способ моделирования пролиферативных изменений в стекловидном теле

Формула изобретения

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В СТЕКЛОВИДНОМ ТЕЛЕ, включающий введение в него биологически активных веществ, отличающийся тем, что, с целью упрощения и приближения к клиническому течению, вводят 15 - 20 мкг супернатанта культур стимулированных аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови в объеме 0,1 - 0,15 мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для разработки методов лечения заболеваний глаз, связанных с пролиферативными изменениями в стекловидном теле.

Известно, что такие состояния встречаются при первичной отслойке сетчатки, диабетический пролиферативной ангиоретино паpтии и при травматических повреждениях глаз. Однако проблема профилактики и лечения до настоящего времени недостаточно разработана, что затрудняет разработку эффективных методов лечения.

Известен способ моделирования пролиферативных изменений в стекловидном теле путем введения бычьего фактора роста фибропластов в стекловидное тело. При этом используется только один из многих повреждающий факторов, участвующих в развитии пролиферации.

Недостатком этого способа является чрезмерно бурное нарастание пролиферативных изменений, не дающее возможности развития всего комплекса клинических проявлений в стекловидном теле, трудоемкость получения фактора роста, использование гетерогенных факторов от животных другого вида, которые могут вызвать неадекватную иммунологическую реакцию.

Целью изобретения является получение пролиферативного процесса, близкого к изменениям, возникающим у человека при отслойке сетчатки путем использования комплекса эндогенных иммунопептидов в концентрации, близкой к естественной.

Поставленная цель достигается тем, что вводят в стекловидное тело 0,1-0,15 мл (15-20 мкг) комплекса эндогенных иммунопептидов, 0 продуцируемых аутологичными мононуклеарными клетками периферической крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Из краевой вены уха кролика берут для получения суспензии монокуклеарных клеток. Суспензию мононуклеарных клеток выделяют с помощью седиментации в одноступенчатом градиенте (Ficall-Hypaque 1968). 15-20 мл крови кролика разводят раствором Хенкса в соотношении 1 объем крови и 2 объема раствора Хенкса. Разведенную кровь с помощью шприца осторожно наслаивают на раствор фиколлверографина (плотность раствора 1,077 г/см³) из расчета: 3 мл разведенной крови на 1 мл раствора фиколл-верографина, и центрифугируют 45 минут при 400 G в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования мононуклеарные клетки, сконцентрированные в интерфазном кольце, переносят в силикоизированные стаканы и трижды отмывают раствором Хенкса в течение 10 мин при 200 G. Подсчет выделенных клеток осуществляют в камере Горяева после разведения их в меланжере 3% -ной уксусной кислотой. Рабочая концентрация клеток составляет 5х10⁶ /мл (разведение производили средой 199 с добавлением антибиотиков: 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Затем получали супернатант, содержащий лимфокины.

Лимфоциты (5х10⁶/мл) или лейкоциты (25х10⁶/мл) культивируют во флаконах 3 ч при 37^оС в присутствии поликлонального стимулятора ФГА (Difco-P", США) в концентрации 8-10 мкг/мл. Затем клетки переносят в силиконизированные стаканы и дважды отмывают от ФГА (10 мин при 200 G) средой 199. Отмытые клетки вновь помещают во флаконы со свежей средой инкубации (баз ФГА) и культивируют 18-21 ч при 37 ^оС в среде 199 с антибиотиками. По истечении указанного времени клеточную суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 200 G. Осадок клеток отбрасывают, а содержащий лимфокины супернатант используют для дальнейшей работы.

Полученный аутосупернатант вводят в стекловидное тело в количестве 0,15 мл (25 мкг) вещества по направлению к сетчатке.

П р и м е р 1. Из краевой вены уха кролика взяли кровь. По описанной выше методике получали комплекс эндогенных иммунопептидов, продуцируемых мононуклеарами периферической крови, и ввели в стекловидное тело кролика 0,1 (20 мкг) вещества в слои стекловидного тела по направлению к сетчатке.

При офтальмоскопическом исследовании определяли через 24 ч ригидность зрачка и небольшое расширение сосудов радужки. Рефлекс с глазного дна розовый.

Через 48 ч сохранялось незначительное расширение перикорнеальных сосудов и ригидность зрачка. Наблюдался отек сетчатки с облаковидным помутнением в прилежащих слоях стекловидного тела.

Максимальное развитие описанных изменений было зарегистрировано на 5 день с последующей стабилизацией на 8 сут. С 10 до 30 сут наблюдали обратное развитие процесса.

На 30-е сут обнаружили почти полное рассасывание помутнения с образованием преретинального фиброза.

П р и м е р 2. Контроль. В стекловидное тело кролика ввели 0,1 мл среды 199. Через 24 ч 48 ч 5 сут 30 сут не зарегистрировали пролиферативных изменений в сетчатке и стекловидном теле кроликов. Определяли нежную деструкцию в месте вкола иглы, что связано с механической травмой при инъекции.

Предложенный способ применен в эксперименте на 12 глазах экспериментальных животных. При этом получены аналогичные результаты.

Получаемые экспериментальные модели животных с различной степенью пролиферативных изменений в стекловидном теле могут быть широко использованы для изыскания эффективных средств борьбы с пролиферативными изменениями при первичной отслойке сетчатки, диабетической ангиоретинопатии, последствиях глазных травм, а также в отработке хирургической техники по лечению отслойки сетчатки и других офтальмологических заболеваний. (56) L. Schweigerer et al. Biochem Biophys Res Com. , 1987, 143(3), p. 934-940.