способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОГЕННЫХ СЕРОТИПОВ МЕНИНГИТА НЕЙССЕРА ГРУППЫ В, включающий культивирование менингококков группы В, концентрированние выросших микроорганизмов, экстракцию везикулярных белковых фракций из наружной мембраны буфером, содержащим детергент, очистку полученных фракций от липополисахаридов обработкой детергентом, их стерилизацию, смешивание с полисахаридом группы С с последующим адсорбированием на геле гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что экстракцию везикулярных белковых фракций осуществляют буфером, содержащим детергент в смеси с лизоцимом, при механическом или магнитном перемешивании, чередуемом с обработкой ультразвуком, далее экстракт центрифугируют, отделяют супернатант от осадка, супернатант очищают от нуклеиновых кислот обработкой нуклеазами, подвергают ультрацентрифугированию, полученный супернатант хроматографируют и выделяют антигенный белковый комплекс с мол.м. 65 - 96 кД, а осадок очищают от липосахаридов обработкой детергентом и ультразвуком, полученные при этом везикулярные фракции хроматографируют, добавляют к ним антигенный белковый комплекс в количестве 12 - 18 мас.% при обработке ультразвуком, смешивание с полисахаридом С проводят при обработке ультразвуком в соотношении 1 : 1 - 1 : 4 по белку, адсорбирование на геле гидроокиси алюминия осуществляют в количестве 20 - 100 мкг/мкг белка, причем компоненты смеси стерилизуют ионизирующим излучением или посредством мембранной фильтрации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию везикулярных белковых фракций из наружной мембраны осуществляют буфером, содержащим дезоксихолат и лизоцим в концентрациях менее 0,1 и 0,03 - 1% (мас/об) соответственно.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию везикулярных белковых фракций из наружной мембраны осуществляют буфером, содержащим додецилсульфат натрия и лизоцим в концентрациях 0,1 - 5 и 0,03 - 1% (мас/об) соответственно.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию везикулярных белковых фракций из наружной мембраны осуществляют буфером, содержащим детергент Brij 96 илизоцим в концентрациях 0,01 - 0,5 и 0,03 - 1,0 (мас/об) соответственно.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию везикулярных белковых фракций из наружной мембраны проводят при 2 - 10^oС в течение от 15 мин до 5 ч буфером, имеющим рН 6,5 - 9,0, при магнитном или механическом перемешивании при 250 - 950 об/мин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что антигенный белковый комплекс с мол. м. 65 - 96 кД выделяют жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC) (колонка TSK 300 SWG), аффинной хроматографией, гидрофобной хроматографией, хроматографией ионного обмена или комбинацией этих хроматографий.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку от липополисахаридов проводят посредством обработки дезоксихолатом натрия или Brij 96 и ультразвуковой обработкой на молекулярном сите в колонке Сефакрил S-300 или S-400 или Сефароза CL - 24В.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стерилизацию проводят посредством ионизирующего излучения Co⁶⁰ в дозе 5 - 25 Kдy при 1 - 4^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности оно касается профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными бактериями.

Целью изобретения является способ получения вакцины, действующей против различных патогенных серотипов менингита Нейссера группы В.

Предлагаемый способ основан на использовании белкового антигенного комплекса с высоким молекулярным весом, общего для всех патогенных серотипов, который фиксируется в везикулях наружной мембраны микроорганизма, состоящей наряду с другими компонентами из большинства серотипных белков штамма, используемого для данного продуцирования, и будучи полностью стимулированной она обеспечивает получение защитного препарата, который никогда ранее не был получен.

Великулы составляют один из элементов вакцины, которые содействуют антигенным детерминантам антигенного большинства белков, они регулируют иммунологически LPS и образуют идеальную структуру для фиксации других белков, которые находятся в меньшинстве в менингококках, но являются общими для всех испытанных патогенных типов и очень хорошими иммуногенами, которые индуцируют долго продолжающуюся бактерицидную реакцию.

Широкий диапазон общего защитного свойства обеспечивается общим антигенным действием в группе В в зоне белкового антигенного комплекса с высоким молекулярным весом. Белковый антигенный комплекс с высоким молекулярным весом "стимулирует" и увеличивает реакцию к другим антигенам, и кроме того, он ответственен за длительную иммунологическую память.

Серотипные антигены являются очень важными на первом этапе защитной реакции (4-6 мес), но после этого их защитный титр обнаруживается главным образом против белкового антигенного комплекса с высоким молекулярным весом.

По этой причине вторым компонентом нашей вакцины является белковый антигенный комплекс с молекулярным весом 65-95 кД, который вводится в везикулы в пропорции 153%. Везикулы как таковые могут служить, вероятно, в качестве серотипной вакцины умеренной и кратковременной эффективности.

Другой новизной данного способа является экстракция белков наружной мембраны путем совместной обработки живых микроорганизмов моющим средством ферментом и ультразвуковой ванной, в частности использование диоксихолата натрия, додецилсульфата натрия Brij-96 в качестве моющих средств в следующих концентрациях: менее чем 1%, 0,1-5% и 0,1-0,05%, каждый из которых независимо смешан с лизозимом концентрацией 0,03-1% - и применение ультразвуковой ванны. Как вариант данного способа, осуществляется экстракция с использованием Твина 80 и сочетании с обработкой ультразвуковой ванной.

Примеры экстракционной среды мембранного белка даны в табл.1.

Загрязняющий ДНК рассматривается как процент от общего количества ДНК общего белка, который должен быть удален в последующих этапах. Процесс экстракции мембранных белков осуществляется при температуре в пределах от 2 до 10^оС, время экстракции от 5 мин до 5 ч с осуществлением перемешивания магнитной или механической (250-950 об./мин) мешалкой; среда, в которой осуществляется экстракция, может состоять из различных водных буферных растворов, величина рН поддерживается в пределах 6,5-9,0 в зависимости от используемого состава экстракционной среды; перемешивание магнитной или механической мешалкой может быть заменено ультразвуковой обработкой.

Предлагаемый способ предусматривает очистку белкового экстракта путем диссоциирующей обработки моющим средством, ультразвуковую обработку и хроматографию после удаления нуклеиновых кислот. При такой комбинации обеспечивается уменьшение содержания LPS, фосфолипидов и других липидов везикул, которое позволяет получать вакцину, способную вызвать эффективную реакцию антитела к эндоксину. В качестве моющего средства используются диоксихолат натрия, Brij - 96, Твин 20, Твин 80 в концентрации 0,1-6%. Молекулярное просеивание осуществляется в колонке Сефакрил S-300 и S-400 или Сефароза СI-4.

Следующий отличительный признак способа заключается в том, что очистка антигенного материала, являющегося результатом модуляции с получением белкового антигенного комплекса с высоким молекулярным весом, составляющим 65-95 кД, осуществляется с использованием жидкостной хроматографии высокого давления колонки ТSК 3000 SW6, или хроматографии сродства с моноклональными антителами, или гидрофобной хроматографии, или ионообменной хроматографии, или комбинации этих способов.

Основная отличительная особенность данного способа заключается в том, что в фракции, содержащие везикулы, вводится белковый антигенный комплекс в пропорции 153% с использованием ультразвуковой обработки так, что этот комплекс фиксируется на них.

При ультразвуковой обработке ускоряется интеграция антигенного комплекса с естественно образующимися везикулами, они уже имеют следы тех белков, которые являются остатком от очистки, при этом везикулы ведут себя как носитель или стимулятор относительно антигена с высоким молекулярным весом.

В фракцию, содержащую везикулу, вводится капсулярный полисахарид в пропорции (1:1) - (1:4) относительно белка и стимулятор в пропорции 20-100 мкг/мкг белка. В качестве стимулятора служит гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия или фосфат кальция.

За счет ввода указанных пропорций капсулярного полисахарида и стимулятора достигается увеличение иммуногенности вакцинового препарата, кроме того, обеспечивается необходимое количество липополисахаридного компонента, который таким образом снижает способность индуцирования нежелательных реакций до минимума.

Различные компоненты данной вакциновой смеси подвергаются радиационной стерилизации посредством ионизирующих излучений кобальтом (Со⁶⁰) дозами 5-25 Кду при 1-4^оС до приготовления конечной смеси или стерилизация может осуществляться, после того как данная смесь получена. Ионизирующее излучение применяют для стерилизации отдельных компонентов вакциновой смеси или взятых вместе компонентов в жидкой или лиофилизированной форме или для модификации имунногенности.

Такая стерилизация компонентов осуществляется путем мембранной фильтрации. Как вариант данного этапа стерилизации используются обе процедуры в комбинации друг с другом: ионизирующее излучение с использованием Со⁶⁰ в указанных дозах и при указанных температурах и мембранная фильтрация таким образом, что некоторые из компонентов стерилизуются независимым образом за счет первой процедуры, а остальные компоненты стерилизуются за счет второй процедуры.

Вакцина, полученная данным способом, имеет широкий длительно действующий защитный диапазон против различных патогенных серотипов менингита Нейссера группы В. Это первая вакцина против менингококков В, которая эффективна при испытании в условиях практической работы: проведено в общей сложности 300000 вакцинаций на добровольных пациентах.

Данная вакцина содержит иммунологический эффективное количество белкового антигенного комплекса с молекулярным весом 65-95 кД, который придает антигенность различным патогенным серотипам и вызывает образование бактерицидных антител, она содержит также везикулы в пропорции, вызывающей сильную реакцию антитела против серотипных антигенных детерминант и эндотоксина, и капсулярный полисахарид, который увеличивает растворимость и иммуногенность в целом. Вакцина улучшает реакцию организма на полисахаридный компонент, даже у детей до 2 лет, и определяет многовалентный характер. Данная вакцина оптимизируется необходимым количеством стимулятора.

Настоящее изобретение позволяет также получать из вакцины из крови доноров гипериммунный антименингококковый гаммаглобулиновый препарат, успешно используемый в профилактике и лечении менингита и менингококкемии, вызванных любым из различных патогенных серотипов менингита Нейссера группы В, против которого данный препарат обладает бактерицидным и нейтрализующим действием.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает получение специфического фактора переноса (диализируемый фактор от белых кровяных клеток донора), который способен к переносу Т-клеточного иммунитета против данного микроорганизма.

Испытание полисахарида С проводится с помощью стандартов WHO и они строго выполняются.

Испытание белковых препаратов.

Электрофорез на полиакриламидном геле (Tsai и Frasch, 1980, J.Bacteriol 141, 169175). В получаемых электрофоретических образцах, кроме белков серотипного большинства, обнаружено 12-15% белков антигенного комплекса с высоким молекулярным весом, составляющим 65-95 кД.

В данном варианте, вплоть до уровня полевых условий, установленный допускаемый предел составляет 10%. Другие варианты с КДО более 10% в настоящее время излучаются на людях.

Нуклеиновые кислоты. После удаления белка большим количеством фенола и диализом осуществляется дифференциальное спектрофотометрическое измерение (260-280 мм) с тем, чтобы подтвердить обнаруженное отсутствие белков, затем рассчитывается концентрация нуклеиновой кислоты по поглощению света при 260 нм с использованием следующего коэффициента затухания:

Е 0,1/1 см = 20,0

Сиаловая кислота. Содержание остаточного полисахарида В измеряют согласно методу L.Syennerholm (Biochem Biephys. Proc 24, 604, 1957). В нашем варианте установлен предел 1-10%.

Электронная микроскопия осуществляется обычным образом, как описано Frasch и Peppler (Infect Immun. 37, 271-280, 1982 г). Ультрамикроскопическое изобретение коррелируется с растворимостью и ммуногенностью. Другие структурные исследования осуществляются в настоящее время с использованием изучаемых вариантов. Концентрацию белка определяют методом Lowry.

Испытание конечной вакцины.

Вакцина испытывается на людях.

Состав:

Белковые антигены 100 20 мкг/мл

Полисахариды 100 20 мкг/мл.

Гидрат окиси алюминия (гель) 4 мг/мл.

Тимерозаль 1 г в 10000 мл, доза 0,5 мл (метиолат, натрийэтилртутьтиосалицилат). Определяется методом спектрофотометрии с использованием дифенилтиокарбазона согласно WHO Manual BLC(UNDP)77,1 Rev. Допускаемый предел составляет 0,005 - 0,02%.

Измерение величины рН. Используется измеритель рН со стеклянным и каломельным электродом и с применением стандартных буферных растворов (ВДН) с величинами рН 5,0; 7,0; 9,0, допускаемое значение рН может составлять от 7,00,4.

Определение содержания алюминия осуществляется согласно WHO(UNDP)77,1 Rev. 1. Критерий приемлемости не должен превышать 1,25 мг АI (алюминия) на дозу.

Определение концентраций антигена и процента адсорбции на гелевом стимуляторе. Абсорбированная вакцина центрифугируется и концентрации белка и полисахаридов во всплывшем слое и осадке определяются с использованием указанных методов.

Данный препарат допускается, если в поверхностном слое свободно находятся не более 20% от общего количества первоначально вводимых антигенов.

Контроль стерильности. Осуществляется согласно ВLC(UNDP) 77.1 Rev.1. Общие требования в отношении стерильности биологических веществ и соответствующих Кубинских стандартов.

Контроль безвредности. Каждая партия подвергается испытанию на безвредность путем ввода человеческой дозы (максимум 1 мл) в организм пяти взрослых мышей весом 17-22 г и дозы не более чем 15 мл в организм двух морских свинок весом 250-350 г. Препарат может быть принят, если ни одно из животных не проявляет ухудшения состояния здоровья в течение 7 дней после инокуляции. Если какое-либо из животных погибает или показывает ухудшение состояния здоровья, а другие не обнаруживают вредного воздействия препарата, то испытание повторяется.

Данная партия утверждается, если ни одно из животных во второй группе не погибает и не показывает ухудшения состояния здоровья по прошествии 7 дней.

Образцы конечных партий вакцины исследуются методом электронной микроскопии.

ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) осуществляется по Peppler и Frasch (Infect. Immun. 37) и принимается для определения характеристик антигенного связывания главным образом для того, чтобы иметь сравнительную систему для нашего метода (Sierra и др., 1988 г. Rev. Cub. Inf. Biot).

Данная система основана на использовании поливинилхлоридных ультрамикропластин, хорошо покрытых полистиролом и с эффективным объемом 10 мкл, которая регистрирует показания в оборудовании (SUMA), включающем вертикальный спектрофотометр-флюориметр быстрого снятия показаний с автоматической операцией и интерпретацией результатов и 96-позиционные мультипипетки, обеспечивающие возможность оценки тысяч образцов в течение очень короткого времени и ускоряющие операции математической обработки.

Данная система калибруется для того, чтобы определить реакцию антитела в различных экспериментах с вакцинами.

Бактерицидный микроанализ.

Несколько модифицированный бактерицидный микроанализ Frasch и Robbins с улучшением источника комплектации за счет получения его из сыворотки кролика SPF (получен в Сentro de Produccion de Animabes Animales de Laboratoriо) для проведения анализа сыворотки из иммунизированных мышей и свежего запаса консервированной крови при анализе сыворотки человека или обезъяны.

Статистические анализы.

В статистических анализах использовались непараметрические методы, поскольку распределение ELISA и бактерицидных данных не показывали нормальную картину, а имели некоторую асимметрию.

Использовалось главным образом испытание Wilcoxon для независимого образца. Для более качественного анализа осуществлялись расчет более широких серий (в процентах) используя другое приближение к среднему значению каждой исследуемой группы.

Испытания на животных.

Испытания на мышах. Каждый вариант вакцинового препарата подвергался иммуногенному и бактерицидному испытанию на мышах (кроме указанных испытаний на безопасность на морских свинках и мышах). Результаты показывают, что данные препараты являются иммуногенными и могут вызвать значительные уровни бактерицидных антител.

Испытания на обезъянах. Варианты вакцины, которые использовались для произвольного испытания на людях, испытывались также на обезъянах (Масассeer acthipiens) в различных дозах и схемах применения. Результаты показывают, что они безвредны, иммуногенны, и имеют высокую способность извлекать бактерицидные антитела по сравнению с плацебо.

Испытания на людях. Испытания на реактогенность проводили с группами, включающими 3, 10 и 30 человек для того, чтобы охватить различные дозы, которые были подвергнуты анализу; затем использовались группы, охватывающие большее число людей, для испытания на иммуногенность.

Первые группы тщательно наблюдались специализированным медицинским персоналом в течение первых дней, эти обследования включали: а) показатели жизненно важных функций (пульс, температура, кровяное давление); в) местные (или очаговые) реакции; с) системные (относящиеся ко всему организму) реакции; d) почечную деятельность; е) печеночную деятельность; f) гематологическое исследование (дифференциальная гемограмма, тромбоциты, коагулограмма); g) деятельность высшей нервной системы (электроэнцефелограмма); n) сердечная деятельность (электрокардиограмма).

Ни один из исследуемых пациентов не обнаружил патологических изменений в каком-либо органе или системе ни с одной из изучаемых доз: в пределах 20-100 мкг белковых антигенов и других соответствующих компонентов.

Единственно наблюдаемые реакции у большинства пациентов были:

1. Небольшая боль в месте инъекции, особенно в течение первых 48 ч;

2. Покраснение в месте инъекции и в окружающих это место частях;

3. Небольшой жар, средняя температура 37,5^оС;

4. Недомогание и головная боль лишь у нескольких пациентов, но очень недолго, в течение первых 10-12 ч. Никаких серьезных или значительных реакций быстрой или замедленной сверхчувствительности не наблюдалось.

Гемограмма слабо изменялась для нейтрофилов и значительно изменялась для лейкоцитов.

Каждому пациенту была дана отпечатанная форма для заполнения его собственных наблюдений. Часть этой формы должна быть заполняться медицинским работником. Такая практика сохранялась и при испытании на реактогенность для каждой партии изготавливаемых и реализуемых для использования препаратов.

Испытания на иммуногенность и индукция бактерицидных антител у человека.

Проводилось исследование реакции на дозу на группах людей, включающих 100, 200, 300, 500 и 1000 взрослых людей (20-100 мкг) и для определения схемы вакцинации, интервалов ввода доз и числа доз. Испытания осуществлялись сначала на молодых взрослых людях, а затем на контролируемых группах с людьми различного возраста и социального положения с постепенным увеличением числа пациентов в группах (3, 10, 30, 50):

А. Взрослые люди в возрасте от 18 до 45 лет;

В. Студенты обоих полов с различными системами образования (в закрытых и незакрытых учебных заведениях) в возрасте от 13 до 18 лет);

С. Младшие школьники в возрасте от 6 до 12 лет;

Д. Дети возрастом от 2 до 6 лет;

Е. Младенцы в возрасте от 6 месяцев до 2 лет;

С. Младенцы в возрасте от 3 до 6 месяцев;

С. Взрослые люди в возрасте более 45 лет.

Пациенты в возрасте до 12 лет получали дозу не более 50 мг.

Результаты испытания были очень хорошими. Никаких нежелательных реакций не наблюдалось за исключением указанных случаев. У детей эти реакции были менее интенсивными по мере уменьшения возра- ста. Дозы 20-100 мкг подтвердили значительную иммуногенность, но лучше результаты были получены с дозой 50 мкг. Данная доза была выбрана для всех возрастов и достигала значений, определяемых при испытании в условиях практической работы. Все эти исследования, включая исследования на животных, исследования реактогенности и т.д. были сопоставлены с испытаниями контрольной группы, в которой получали плацебо, имеющей все те же признаки, но с отсутствием активных компонентов, а именно: гидрата окиси алюминия. Измерения антител методом ELISA и путем бактерицидных испытаний осуществлялись, как уже описывалось.

Изучали реакции различных типов и подтипов антител, причем неизменно наиболее значительной была реакция на IgG (иммуноглобулин G). Для защиты при испытании в условиях практической работы (полевые испытания) использовали варианты с уже установленными характеристиками (менее чем 10% 50 мкг белка, 50 мкг полисахарида С, дополненного стимулятором, например гидроокисью алюминия 2 мг). Другие варианты исследуются на меньших группах.

Режимы вакцинации (выбранные для испытаний в условиях практической работы (полевых испытаний) следующие.

Хотя другие режимы с использованием 2-5 доз, вводимых с различными интервалами, находятся в стадии исследования, осуществляли выбор двух раздельных доз с интервалом 6-8 недель.

Изучение гипериммунного гаммаглобулина, полученного от вакцинированных добровольных пациентов.

Очистка плазмовой фракции IgG осуществляется модифицированным методом из крови доноров 250-350 мл. Экстракции осуществлялись более чем через 4 недели после вакцинации с контролем отдельных реакций (ELISA и бактерицидный микроанализ). Полученная таким образом фракция со степенью частоты более 90% подвергалась всем контролям, определяемым Всемирной организацией здравоохранения, касающимся использования внутривенных препаратов, включая испытания на синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД) и гепатитовых вирусов и подтверждение их содержания в специфических и бактериальных антителах против циркулирующих штаммов. Указанный процесс значительно усиливает специфическую антименингококковую активность данных препаратов по сравнению с исходными сыворотками. Показана высокая концентрация специфических антител против различных антигенов вакционового препарата и естественных штаммов и высокие бактерицидные титры против них. После проведения исследований и юридических операций их использование было одобрено для лечения детей, больных менингитом и/или менингококкемией; их использование подтвердило высокую эффективность; наиболее значительно жаропонижающее действие и влияние на общее состояние и поправку пациентов. Этот гипериммунный гаммаглобулин теперь производится в более крупных масштабах для распределения по лечебным учреждениям по всей стране. Действие этого препарата обусловлено не только его бактерицидным свойством, но также и возможностью удаления различных антигенов, выделенных путем лизиса из менингококков и полностью менингококков.

Эффект этого гипериммунного антименингококкового гаммаглобулина, полученного из вакцин, при лечении пациентов, больных менингитом или менингококкемией, вызванных В менингококками, является еще одним прямым доказательством эффективности данной вакцины. Другие результаты получены с вариантом вакцины, стерилизуемой путем ионизирующих излучений от Со⁶⁰.

Проводили широкое тщательное изучение физико-химических и иммунологических характеристик облученного препарата, в том числе изучали тератогенность, карциногенность, мутагенность, определяли характеристики новых соединений и повторяли все обязательные испытания на животных и добровольцах на реактогенность и иммуногенность.

Партии отобранного варианта, прошедшие полный контроль с хорошими результатами, использовались на группах, включающих 50 добровольных молодых взрослых пациентов, для оценки гипериммунного гаммаглобулина, который был получен, давая в результате одинаковые качественные показатели по всем параметрам и, для клинического использования препарата, полученного из других вакцин, прошедших испытание на эффективность в условиях практической работы.

Испытание на эффективность действия в условиях практической работы.

Ряд различных вариантов широкого диапазона наших вакцин испытывались в различных этапах на людях. Самым успешным из числа испытанных вариантов является тот, который выбран для испытания в условиях практической работы.

Основные характеристики вакцины, используемой для

испытания в условиях практической работы. 1. Белковый антиген 60-75%, большинство серотипных белков 12-18%,

антигеновый комплекс с высоким молекулярным

весом 65-95 кД.

Остальное: загрязняющие примеси с высоким и низким

молекулярным весом. 2. Полисахарид С 50 мкг на дозу 3. АI(OH)₃ гель 2 мг AI(OH)₃ на дозу, менее чем 1,25 мг Аl на дозу 4. рН 7,00,4 5. Адсорбция на геле Более чем 80% для вакциновых антигенов 6. Липополисахариды Менее чем 10% (LPS) 7. Полисахарид В Менее чем 5% 8. Нуклеиновая кислота Менее чем 10% 9. Тиомерсаль 0,005-0,02% 10. Стабильность Более 2 лет при 2-8^оС

Иммунобиологические характеристики.

1. Присутствие антигенного комплекса с высоким молекулярным весом, с зонами, общими для всех серотипов В, прошедших испытание, окончательное расположение всех этих антигенов на везикуле белкового большинства и липополисахариды придают способность извлечения антител не только против серотипа, из которого экстрагируется большинство белков, но и против совершенно других штаммов, которые имеют обычно лишь какой-либо антиген комплекса с высоким молекулярным весом. Штамм-тип Бактерицидный титр Куба 385 В4 Р1:15 1/64-1/256 Норвегия В15 Р1:16 1/32-1/256 44/76 CША В2 1/32/-1/128

Как показали исследования методами ELISA и бактерицидного анализа, через 4-6 месяцев после второй дозы наблюдается значительное падение антител до белкового большинства; антитела до антигенового комплекса с высоким молекулярным весом остаются. Это было подтверждено с использованием других вариантов вакцин других составов и путем исследования методом Wertern-Blotting.

2. Стабильность везикулярного комплекса и его иммуногенность, а также иммунологическая память увеличиваются по мере увеличения компонента с высоким молекулярным весом.

Осуществлялись два испытания на эффективность в условиях практической работы.

А. Массовая вакцинация во всей области с наибольшей степенью риска на пациентах в возрасте от 6 месяцев до 24 лет. Была выбрана область с наибольшей частотой заболеваний (30 заболеваний на 100000) и были подвергнуты вакцинации 145000 человек. В данном исследовании не было использовано никакого другого типа вакцины или плацебо; некоторые исследования проводились на различных социальных и возрастных группах; результаты этих исследований будут сопоставляться с исторической распространенностью заболеваемости и с невакцинированным населением.

Эпидемия в данной области прекратилась, из сопоставления общего числа заболеваний в каждой области можно видеть, что области с наибольшей степенью заболеваемости в прошлом, теперь уже больше ее не имеют.

В. Основным испытанием согласно требованиям для утверждения принятия новых вакцин является двойное слепое исследование плацебо-вакцины, включающее 106000 обучающихся в закрытых заведениях студентов в 7 областях с высокой частотой заболеваний. Количество лиц, получивших либо вакцину, либо плацебо, было больше, чем необходимо, чтобы по прошествии более чем одного года - времени, с которого начинается опыт, - были доступны требуемые цифровые данные нормальных потерь в таких больших и мобильных популяциях, как обучающиеся в закрытых заведениях студенты.

Результаты первой оценки эксперимента двойного слепого исследования плацебо-вакцины

Необходимо еще несколько месяцев до конечной оценки эффективности действия, однако могут быть сделаны предсказания из данных сероконверсии, определяемых методом ЕLISA или бактерицидного испытания, и из результатов терапевтического использования гипериммунного гаммаглобулина, полученного из данных вакцин.

Для данных исследований использовался типичный образец от 2100 обучающихся в закрытых заведениях студентов.

Была проанализирована корреляция состояния переносчика как возможный фактор совпадения с нулевыми или нетипичными реакциями на вакцину. Приведенные результаты и результаты применения антименингококкового гипериммунного гаммаглобулина позволяют предсказать, что мы имеем генерацию антименингококковой вакцины группы В, которая превосходит известные ранее вакцины, впервые оказывает эффективное действие и может быть доступна в больших количествах.

Исходный штамм согласно настоящему изобретению может быть в принципе любым патогенным штаммом менингококков В, циркулирующих или ответственных за большинство заболеваний в той области, где имеется потребность в вакциновой защите. Этот штамм должным образом охарактеризован, особенно в отношении требований стабильности и роста в выбранной среде культивации.

Данный микроорганизм должен быть культивирован и подвергнут центрифугированию с получением 500 г (вес на мокрую массу) биомассы менингита Нейссера группы В, которая снова суспензируется в 2500 мл деоксихолата натрия (0,09% деоксихолат натрия, 50 мМ трис-НСl рН 8, 5,2 мМ, этилендиаминтетрауксусной кислоты) в который вводится 0,05% лизозима. Процесс экстракции осуществляется в течение 2,5 ч при 4^оС, в течение которых осуществляется 10 курсов обработки по 30 с ультразвуковой ванной, чередующейся с перемешиванием магнитной мешалкой со скоростью 250 об/мин.

Продукты клеточного распада отделяются от экстракта путем центрифугирования при ускорении центрифуги 10000 g. Всплывший слой обрабатывается дезоксинуклеазой и рибонуклеазой концентрациями 5 мг на литр экстракта при 37^оС.

Экстракт центрифугируется с ускорением 100000 g в течение 2 ч, осадок суспензируется в 200 мл 5%-го буферного раствора деоксихолата в трис-ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8-9. Осуществляется хроматография с использованием молекулярного сита на основе Сеффацил S-300 с использованием для элюирования 1%-ного буферного раствора деоксихолата. Фракция, соответствующая первому пику, извлекается и исследуется на приборе Увикорд при 280 нм.

Фракция первого пика, элюированного при таком фракционировании, представляет собой основной материал, содержащий везикул, к которому добавляется антигенный комплекс с высоким молекулярным весом в пропорции 12-18% . Этот комплекс экстрагируется путем обогащения фракции молекулярным весом 65-96 мД от первого пика повторной ультразвуковой обработкой в присутствии 5%-го буферного раствора трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты - деоксихолата с последующей хроматографией сродства в колонке с анти-РI и анти-РЗ моноклональными антителами, концентрированием путем ультрафильтрации и окончательной хроматографией в препаративной колонке (ТSK 300 - SWG) с использованием буферного раствора трис-этилендиаминтетрауксусная кислота.

Белковый препарат, содержащий 60-75% серотипных белков и 12-1% антигенного комплекса с высоким молекулярным весом, осаждается и промывается в этаноле после предшествующей стерильной фильтрации на мембране типа Sartorins. При сохранении стерильных условиях вводится касулярный полисахарид в соотношении полисахарид : белок 1 : 1. Этот полисахарид группы С подвергнут стерилизации посредством мембранной фильтрации.

В смесь белок - полисахарид вводится гидрат окиси алюминия в качестве стимулятора в пропорции 2 мг Al(OH)₃ на каждые 50 мкг белка и полисахарида - количество, содержащееся в одной дозе. Являющийся стимулятором гель предварительно подвергается излучательной стерилизации путем облучения кобальтовым излучателем (Со60) дозой 15 Kgy при 4^оС.

Гарантируются конечное значение рН препарата 7,00,4, степень адсорбции на геле более чем 80% общего количества белка и полисахаридов и содержание липополисахаридов (LPS) 10% . Предохраняющий тиомерсаль используется в концентрации 0,005-0,02% . Весь продукт подвергается полной системе физико-химических и биологических контролей.

П р и м е р 1.

а) Культивирование штамма до первых минут постоянной фазы роста;

в). Контроль за процессом микробиологической чистоты культуры;

с). Центрифугирование биомассы;

d). Промывка дистиллированной водой для удаления остатков среды культуры (5 объемов);

е). Приведение в состояние суспензии биомассы в экстракционном буфере в количестве вес-объем 1:10, экстракционный буфер: Brij 96, 0,3% + лизоцим 1% в буфере РВS (солевой забуференный фосфат) рН 7,5+ 100 мМ ЕДТА и 50 мин слабого перемешивания и ультразвуковой обработки, все проводят при 4^оС, отдых в течение 40 мин и затем повторяют процесс перемешивания, чередуемый с магнитным перемешиванием 250 об./мин.

f). Клеточные остатки отделяют центрифугированием при 10000 г в охлажденной центрифуге;

g). Для удаления нуклеиновых кислот супернатант обрабатывают дезоксинуклеазой и рибонуклеазой при 5 мг/л экстракта в ванне при 37^оС в течение 2 ч;

h). После удаления нуклеиновых кислот переходят к ультрацентрифугированию при 100000 г в течение 2,5 ч;

i). Супернатант фракционируют быстрой хроматографией белков высокого разрешения в колонке ТSK 3000 SWG, где следующий пик белков рефракционирован в колонке гидрофобной хроматографии (фенил сефароза, октил сефароза), в котором наиболее гидрофильная фракция содержит антигенный комплекс белков с высоким молекулярным весом (65-96 кД);

j). Осадок ультрацентрифугирования вновь ресуспендируют в том же экстракционном буфере (без лизоцима) и фракционируют в колонке Сефакрил S-300. Первая фракция содержит протеолипосомы или везикулы;

k). Очищенные компоненты на этапе i добавляют к компонентам, очищенным на этапе j, в пропорции 15% и обрабатывают ультразвуком;

l). Комплекс, образованный на этапе k, рехроматографируют в колонке Сефакрил S-300 для удаления компонентов с низким молекулярным весом;

ll). Комплекс, образованный на этапе k и рехроматографированный на этапе l, стерилизуют путем фильтрации на мембране Сарториус или Миллипоре при положительном давлении;

m). Добавляют полисахарид группы С, также стерилизованный для фильтрации на мембране в пропорции 1:1;

n). Наконец добавляют Al(OH)₃ в виде геля пропорции 400:1 по отношению к концентрации белка и полисахарида, рН 7,0;

). В качестве консерванта используют тимерозал при 0,01%;

о). Биохимический контроль и контроль силы;

р). Наполнение и упаковка, повторный контроль. Хранение при 2-8^оС.

При выполнении способа, согласно данному примеру, гарантируется:

1. Выход 95%;

2. рН 7,0, абсорбция компонентов по крайней мере 95% и высокая стабильность в течение более 2 лет;

3. Иммуногенность более 1050 специфичных единиц Ав;

4. Бактерицидная активность длительного действия и широкий спектр с последовательным защитным характером препарата против 21 серотипа группы В.

П р и м е р 2. Так же, как в примере 1, используют

е). Экстракционный буфер:

100 мМ трис-НС рН 8, 50 мМ ЕДТА + 0,09% деоксихолата натрия + 0,05% лизоцима;

g). Удаление нуклеиновых кислот путем абсорбции в дозе с диэтиламиноэтиловой целлюлозой в РВS (соответствующая обработка) и центрифугирование при 15000 г для удаления DEAE;

h). Хроматография на Сефакриле S-1000 с тем же экстракционным буфером (без лизоцима), получение фракции 1 для получения везикул, рехроматографируя в Сефакриле S-300 и беря фракцию 2 для осуществления этапа I примера 1, очищение таким образом антигенного комплекса белков высокого молекулярного веса;

l). Вместо рехроматографии комплексов проводят их осаждение и промывку 3 раза в этаноле и ресуспендируют в солевом физиологическом растворе перед стерильной фильтрацией на мембране Сарториус или Миллипора.

Остальные этапы соответствуют этапам примера 1.

Этот пример осуществления гарантирует получение аналогичных параметров качества и эффективности вакцины, сравнительный выход составляет 85%.

П р и м е р 3. Аналогичен примеру 2, используют:

ee). Стерилизация белкового компонента в виде спиртовой пасты посредством ионизирующего излучения Со⁶⁰ при 4^оС и в дозе 15 КГу. Параметры качества остаются теми же и уменьшается цена стерилизации.