штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции cfrbi

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ CR-370D продуцент эндонуклеазы рестрикции CfrBi.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5"-C/CWWGG-3" в составе двухцепочной ДНК. Рестриктаза CfrBI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является истинным изошизомером известной рестриктазы StyI и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известен штамм продуцент эндонуклеазы StyI, который был получен котрансформацией штамма E coli KM 201 hsd+ плазмидой pST27 и плазмидой S-a, последняя является конъюгативной плазмидой, определяющей устойчивость клеток к хлорамфениколу. hsd+ плазмида pST27 выделена из патогенного штамма и может содержать генетические элементы патогенности. Кроме того, у нее отсутствуют удобные генетические маркеры, что вызывает необходимость при конструировании штамма использовать дополнительную плазмиду (например, S-a) для котрансформации и создает трудности в поддержании штамма при длительном культивировании. Выход очищенного фермента StyI составляет 5000 ед. на 1 г биомассы клеток.

Цель изобретения получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что получен штамм бактерий Escherichia coli Z85 (pBGM3) продуцент эндонуклеазы рестрикции CfrBI, содержащий плазмидную ДНК pBGM3, определяющую синтез данной рестриктазы. Штамм получен трансформацией плазмидной ДНК pBGM3 в клетки E.coli Z85. Среди трансформантов, выросших на селективной агаризованной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, отбирают клоны, резистентные к ампициллину. Плазмида pBSM3 является рекомбинантной, содержит гены системы рестрикции модификации СfrBI, ответственные за синтез рестриктазы и метилазы СfrBI, и ген, кодирующий бета-лактамазу, обеспечивающий устойчивость клеток с плазмидой к ампициллину. Содержание рестриктазы СfrBI в предлагаемом штамме 5 х 10⁶ ед. на 1 г сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ СR-370D.

Штамм Escherichia coli BKM CR-370D имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3 мкм, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трeгалактозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Генетические признаки: (lac pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsd R-, F"traD36, proAB, lac1q, ZЛМ15, recA: Tn10. Проявляет устойчивость к ампициллину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pBGM3, и тетрациклину, обусловленную наличием транспозона Tn10.

Условия хранения штамма.

Штамм бактерий Escherichia coli BKM CR-370D хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% -ном глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток E. coli Z85 (pBGM3)) выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl бактотриптона на 1 л воды) при 37^оС до титра 2.10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (600 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, полученный экстракт центрифугируют при 48000 g при 2^оС.

Для определения активности рестриктазы CfrBI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис НСl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч.

Уровень активности рестриктазы СfrBI, определенный в бесклеточном экстракте штамма, около 5 млн. ед. в пересчете на 1 г биомассы.

Рестриктаза CfrBI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой (DE-52 Whatman) и фосфоцеллюлозой Р-11 (Whatman) с последующей хроматографией на гидроксилапатите и DE-сферодексе (Pharmacia). Препарат фермента окончательно концентрируют диализом против 50% глицерина.

Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение полугода. При +20^оС рестриктаза CfrBI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дн, при +37^оС 50% в течение 14 дн, при +65^оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 2. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой CfrBI, и места гидролиза ДНК.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводили сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5"-CСWWGG-3", для которой теоретически рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах (п.н.): 19329, 21211, 23901, 24322, 24396, 27868, 28793, 35016, 36505, 44248.

Для подтверждения полученных данных проводили картирование участков узнавания рестриктазой CfrВI на ДНК pBR322, используя совместные гидролизы рестрактазами CfrBI и PvuII; CfrBI и EcoRV; CfrBI и PstI.

Показано, что рестриктаза CfrBI гидролизует эту ДНК в позиции 1370 п.н.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой CfrBI была использована рекомбинатная ДНК pZK18, полученная при клонировании фрагмента плазмиды pZE8, содержащего уникальный сайт CfrBI (CCATGG), в векторную ДНК М13tg130. После отжига с универсальным синтетическим параметром и реакции полимеризации матрицу обрабатывали эндонуклеазой рестрикции CfrBI. Часть пробы вторично подвергали полимеризации и оба полученных препарата исследовали в условиях, предложенных Сангером, с использованием 8% денатурирующего полиакриламидного геля, что позволило определить место гидролиза.

Проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза CfrBI является истинным изошизомером рестриктазы StyI и узнает последовательность нуклеотидов: 5"-C/CWWGG-3".

Полученная рестриктаза СfrBI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции:

оптимальное значение

рН для действия рестриктазы 7,2-8,5

оптимальная темпера- тура действия 37^оС NaCl 20-120 мМ

Таким образом, полученный штамм E.coli BKM CR-370D как продуцент специфической эндонуклеазы СfrBI обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 5 млн. ед. на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративном количестве. Выход очищенного фермента составляет 200000 ед. на 1 г биомассы клеток, что в 40 раз превышает выход известной рестриктазы StyI, выделенной из штамма E.coli KM201.