. Используя этот способ, определяется МИК и БАК вновь создаваемых комплексных препаратов в отношении различных культур микроорганизмов, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью. Способ серийных разведений в жидкой питательной среде используется при исследовании чувствительности небольшого количества культур микроорганизмов, при этом устанавливается МИК антибактерального препарата. Для определения БАК необходим дополнительный посев из пробирок с наибольшим разведением препарата, где нет видимого роста культур на минимальную подавляющую концентрацию (МПА). Отсутствие роста на МПА свидетельствует о бактерицидном действии соответствующей концентрации препарата.

В клинической ветеринарной микробиологии способ серийных разведений в жидкой питательной среде имеет ограниченное применение из-за трудоемкости и громоздкости, тем более что чувствительность выделенных возбудителей необходимо определить не к одному, а к нескольким или даже 2-3 десяткам препаратов.

Предлагаемый способ решает задачу упрощения и снижения трудоемкости определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам. Достигаемый технический результат - сокращение времени определения чувствительности к любому количеству эффективных препаратов, которые могут быть использованы для лечения больного животного.

Для этого в способе определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам, включающем разведение растворов антибактериальных препаратов стандартной питательной средой, внесение патогенных бактерий в приготовленные разведения, инкубирование их в термостате, визуальную оценку чувствительности патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, согласно изобретению внесение патогенных бактерий осуществляют в разведение антибактериального препарата, приготовленного в терапевтической концентрации, заявленной производителем, раскапанного в лунки планшета, инкубирование проводят в течение 3÷4 часов, затем в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями вводят бромкрезоловый пурпурный, проводят визуальную оценку окраски содержимого лунки и по изменению окраски с красной на желтую делают вывод о чувствительности патогенных бактерий к комплексному антибактериальному препарату, причем чувствительными к комплексным антибактериальным препаратам считают микроорганизмы, у которых отсутствует рост в питательной среде с антибиотиками и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится красным, как и в положительном контроле, а устойчивыми считают микроорганизмы, при культивировании которых в питательной среде с антибиотиками наблюдается рост и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится желтым, как и в отрицательном контроле. Бромкрезоловый пурпурный вводят в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями в количестве 10 мкл 0,5% раствора.

Бромкрезоловый пурпурный - это аммонийная соль 5 ,5 -дибром-о-крезолсульфофталеина, химический реактив, индикатор, переход окраски раствора от желтой к пурпуровой в интервале рН 5,2-6,8.

Способ осуществляют следующим образом. Для испытания берут 12-18-часовые культуры возбудителей (микроорганизмов), выделенных из патологического материала и обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Из 12-18-часовой агаровой культуры возбудителя готовят микробную взвесь на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, по стандарту мутности доводят ее концентрацию до 10 млн.м.т. в мл. В качестве питательной среды при определении чувствительности выделенного возбудителя к сочетаниям антибактериальных препаратов используют МПБ (рН 7,2-7,4) либо бульон Хоттингера (рН 7,4-7,6). В качестве индикатора, который добавляют в питательную среду с антибиотиком и культурой, используют 0,05÷1% бромкрезолового пурпурного, который при изменении среды в кислую сторону рН 5,2-6,8 меняет свой цвет с красного на желтый. В разборные (стрипованные) стерильные 96-луночные планшеты раскапывают раствор с терапевтическими концентрациями антибактериального препарата в 0,2 мл питательной среды +0,01 мл 10 миллиардной взвеси тестируемой культуры +0,01 мл 0,05÷0,1% раствора индикатора бромкрезоловый пурпурный. Количество лунок на каждую культуру испытуемого возбудителя соответствует числу сочетаний или комплексных антибактериальных препаратов, к которым определяется чувствительность, плюс одна пробирка для контроля, т.е. для каждого препарата или сочетания занимается одна лунка. В контрольную пробирку препарат не вносят.

Планшеты с заполненными лунками мясопептонным бульоном, антибиотиком, культурой и индикатором инкубируют в течение 3-4 часов в термостате при температуре 36±1°C. Проводят последующую визуальную оценку окраски содержимого лунки и по ее изменению делают вывод о чувствительности микроорганизма к антибактериальному препарату (при наличии изменения цвета контрольной лунки).

Изменение окраски с красной на желтую в контрольной лунке оценивается визуально, отсутствие изменения цвета в лунке с антибиотиками свидетельствует о чувствительности микроорганизмов к комплексным антибактериальным препаратам, изменение окраски бульона при росте испытуемой культуры в лунках с антибиотиками говорит об устойчивости микроорганизмов.

Эффективными считаются антибиотики или два антибактериальных препарата, или комплексные препараты (включают два и более антибактериальных препаратов), которые в растворе, содержащем их в терапевтической концентрации (заявленной производителем), задерживают рост испытуемых культур микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизма в питательной среде с добавленным антибактериальным средством отмечается стабильное состоянием рН, поэтому при добавлении индикатора цвет среды не изменяется.

В случае если антибактериальное средство неэффективно или недостаточно эффективно, его терапевтической концентрации недостаточно для задержки роста испытуемой культуры микроорганизма. Соответственно, при росте микроорганизма в питательной среде с добавлением антибактериального средства отмечается накопление кислых продуктов его жизнедеятельности и рН среды сменяется в кислую сторону, т.е. понижается, поэтому при добавлении индикатора цвет среды изменяется.

Проведенные микроскопические исследования мазков из лунок, где в присутствии антибактериальных препаратов не было изменения окраски бульона, показали отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве из таких лунок 0,01 мл на МПА рост возбудителя отсутствовал либо на поверхности агара обнаруживали единичные колонии (до 10, редко больше).

Пример. Исследован патологический материал с крупного свинокомплекса от 60 павших и больных поросят разного возраста 26 групп. В 15 группах диагностирована смешанная кишечная инфекция, была вызвана в разных ассоциациях 46 микроорганизмами (энтеропатогенная Е. Coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, реже другие), в разной степени устойчивыми одновременно к 14-16 антибактериальным препаратам (ампициллин, амоксициллин, гентамицин, тилозин, тетрациклин, рифампицин, полимиксин, норфлоксацин, энрофлоксацин, фуразолидон, фурагин, эритромицин, левомицетин, доксициклин, стрептомицин, неомицин и др.). С учетом наличия зоны задержки роста (ЗЗР) вокруг диска с антибактериальным препаратом (меньше, чем для чувствительного микроорганизма, либо наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), совместимости (сенергидный либо аддитивный эффект) антибактериальных препаратов были подобраны и испытаны по предлагаемому способу следующие комплексные препараты (таблица 1).

В таблице 2 приведен пример чувствительности изолированных из 13 проб патматериала культур стрептококка группы Д Enterococcus faecalis на твердых питательных средах с использованием коммерческих дисков. Подобные таблицы составляются на каждую выделенную культуру микроорганизмов. Сочетания препаратов выбираются с учетом наличия ЗЗР (зоны задержки роста) на АГВ вокруг диска с антибактериальным препаратом (промежуточная чувствительность, наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), либо берутся заранее известные компоненты, входящие в состав комплексного препарата (например, рифампицин и полимиксин, используемые в составе рифапола).

Полученную изолированную культуру микроорганизма испытывают на чувствительность к сочетанием антибактериальных препаратов, подобранных в лаборатории (таблица 3), взятых в заявленных для них стандартной бактерицидной концентрации, или к комплексным готовым коммерческим официнальным формам, в заявленной терапевтической концентрации (таблица 1).

В последнем варианте определение чувствительности выделенного возбудителя к комплексному препарату можно проводить параллельно с исследованием способа диффузии в агар (а не после него, как в первом случае).

Чувствительность возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным препаратам оказалась различной. Наиболее эффективными были в конкретной ситуации диоксиген - 95,6%, диоксинор - 94,4% культур, кинокол 93,4%, микобаксан - 91,3, наименьшей была чувствительность к пульмокиту (41,3%), который проверялся не по результатам чувствительности выделенных культур к дискам антибиотиков (дисков с китасамицином, входящим в препарат, на момент исследований в наличии не было), а по просьбе из хозяйства, т.к. в нем этот препарат применяется. В целом, во всех группах быстро были подобраны от 4 до 12 препаратов используемых в хозяйстве, которые можно использовать для эффективной антибактериальной терапии.

Контроль полученных результатов - определение чувствительности выделенных культур (МПК) к антибактериальным препаратам проводили с помощью общепринятого метода определения чувствительности к антибиотикам серийных разведений в жидкой питательной среде. Полученные результаты исследования были сопоставимы с результатами, полученными при определении антибактериальной чувствительности стандартным общепринятым методом и подтверждены эффективной антибактериальной терапией в хозяйстве.

Результаты проведенных исследований показывают, что чувствительность микроорганизма с установленной множественной лекарственной устойчивостью можно дополнительно определить к имеющимся в наличии препаратам, например, к 14 антибактериальным препаратам, включая и их комплексные сочетания, за 3-4 часа.

Предложенный способ определения чувствительности патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам позволяет в лаборатории значительно сократить время и количество расходных материалов, снизить трудоемкость определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а в хозяйстве более точно и в более ранние сроки назначать адекватную антибактериальную терапию.

Таблица 1
Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к комплексным антибактериальным препаратов.
№ п/п	Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов)	Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)	Кол-во исследованных культур	Чувствительные к препарату (кол-во/%)*	Устойчивые к комплексному препарату	МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе)	МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе)
1	Микобаксан ампициллина натриевая соль + окситетрациклина гидрохлорид + тетрациклина гидрохлорид + сульфадимезин + нистатин	10 мкг/мл	46	42/91,3	4	0,04-6,25	12,5-50
2	Колифлок колистина сульфат + энрофлоксацин	10 мкг/мл	46	39/84,8	7	3,7-6,25	12,5-50
3	Нифулин метронидазол + фуразолидон + хлортетрациклина гидрохлорид	10 мкг/мл	26	21/80,8	5	1,85-6,25	12,5-100
4	Квинокол Энрофлоксацин + гентамицин	10 мкг/мл	36	26/72,2	10	3,7-6,25	12,5-50
5	Диоксинор норфлоксацина гидрохлорид + диоксидин	10 мкг/мл	36	34/94,4	2	0,04-6,25	12,5-50
6	Амоксиклав амоксициллин + клавулановая кислота	10 мкг/мл	32	21/65,6	11	1,85- 6,25	12,5-100
7	Пульмокит китасамицин + триметоприм + сульфадиазина	10 мкг/мл	46	19/41,3	27	3,7-6,25	12,5-400

№ п/п	Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов)	Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)	Кол-во исследованных культур	Чувствительные к препарату (кол-во/%)*	Устойчивые к комплексному препарату	МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе)	МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе)
8	Фурамикс полимиксина сульфат + фуразолидон	10 мкг/мл	36	27/75	9	3,7-6,25	12,5-200
9	Тилоколин тилозин + колистина сульфат	10 мкг/мл	36	24/66,7	12	3,7-6,25	12,5-200
10	Рифапол полимиксин + рифампицин	10 мкг/мл	26	16/61,5	10	3,7-6,25	12,5-200
11	Диоксиген диоксидин + гентамицин	10 мкг/мл	46	44/95,6	2	1,85-6,25	12,5-50
12	Рифалекс левомицетин + рифампицин	10 мкг/мл	26	18/69,2	8	3,7-6,25	12,5-200
13	Гентаприм гентамицина сульфат + сульфадиметоксин + триметоприм	10 мкг/мл	46	34/73,9	12	1,85-6,25	12,5-100
14	Дизпаркол левомицетин + метронидазол + тилозин	10 мкг/мл	26	16/61,5	10	3,7-6,25	12,5-200
15	Кинокол (энрофлоксацин - колистина сульфат)	10 мкг/мл	46	43/93,4	3	3,7-6,25	12,5-100
16	Анзациклин рифампицин и тетрациклин	10 мкг/мл	46	38/82,6	8	1,85-6,25	12,5-200
Примечание - *расчет % чувствительных культур - 42 (чувствительные) : 46 (всего исследованных культур)*100=91,3%

Таблица 2
Результаты исследования чувствительности к антибактериальным препаратам на примере выделенных бактериальных культур Enterococcus faecalis. Исследование с помощью дисков с антибиотиками
Наименование	Зона задержки роста микроорганизмов, в мм
	Воспроизводство сосуны			Воспроизводство свиноматки			уч. доращивания			уч. Откорма № 1		уч. Откорма № 2
	0-1 дн	1-5 дн.	10-15 дн	№ 1	№ 2	№ 3	35 дн.	60 дн.	70 дн.	88 дн.	128 дн.	150 дн.	180 дн.
Ампициллин	ус	ус	17	ус	ус	ус	23р	22	30р	20р	23	-	-
Амоксициллин	ус	-	17	ус	12р	ус	24	15	25р	17	15	-	-
Линкомицин	ус	-	25	ус	12р	-	16пл	-	30р	27пл	ус	-	ус
Эритромицин	ус	-	ус	ус	-	ус	13	-	11пл	ус	ус	ус	-
Тетрациклин	-	8р	20р	ус	-	-	-	-	ус	20р	12р	12р	ус
Левомицетин	10	-	20р	18пл	ус	ус	10пл	10	12	13	-	-	8р
Рифампицин	ус	12р	18	11	12	13	12р	13	30пл	30р	30р	8р	10р
Гентамицин	10р	ус	ус	10	10р	ус	-	-	30пл	16	8р	11пл	15р
Полимиксин	-	18р	ус	ус	18р	10	13	-	10	10р	ус	14р	10
Фуразолидон	10р	18	-	20р	-	20	ус	10р	19	26	12р	14р	21р
Фурадонин	13р	17р	12пл	13пл	14р	21	-	15	24р	30р	15р	19р	17
Норфлоксацин	-	ус	10	14	10р	13	10	-	25р	20	12	15р	18р
Энрофлоксацин	12р	-	-	-	10пл	11	-	-	28	23р	17	10р	10р
Тилозин	-	ус	13р	ус	ус	ус	ус	-	15	15	ус	-	-
Стрептомицин	-	ус	-	-	-	11	-	-	23р	22р	ус	8р	10
Доксициклин	12	8р	15	10	10	10	13	10	12	20	13	12р	10р
«-» - отсутствие задержки роста культуры вокруг диска;
Р - в зоне задержки роста рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде отдельных колоний;
Пл - в зоне задержки роста «газона» сплошной рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде пленки;
Ус - усиление роста культур вокруг диска с антибактериальным препаратом.

Таблица 3
Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к сочетаниям антибактериальных препаратов в жидкой питательной среде.
№ п/п	Сочетание антибактериальных препаратов	Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)	Кол-во исследованных культур	Чувствительные к сочетанию	Устойчивые к сочетанию
1	Ампициллин + полимиксин	7,5+75	5	4	1
2	рифампицин + доксициклин	1,25+2,5	11	11	0
3	Гентамицин + энрофлоксацин	2,5+1,25	8	6	2
4	Полимиксин + рифампицин	75+1,25	8	7	1
5	Энрофлоксацин + Фуразолидон	1,25+75	12	10	2