Ферменты, например лигазы (6.), проферменты, композиции их, способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов: ..действующие на пептидные связи, например тромбопластин, лейцин аминопептидаза (3.4) – C12N 9/48

Изобретение относится к микробиологической промышленности, медицинской биотехнологии и генной инженерии. Предложен новый способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека. Вначале конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген интерферона-альфа2b человека, перед которым расположен сайт протеолиза энтеропептидазой, и трансформируют ими клетки Escherichia coli. Культивируют клетки и выделяют тельца включения синтезированного предшественника. Затем осуществляют частичную ренатурацию выделенного предшественника в присутствии препятствующего замыканию дисульфидных связей дитиоэритриола. Проводят гидролиз предшественника ферментом энтеропептидазой с образованием безметионинового интерферона-альфа2b человека. После завершения реакции гидролиза предшественника проводят полную ренатурацию интерферона-альфа2b человека в присутствии способствующей замыканию дисульфидных связей пары соединений цистин и цистеин. Очистка полученного белка осуществляется методом хроматографии на КМ-сефарозе. 5 ил.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Представлен выделенный полинуклеотид, кодирующий аминопептидазу, содержащий нуклеотидную последовательность, приведенную в описании. Также представлен полинуклеотид, гибридизующийся с указанным полинуклеотидом в условиях высокой жесткости. Описаны экспрессионный вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и подходящая клетка-хозяин. Представлен полипептид, соответствующий последовательности, приведенной в описании, и являющийся аминопептидазой. Предложен способ получения обозначенного полипептида, предусматривающий стадии трансформации подходящей клетки-хозяина указанным полинуклеотидом или вектором, культивирования клетки в условиях, подходящих для экспрессии указанного полинуклеотида, и, необязательно, очистку полипептида из указанной клетки или культуральной среды. Кроме того, был описан способ диагностики Aspergillus-инфекции в организме, предусматривающий стадии: а) выделения биологического образца из указанного организма, который, как предполагается, инфицирован Aspergillus, b) выделения нуклеиновой кислоты из указанного образца, с) определения, содержит ли указанная выделенная нуклеиновая кислота полинуклеотиды, гибридизующиеся с полинуклеотидом, выделенным из Aspergillus niger. Изобретение позволяет диагностировать Aspergillus-инфекцию в организме. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

Способ предусматривает образование в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, гомогената биомассы кишечников и голов личинок жуков вида Dermestes frischii или Dermestes maculates. Объемное соотношение биомассы и раствора Рингера составляет 1: (0,5-5,0). Затем осуществляют отделение супернатанта путем декантирования гомогената. Проводят гель-фильтрацию супернатанта на сефадексе G-150 с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата. Полученный препарат подвергают обессоливанию и концентрированию, после этого осуществляют ионообменную хроматографию с сорбцией и элюцией. Затем проводят обессоливание элюированного препарата и концентрирование целевого продукта. При этом каждое обессоливание проводят с помощью колоночной хроматографии на сефадексе G-25. Каждое концентрирование ведут путем ультрафильтрации на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон. Способ позволяет получить ферментативный препарат с высоким выходом. Выход полученного препарата составляет 70% при измерении активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA и 85% при измерении активности по Мандлу.

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу снятия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с культуральной поверхности при проведении пассажа, и может быть использовано при культивировании стволовых клеток с последующим их использованием в клеточной терапии. После удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляют первую порцию 0,075% раствора аккутазы 5 мл на 25 см² культуральной поверхности. Через пару секунд фермент аспирируют. Добавление второй порции 0,075% раствора аккутазы производят сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляют в течение 2-3 секунд, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируют. Последующее инкубирование производят в парах фермента аккутазы в течение 2 минут при 37°С. Изменения условий ферментативной обработки культуры клеток при проведении пассажа, заключающиеся в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы, способствует повышению выхода жизнеспособных клеток.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности. Пищевую карбоксиметилцеллюлозу растворяют в подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10 и добавляют к фильтрату полученного раствора коллагеназы, выделенной из панкреаса крабов, или микробной коллагеназы, выделенной из Clostridium histolyticum с коллагеназной активностью не ниже 750-1000 ед./мг в виде порошка в присутствии 1-1,5% раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 3000-5000 об/мин. Образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5 и оставляют на сутки в холодильнике. Выпавшие частицы отделяют из раствора и неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие коллагеназу, отделяют и высушивают. Это позволяет уменьшить размер частиц иммобилизованной целлюлазы, что способствует увеличению скорости ферментативного процесса.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной промышленности. Носитель - пищевую карбоксиметилцеллюлозу растворяют в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде и фильтруют. К фильтрату добавляют порошок или концентрированный раствор нейтральной или щелочной протеазы в присутствии раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании в течение 60 мин. Образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, после чего рН реакционной смеси уменьшают до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике и отделяют выпавшие частицы из раствора. К оставшимся частицам добавляют ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы отделяют и высушивают. Это позволяет уменьшить размер частиц иммобилизованной протеазы, что способствует увеличению скорости ферментативного процесса.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению композиции индивидуальных протеолитических ферментов и может быть использовано в медицине, косметологии. В состав композиции включают не менее пяти протеаз с молекулярной массой от 23 до 36 килодальтон и с N-концевыми аминокислотными последовательностями:

IVGGTEVTPGEIPYQLSLQD-; IVGGTEVTPGEIPYQLSFQD-; IVGGQEASPGSWPXQVGLFF-; IVGGSEATSGQFPYQXSFQD-; IVGGQEATPHTWVHQVALFI-; IVGGQEATPHTXVHQVALFI-; AMDXTAYXDYDEIQAXLKGL-; AFDXTNYNTFEEINSILDGV-; AAILGDEYLXSGGVVPYVFG-. Полученную композицию используют для лечения гнойно-некротических и рубцовых изменений тканей в составе фармацевтической композиции или устранения гнойно-некротических и рубцовых изменений тканей в составе косметической композиции. Предлагаемое изобретение позволяет гидролизовать белковые субстраты до индивидуальных аминокислот и при этом высокоэффективно, и не вызывает аллергических реакций при длительном применении. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов. Для выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка. При этом очистку проводят двукратной хроматографией на Q-сефарозе, а в процессе хроматографии используют элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl буфере, рН 7,6. Изобретение обеспечивает упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении высокой удельной активности конечного препарата и стабильности карбоксипептидазы В.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармакологии и медицине. Клонирована и определена последовательность ДНК, кодирующая новый вид сериновой протеазы человека (DPRP-2), родственной дипептидилолигопептидазе IV, гомология между которыми на уровне выведенной аминокислотной последовательности определена как 39%. С помощью технологии рекомбинантных ДНК получена рекомбинантная форма DPRP-2 и исследованы кинетические свойства нового фермента (субстратная специфичность, значения Km, ингибиторы активности и т.п.). Осуществление изобретения обеспечивает новые возможности при поиске и создании новых терапевтических средств для лечения широкого круга заболеваний человека. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фермент, который катализирует реакцию образования пептида из карбоксильного компонента и аминного компонента. Данное изобретение относится также к штаммам микроорганизма рода Empedobacter и рода Sphingobacterium, которые продуцируют данный фермент, и к способу получения дипептидов из карбоксильного компонента и аминного компонента с использованием фермента. Данное изобретение позволяет легко, недорого и с высоким выходом образовывать пептид без проведения сложного способа синтеза. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 18 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый фермент, способный катализировать реакцию пептидного синтеза из карбоксильного компонента и аминокомпонента. Данный фермент получают культивированием бактериальной клетки-хозяина, которая трансформирована ДНК, кодирующей пептидобразующий фермент, с последующим накоплением данного фермента. Для получения дипептида полученную культуру смешивают с карбоксильным компонентом и аминокомпонентом. Данное изобретение позволяет получать пептиды с высоким выходом без осуществления сложной методики синтеза. 24 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил, 18 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ингибиторов коллагеназы, и может быть использовано в ветеринарии, пищевой промышленности, а также для исследовательских целей. Способ предусматривает гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов краба в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0. Гомогенат центрифугируют. К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения и центрифугируют. Полученный комплекс ферментов растворяют в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей его очисткой и концентрированием. Обессоливают ферменты на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа. Супернатант, содержащий ингибитор коллагеназы, промывают дистиллированной водой. Прогревают до 60-100°С и отделяют осадок центрифугированием. Раствор ферментов лиофильно высушивают. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Предложены новые производные стафилокиназы, которые представляют собой продукты экспрессии в гетерогенной системе мутантных генов, полученных путем локального ПЦР-мутагенеза гена фермента дикого типа, и отличаются от соответствующей природной формы стафилокиназы одной или большим числом аминокислотных замен в области между 104 и 113 аминокислотными остатками, приводящих к образованию в названной области последовательности RGD или KGD. Полученные рекомбинантные производные стафилокиназы (RGD/KGD-Sak), а также усеченные с NH₂-конца на 1-16 аминокислот варианты этих производных совмещают свойства тромболитического и антикоагулирующего агента и характеризуются пониженными, по сравнению с ферментом дикого типа, способностью к полимеризации и иммуногенностью, что обеспечивает возможность их успешного применения в составе фармкомпозиций и в способах лечения или предупреждения тромбоза. 7 н. и 18 з.п.ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Изобретение относится к полиферментным препаратам из морского животного сырья и способам их получения и может найти применение в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов. Препарат получают путем гомогенизации гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных растворах, удаления твердых примесей центрифугированием гомогената, флокуляции липидов хитозаном. Причем гомогенат дополнительно очищают центрифугированием. Ультрафильтрацию раствора ферментного препарата ведут на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа и ниже, а затем на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой 50 кДа и выше. Раствор, содержащий ферментативные активности, лиофилизируют. В состав полиферментного препарата входят коллагенолитические и металлозависимые протеиназы с молекулярной массой меньше 30 кДа, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфодиэстеразы, фосфатазы, амилазы, липазы и -глюканазы. Изобретение обеспечивает расширение арсенала полиферментных препаратов, увеличение выхода ферментного препарата за счет увеличения количества типов ферментов, входящих в полиферментный комплекс (протеазы, нуклеазы, гликозидазы и липазы), повышения уровня активности гидролаз, расширение спектра возможного использования полиферментного препарата в различных отраслях промышленности. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии и направлено на получение высокоочищенного и высокоактивного ферментного препарата коллагеназы, который может быть использован в медицине, ветеринарии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей. Способ получения препарата коллагеназы включает гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных водных растворах, выделение раствора коллагеназы, очистку его последовательной 2-х стадийной ультрафильтрацией на мембранах, отсекающих примесные вещества, и лиофильную сушку препарата. Ультрафильтрацию проводят на поливолоконных мембранах с размером пор 15 кДа, концентрат, полученный на 1-ой стадии ультрафильтрации, разбавляют водой в соотношении 1:5-10, а концентрат, полученный на 2-ой стадии ультрафильтрации, дополнительно подвергают последовательно микрофильтрации на мембранах с размером пор 100 кДа и ультрафильтрации на мембранах с размером пор 15 кДа. Гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов ведут в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,7, с последующим осаждением коллагенолитических ферментов сульфатом аммония 60-70% насыщения. Изобретение обеспечивает повышение суммарной коллагенолитической активности препарата, удельной активности и чистоты препарата. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине и касается сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина полного растворимого. Способ повышения качества сохранения активности сырья до и во время сублимационной сушки заключается в том, что в сырье, полученное из гомогената серого вещества мозга, вводят ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) в количестве, необходимом для приготовления 0,0001 М конечного раствора. Добавление этого вещества к сырью обеспечивает сохранение его высокой активности, равной 12,5-16,0 секунд, позволяет увеличить срок его хранения при (-40±2)С° до 10 недель перед проведением сублимации и предотвратить снижение активности в процессе ее. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицине, косметологии, дерматологии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей. Способ получения препарата коллагеназы включает гомогенизацию исходного коллагенсодержащего сырья, отделение экстракта центрифугированием, хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте и последующие элюцию активных ферментов, диализ элюата и лиофильную сушку препарата. В качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют личинки жуков-кожеедов рода Dermestes, гомогенизацию проводят в растворе хлорида натрия с добавлением азида натрия при объемном соотношении биомассы и раствора 1:2-2,5, при этом хроматографическую очистку ведут на ДЕАЕ-сефарозе, уравновешенной MES-буфером с добавлением 0,005 М хлорида кальция, а элюцию – трисовым буфером, с добавлением хлорида натрия, хлорида кальция и этилового спирта. Изобретение обеспечивает высокий выход коллагеназы, повышает удельную активность в 5-10 раз, сокращает продолжительность процесса получения. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.