способ очистки циклолипопептидных соединений или их солей

Формула изобретения

1. Способ очистки соединения Формулы I или его солей, где указанный способ включает следующие стадии:

(1) загрузка неочищенного соединения Формулы I в макропористую адсорбционную смолу;

(2) промывка макропористой адсорбционной смолы водой, органическим растворителем или смешанным раствором органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

(3) элюирование соединения Формулы I из макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента:



где на стадии (1) раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, содержит способные к ионизации соли; и макропористая адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы средней полярности с остатками метакрилата в структуре.

2. Способ очистки по п.1, где на стадии (1) раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную макропористой адсорбционной смолой, или раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, смешивают с макропористой адсорбционной смолой, таким образом загружая неочищенное соединение Формулы I в макропористую адсорбционную смолу.

3. Способ очистки по п.2, где скорость потока составляет 0,1-10 объемов колонки в час.

4. Способ очистки по п.1, где макропористая адсорбционная смола выбрана из XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, НР-10, НР-20, HP-20ss, НР-21, НР-30, НР-40, НР-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, SP207ss, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG или их смеси.

5. Способ очистки по п.1, где адсорбционная смола содержит галоген и связана со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи.

6. Способ очистки по п.5, где адсорбционная смола содержит бром и связана со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи.

7. Способ очистки по п.6, где адсорбционная смола выбрана из SP-207, SP-207ss или их смеси.

8. Способ очистки по п.1, где способная к ионизации соль выбрана из сульфатов, нитратов, солей, содержащих галоген, фосфатов, ацетатов, карбонатов, цитратов, силикатов, персульфатов, хроматов, лактатов, оксалатов и т.д. или их смеси.

9. Способ очистки по любому из пп.1-3, где органический растворитель выбран из C_1-4 спирта, С_1-4 кетона.

10. Способ очистки по п.9, где органический растворитель выбран из метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси.

11. Способ очистки по любому из пп.1-3, где на стадии (2) объемное содержание органического растворителя составляет 0-3%, предпочтительно 0-2% в расчете на общий объем промывной жидкости.

12. Способ очистки по любому из пп.1-3, где на стадии (3) объемное содержание органического растворителя составляет 0-20%, предпочтительно 0-5% в расчете на общий объем элюента.

13. Способ очистки по любому из пп.1-3, где на стадии (1) массовое отношение неочищенного соединения Формулы I к макропористой адсорбционной смоле составляет 0,1-15 (г/л).

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к области органической химии, в частности к способу очистки циклолипопептидного соединения Формулы I или его солей.

Предшествующий уровень техники

Грибковые инфекции стали основной причиной высокой заболеваемости и смертности у пациентов с иммунодефицитом. В течение последних 20 лет заболеваемость микозом значительно возросла. Население, составляющее группу повышенного риска по отношению к грибковой инфекции, включает пациентов, находящихся в критическом состоянии, пациентов, нуждающихся в хирургической помощи, и пациентов с ВИЧ-инфекцией, лейкозом, а также другими опухолями. Кроме того, пациенты с пересаженными органами также являются населением, составляющим группу повышенного риска по отношению к грибковой инфекции.

Эхинокандины представляют собой новые противогрибковые лекарственные средства, которые являются эффективными при лечении кандидоза или аспергиллеза и примерами которых являются Каспофунгин и Микафунгин. Эхинокандины подавляют грибы, подавляя образование 1,3- глюкозидной связи, таким образом, снижая токсичность по отношению к человеку и уменьшая побочные действия, вместе с тем поддерживая высокую эффективность. Поэтому, по сравнению с традиционными противогрибковыми лекарственными средствами, Эхинокандины являются более надежными, когда их применяют.

FK463 (Микафунгин) представляет собой соединение Формулы III, которое получают путем удаления боковой цепи соединения FR901379 Формулы II (Мо), с образованием, таким образом, соединения FR179642 (M₁ ) Формулы I и добавления боковой цепи к соединению Формулы I путем синтеза. Поэтому, соединение Формулы I высокой чистоты является очень важным для получения Микафунгина высокой чистоты.

	I (M1)
	II (M0)
	III (Микафунгин)

Описаны следующие штаммы для превращения соединения Формулы II в соединение Формулы I путем деацилирования ацильной боковой цепи первого соединения: Стрептомицеты, такие как Streptomyces anulatus No. 4811, Streptomyces anulatus No. 8703, Streptomyces sp, No. 6907 и IF013244, IF06798, IF031963, IF09951, NRRL12052 и т.д. В США 5376634 раскрыт способ очистки соединения Формулы I, где способ включает следующие стадии: соединение Формулы II превращается в соединение Формулы I путем ферментативной реакции, преобразованную жидкость фильтруют, соединение Формулы I последовательно очищают посредством колонки, наполненной активированным углем, и колонки, наполненной силикагелем, и при концентрировании при пониженном давлении получают соединение Формулы I в виде белого твердого вещества. Для этого способа количество используемого органического растворителя является большим, и используемые активированный уголь и силикагель не могут быть повторно использованы, поэтому при таком способе будет происходить загрязнение окружающей среды, он будет вредным для физического здоровья операторов и не подойдет для крупномасштабного производства.

Поэтому, в данной области является срочным нахождение способа очистки без применения большого количества растворителя или силикагеля, и такой способ может не только преодолевать недостатки предыдущего уровня техники, а также улучшать чистоту соединения Формулы I.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа очистки соединения Формулы I.

В настоящем изобретении предложен способ очистки соединения Формулы I или его солей, причем указанный способ включает следующие стадии:

(1) загрузка неочищенного соединения Формулы I в макропористую адсорбционную смолу;

(2) промывка макропористой адсорбционной смолы водой, органическим растворителем или смешанным раствором органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

(3) элюирование соединения Формулы 1 из макропористой адсорбционной смолы с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента.

В упомянутом ранее способе очистки, предложенном изобретением, макропористая адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы средней полярности с остатками метакрилата в своей структуре.

В другом предпочтительном воплощении адсорбционная смола выбрана из XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-16, XAD-16HP, HP-10, HP-20, HP-20ss, HP-21, HP-30, HP-40, HP-50, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP-207, XAD-6, XAD-7, XAD-7HP, XAD-8, HP-2MG или их смеси.

В другом предпочтительном воплощении адсорбционная смола содержит галоген и связана со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи.

В другом предпочтительном воплощении адсорбционная смола содержит бром и связана со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи.

В другом предпочтительном воплощении адсорбционная смола выбрана из SP-207, SP-207ss или их смеси.

В другом предпочтительном воплощении на стадии (1) раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, пропускают через хроматографическую колонку, наполненную макропористой адсорбционной смолой, или раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, смешивают с макропористой адсорбционной смолой, таким образом загружая неочищенное соединение Формулы I в макропористую адсорбционную смолу; и скорость потока составляет 0,1-10 объемов колонки в час.

В другом предпочтительном воплощении раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, содержит способные к ионизации соли. Макропористая адсорбционная смола выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы средней полярности с остатками метакрилата в структуре. Способная к ионизации соль выбрана из сульфатов, нитратов, солей, содержащих галоген, фосфатов, ацетатов, карбонатов, цитратов, силикатов, персульфатов, хроматов, лактатов, оксалатов и т.д. или их смеси.

В упомянутом ранее способе очистки, предложенном изобретением, на стадии (2) объемное содержание органического растворителя составляет 0-3%, предпочтительно 0-2% в расчете на общий объем промывной жидкости.

В упомянутом ранее способе очистки, предложенном изобретением, на стадии (3) объемное содержание органического растворителя составляет 0-20%, предпочтительно 0-5% в расчете на общий объем элюента.

В упомянутом ранее способе очистки, предложенном изобретением, на стадии (1) массовое отношение неочищенного соединения Формулы I к макропористой адсорбционной смоле составляет 0,1-15 (г/л); предпочтительно, 5-10 (г/л).

В упомянутом выше способе очистки, предложенном изобретением, органический растворитель выбран из C_1-4 спирта, C_1-4 кетона;

предпочтительно, органический растворитель выбран из метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси; наиболее предпочтительно, выбран из метанола, этанола или ацетона.

В связи с этим, в данном изобретении предложен способ очистки без применения большого количества растворителя и силикагеля, и такой способ может не только превзойти недостатки предшествующего уровня техники, но и улучшить чистоту соединения Формулы I.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 показана ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) хроматограмма неочищенного соединения 1 Формулы I согласно Примеру I.

На Фиг.2 показана ВЭЖХ хроматограмма соединения Формулы I, очищенного в Примере 6.

Подробное описание изобретения

Посредством большого количества экспериментов обнаружили, что ароматическая макропористая адсорбционная смола, особенно ароматическая производная смола, такая как ароматическая смола с бромом, связанным с ее скелетом, улучшила гидрофобную адсорбцию, и такая смола покажет сильную адсорбцию для вещества с сильной гидрофильностью, такого как соединение Формулы I. Смола является весьма эффективной при очистке соединения Формулы I от существенных примесей. Неполярная ароматическая адсорбционная смола, полимеризованная из стирола и дивинилбензола, или метакриловая адсорбционная смола средней полярности с остатками метакрилата в структуре обладает слабой гидрофобной адсорбцией, поэтому покажет слабую адсорбцию для вещества с сильной гидрофильностью, такого как соединение Формулы I. Однако неожиданно обнаружили, что когда соединение Формулы I абсорбируется на макропористой адсорбционной смоле, способные к ионизации соли можно добавлять для улучшения гидрофобности целевого соединения, поэтому соединение Формулы I может быстро абсорбироваться на смоле, очищая таким образом соединение Формулы I.

Способ очистки соединения Формулы I, предложенный настоящим изобретением, включает следующие стадии:

на первой стадии загрузка неочищенного соединения Формулы I в макропористую адсорбционную смолу;

на второй стадии промывка макропористой адсорбционной смолы с применением воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости; и

на третьей стадии элюирование соединения Формулы 1 из макропористой адсорбционной смолы с применением воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента.

Первая стадия может быть выполнена приведением раствора неочищенного соединения Формулы I в контакт с макропористой адсорбционной смолой. Приведение в контакт может быть выполнено путем: а) непосредственно подачи адсорбционной смолы в раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, и перемешивания образующейся в результате смеси в течение 5-120 мин; или б) наполнения хроматографического устройства, такого как хроматографическая колонка, адсорбционной смолой, и причем раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, пропускают через хроматографическую колонку, где скорость потока может составлять 0,1-10 объемов колонки в час.

В одном примере изобретения способ очистки включает следующие стадии:

А. непосредственно подача адсорбционной смолы в раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I, и перемешивание образующейся в результате смеси в течение 5-120 мин;

Б. отделение раствора, содержащего неочищенное соединение Формулы I, от смолы;

В. промывка макропористой адсорбционной смолы стадии Б водой, органическим растворителем или смешанным раствором органического растворителя и воды в качестве промывной жидкости;

Г. элюирование промытой адсорбционной смолы, полученной на стадии В, с помощью воды, органического растворителя или смешанного раствора органического растворителя и воды в качестве элюента, и затем сбор элюата, содержащего соединение Формулы I, с получением, таким образом, очищенного соединения Формулы I.

На стадии Б отделение включает, например, фильтрацию и центрифугирование для отделения смолы от фазы фильтрата.

Во всех способах очистки, предложенных изобретением, органический растворитель выбран из C_1-4 спирта, C _1-4 кетона или их смеси; предпочтительно, метанола, этанола, пропанола, бутанола, ацетона, бутанона или их смеси.

Во всех способах очистки, предложенных изобретением, макропористая адсорбционная смола с крупными порами выбрана из неполярной ароматической адсорбционной смолы, полимеризованной из стирола и дивинилбензола, или метакриловой адсорбционной смолы средней полярности с остатками метакрилата в структуре. Предпочтительно, смола выбрана из XAD серии адсорбционной смолы (RohmHaas, США), Diaion HP серии адсорбционной смолы (Mitsubishi Chemical Corporation, Япония) и адсорбционной смолы, содержащей бром и связанной со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи. Более предпочтительно, смола выбрана из XAD-1, XAD-2, XAD-3, XAD-4, XAD-5, XAD-6, XAD-7, XAD-7НР, XAD-8, XAD-16, XAD-16HP, HP-10, HP-20, HP-20ss, HP-21, HP-30, HP-40, HP-50, HP-2MG, SP-825, SP-850, SP-70, SP-700, SP207, SP20788 или их смеси. Наиболее предпочтительно, смола выбрана из НР20, XAD-16, XAD-16HP, SP207 или минигранулированных продуктов, таких как HP-20ss, SP207ss, размер частиц которых составляет 0,063 мм-0,150 мм, и производительность разделения которых была значительно улучшена.

Кроме того, обнаружили, что адсорбционная смола, содержащая галоген и связанная со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи, обладает более высокой эффективностью абсорбции и разделения. Адсорбционная смола, содержащая бром и связанная со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи, предпочтительна, и наиболее предпочтительной смолой являются SP207, SP207ss или их смесь. В настоящее время коммерчески доступными адсорбционными смолами, содержащими галоген и связанными со стирольной полимерной матрицей посредством химической связи, являются SP207, SP207aa (Mitsubishi Chemical Corporation, Япония), но они не ограничиваются этими двумя видами.

Что касается адсорбционной смолы без галогена, неочищенное соединение Формулы I смешивают со способными к ионизации солями перед загрузкой неочищенного соединения Формулы I для увеличения проводимости загрузочного раствора и гидрофобности целевого соединения Формулы I, тем самым улучшая абсорбцию смолы для целевого соединения. Способная к ионизации соль выбрана из сульфатов, нитратов, солей, содержащих галоген, фосфатов, ацетатов, карбонатов, цитратов, силикатов, персульфатов, хроматов, лактатов, оксалатов и т.д. или их смеси. Предпочтительно, способная к ионизации соль выбрана из одной или более чем одной следующей группы, состоящей из обыкновенных солей: солей, содержащих галоген, сульфатов, фосфатов, ацетатов, карбонатов и цитратов. Наиболее предпочтительно, смола выбрана из NaCl, KCl и (NH₄)₂SO₄.

На второй стадии способа очистки, предложенного данным изобретением, концентрация органического растворителя в промывной жидкости составляет 0-3%; предпочтительно, 0-2%. Способную к ионизации соль также можно добавлять в промывную жидкость. Способная к ионизации соль включает сульфаты, нитраты, соли, содержащие галоген, фосфаты, ацетаты, карбонаты, цитраты, силикаты, персульфаты, хроматы, лактаты, оксалаты и т.д. или их смесь. Предпочтительно, способная к ионизации соль выбрана из одной или более чем одной следующей группы, состоящей из обыкновенных солей: солей, содержащих галоген, сульфатов, фосфатов, ацетатов, карбонатов и цитратов. Наиболее предпочтительно, смола выбрана из NaCl, KCl и (NH ₄)₂SO₄.

На третьей стадии способа очистки, предложенного изобретением, концентрация органического растворителя в элюенте составляет 0-20%; предпочтительно, 0-5%.

В способе очистки, предложенном данным изобретением, промывку можно выполнять 1, 2 или 3 раза. Скорость потока в течение промывки может составлять 0,1-10 объемов колонки в час. Скорость потока в течение элюирования может составлять 0,1-10 объемов колонки в час.

Как используется в данном документе, выражения "соединение Формулы I" и "соединение I" могут быть использованы взаимозаменяемо, причем оба относятся к соединению, имеющему следующую структуру, или его фармацевтически приемлемым солям:

Как используется в данном документе, под "фармацевтически приемлемой солью" подразумеваются соли, образованные из следующих оснований: неорганическое основание, такое как натрий, калий, магний, кальций, алюминий и т.д.; органическое основание, такое как метиламин, этиламин, этаноламин, диетаноламин, триэтаноламин, циклогексаноламин, лизин, орнитин и т.д. или другие основания, относящиеся к фармацевтически приемлемым солям.

Как используется в данном документе, выражения "чистота соединения Формулы I", "чистота соединения I" и "ВЭЖХ чистота соединения I" могут быть использованы взаимозаменяемо, причем все относятся к процентному отношению площади пика соединения I к сумме всех площадей пиков, как измерено в условиях детектирования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предложенных данным изобретением.

Как используется в данном документе, выражения "неочищенное соединение Формулы I" и "неочищенное соединение I" могут быть использованы взаимозаменяемо, причем оба относятся к смеси, содержащей<80% соединения I, как измерено в условиях детектирования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предложенных данным изобретением. Неочищенное соединение I может быть получено при использовании любого подходящего способа, известного из уровня техники, включая, например, но, не ограничиваясь способами, описанными в Примере 1 EP 0431350 B1, где неочищенное соединение I получали ферментацией Coleophoma sp, F-11899 (FERM BP2635) и затем экстракцией мицелия, используя органический растворитель. Предпочтительно, экстракцию проводят, непосредственно добавляя культуру для ферментации в двукратный объем органического растворителя. Предпочтительный органический растворитель выбран из метанола, этанола или ацетона.

Как используется в данном документе, выражения "раствор, содержащий неочищенное соединение Формулы I", и "раствор, содержащий неочищенное соединение I", могут быть использованы взаимозаменяемо, причем оба относятся к раствору, который содержит целевое соединение I и одно или более чем одно нецелевое соединение. Раствор можно получить путем растворения неочищенного соединения I в воде, или буферном растворе, или реакционном растворе, содержащем соединение Формулы I, полученное любым способом. Можно использовать реакционный раствор, содержащий соединение I из любого способа, известного из уровня техники, для получения соединения I (см. Пример 1 CN 1040541 C). Например, но без ограничения, раствор получают добавлением воды или органического растворителя в раствор превращения соединения I. Концентрация органического растворителя в растворе неочищенного соединения I составляет 0%-2%.

Как используется в данном документе, термин "загрузка" относится к способу приведения раствора, содержащего неочищенное соединение I, в контакт с макропористой адсорбционной смолой, так что неочищенное соединение I адсорбируется на адсорбционной смоле с крупными порами. Термин "приведение в контакт" включает непосредственную подачу макропористой адсорбционной смолы в раствор и затем перемешивание, позволяя происходить адсорбции; или загрузка макропористой адсорбционной смолы в хроматографическое устройство, и причем раствор пропускают через хроматографическую колонку.

Под "промывкой" макропористой адсорбционной смолы подразумевается, что подходящий буферный раствор пропускают через макропористую адсорбционную смолу или над ней.

Как используется в данном документе, термин "промывной буферный раствор" относится к буферному раствору, используемому для промывки макропористой адсорбционной смолы (главным образом, для удаления органической фазы) перед тем, как целевое соединение I элюируют. В целях удобства, промывной буферный раствор и буферный раствор для загрузки образцов могут, но не обязательно, быть той же самой полярности.

Под "элюированием" молекул из макропористой адсорбционной смолы подразумевается, что молекулы удаляются из макропористой адсорбционной смолы путем изменения полярности буферного раствора вокруг макропористой адсорбционной смолы. Благодаря полярности буферный раствор может конкурировать с молекулами за центры адсорбции в макропористой адсорбционной смоле.

Как используется в данном документе, "элюирующий буферный раствор" используют для элюирования целевого соединения I из неподвижной фазы. Целевое соединение I можно элюировать из макропористой адсорбционной смолы элюирующим буферным раствором.

Термин "очистка" соединения I из композиции, содержащей целевое соединение I и одно или более чем одно нецелевое соединение, означает, что чистота соединения I в композиции повышается удалением (полностью или частично) по меньшей мере одного нецелевого соединения из композиции.

Все характеристики, упомянутые выше или в примерах изобретения ниже, можно необязательно объединять. Все характеристики, раскрытые в данном описании изобретения, можно использовать в любой комбинации. Любая альтернативная характеристика, соответствующая такому же, эквивалентному или похожему назначению, может заменять каждую характеристику, раскрытую в данном описании изобретения. Поэтому, если не оговорено особо, раскрытые характеристики представляют собой только общие примеры эквивалентных или похожих характеристик.

Главные преимущества изобретения включают:

1. Предложен новый дешевый способ очистки циклолипопептидного соединения, в частности, соединений эхинокандинов;

2. Преимущества стадий очистки в способе, предложенном данным изобретением, такие как простота способа, мягкие условия, высокий выход очистки, небольшое количество используемого органического растворителя, простота обработок, низкое загрязнение окружающей среды и тому подобное, в значительной степени уменьшают потребности в управлении процессом и оборудовании, тем самым снижая затраты;

3. Стабильные целевые продукты можно получать посредством способа, предложенного в изобретении, облегчая, таким образом, контроль качества готовой продукции и крупномасштабного производства.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано путем ссылки на следующие конкретные примеры. Следует понимать, что эти примеры только предназначены для того, чтобы иллюстрировать изобретение, а не ограничивать объем изобретения. Для экспериментальных способов в следующих примерах без определенных условий их выполняют при стандартных условиях или по указанию производителя. Если не оговорено особо, все процентные содержания, отношения, размеры или доли представлены по массе.

Единица массового/объемного содержания в процентах в изобретении хорошо известна специалисту в данной области, например масса растворенного вещества в 100 мл раствора.

Если не определено особо, все научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, как обычно очевидно специалисту в данной области. Более того, любой способ или вещество, похожие или эквивалентные способу или веществу, описанному в данном документе, можно использовать в способе по настоящему изобретению. Предпочтительные воплощения и вещества, описанные в данном документе, только предложены для иллюстрации.

В следующих примерах, соединение I определяют с помощью ВЭЖХ.

Анализ проводят на аналитической системе ВЭЖХ Waters. Анализ обращенно-фазовой ВЭЖХ применяют для определения FR179642, эхинокандина В и других аналогов. Вещество и условия, используемые в обращенно-фазовом анализе, приведены ниже: PLATISIL ODS хроматографическая колонка (размер частиц 5 мкм, 4,6 мм внутренний диаметр × 250 мм); температура: 30°C; подвижная фаза: 3% ацетонитрил / 0,5% однозамещенный фосфорнокислый натрий; скорость потока: 1 мл/мин;

детектирование при 210 нм УФ.

Пример 1

Получение неочищенного соединения 1 Формулы I

Реакционный раствор, содержащий соединение I, получали согласно Примеру 1 США 5376634. В растворе содержание соединения I составляло 7,3 г/л, а чистота ВЭЖХ соединения составляла 73,91% (см. Фиг.1 и Таблицу 1 для ВЭЖХ хроматограммы).

Таблица 1
	Время удерживания	Площадь	Высота	% Площадь
1	5,257	52004	4607	1,15
2	5,815	202507	25208	4,49
3	6,432	87928	6165	1,95
4	6,895	8923	1043	0,20
5	7,291	121333	10471	2,69
6	7,710	44199	2234	0,98
7	8,353	11225	1099	0,25
8	9,578	3334358	165845	73,91
9	11,460	134324	9884	2,98
10	13,681	11436	779	0,25
11	14,848	9766	729	0,22
12	15,163	23807	1379	0,53
13	19,268	307011	6129	6,81
14	24,014	162338	6277	3,60

Пример 2

Очистка соединения I

500 мл раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере 1, применяли в данном Примере, где раствор содержал 3,65 г соединения I.

К неочищенному раствору добавляли 25 г NaCl. При растворении неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, наполненную 370 мл смолы HP20ss, где скорость потока в течение загрузки составляла 1 объем колонки в час. После этого, 3% водн. NaCl (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 1000 мл чистой воды применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 3,4 г с помощью ВЭЖХ (выход 93,2%), а его чистота составляла 97,2%.

Пример 3

Очистка соединения I

1 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере 1, применяли в данном Примере, где раствор содержал 7,3 г соединения I.

К неочищенному раствору добавляли 40 г KCl. При растворении неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, наполненную 0,8 л смолы XAD-16, где скорость потока в течение загрузки составляла 1 объем колонки в час. После этого, чистую воду (5 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 2,5 л 3% водн. метанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 6,6 г с помощью ВЭЖХ (выход 90,4%), а его чистота составляла 96,5%.

Пример 4

Очистка соединения I

1 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере 1, применяли в данном Примере, где раствор содержал 7,3 г соединения I.

Неочищенный раствор добавляли в пластиковый дозирующий стакан (5 л). В дозирующий стакан добавляли 1,4 л смолы XAD-16HP и 50 г (NH₄)₂SO₄ . Получающуюся в результате смесь перемешивали в течение 120 мин при комнатной температуре и затем фильтровали с помощью воронки Бюхнера, на которую клали кусок фильтровальной бумаги. Фильтрат отбрасывали, и смолу загружали в хроматографическую колонку. 3 л чистой воды применяли для промывки колонки. Затем 5 л 4% водн. ацетона применяли в качестве элюента. Порции, содержащие соединение I, собирали. Содержание соединения I в элюате определяли как 6,7 г с помощью ВЭЖХ (выход 92,5%), а его чистота составляла 97,3%.

Пример 5

Очистка соединения 1

0,5 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере 1, применяли в данном Примере, где раствор содержал 4,6 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 300 мл смолы SP207ss, где скорость потока в течение загрузки составляла 5 объемов колонки в час. Затем 1% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час, и 2% водн. этанол (2 × объемы колонки) применяли для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 3,6 л 3% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 4,33 г с помощью ВЭЖХ (выход 94,2%), а его чистота составляла 99,0% (см. Фиг.2 и Таблицу 2 для ВЭЖХ хроматограммы).

Таблица 2
	Время удерживания	Площадь	Высота	%Площадь
1	6,481	100952	8789	0,41
2	6,890	29266	406	0,12
3	7,509	34144	889	0,14
4	9,464	24141515	1222680	99,00
5	11,387	82921	1983	0,33

Пример 6

Очистка соединения 1

0,5 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере I, применяли в данном Примере, где раствор содержал 4,6 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 600 мл смолы SP207ss, где скорость потока в течение загрузки составляла 5 объемов колонки в час. Затем применяли чистую воду (2 × объемы колонки) для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 7,2 л 2% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 2 объема колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли 4,4 г с помощью ВЭЖХ (выход 95,6%), а его чистота составляла 99,0%.

Пример 7

Очистка соединения I

0,5 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере I, применяли в данном Примере, где раствор содержал 4,6 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 46 л SP207 смолы, где скорость потока в течение загрузки составляла 5 объемов колонки в час. Затем применяли чистую воду (2 × объемы колонки) для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 150 л 20% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 2 объема колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 4,02 г с помощью ВЭЖХ (выход 87,4%), а его чистота составляла 98,1%.

Пример 8

Очистка соединения I

0,5 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере I, применяли в данном Примере, где раствор содержал 4,6 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 460 мл SP207 смолы, где скорость потока в течение загрузки составляла 5 объемов колонки в час. Затем применяли 1% водн. этанол (2 × объемы колонки) для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 3,0 л 5% водн. этанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 4,4 г с помощью ВЭЖХ (выход 95,6%), а его чистота составляла 97,9%.

Сравнительный Пример 1

Очистка соединения I

500 мл раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере I, применяли в данном Примере, где раствор содержал 3,65 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 370 мл HP20ss смолы, где скорость потока в течение загрузки составляла 1 объем колонки в час. Затем, применяли 1000 мл чистой воды в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 3,4 г с помощью ВЭЖХ (выход 93,2%), а его чистота составляла 75,2%.

Сравнительный Пример 2

1 л раствора, содержащего неочищенное соединение I, полученное в Примере I, применяли в данном Примере, где раствор содержал 7,3 г соединения I.

Неочищенный раствор загружали в хроматографическую колонку, заполненную 0,8 л XAD-16 смолы, где скорость потока в течение загрузки составляла 1 объем колонки в час. Затем применяли чистую воду (5 × объемы колонки) для промывки колонки, причем скорость потока в течение промывки составляла 1 объем колонки в час. И затем 2,5 л 3% водн. метанола применяли в качестве элюента, где скорость потока в течение элюирования составляет 1 объем колонки в час. Порции, содержащие соединение I, собирали и смешивали. Содержание соединения I в элюате определяли как 6,6 г с помощью ВЭЖХ (выход 50,4%), а его чистота составляла 79,5%.

Указанные ранее примеры представляют собой только предпочтительные примеры для настоящего изобретения, и такие примеры не могут быть использованы для того, чтобы ограничивать объем изобретения. Существенному техническому содержанию по настоящему изобретению дано широкое определение в формуле изобретения. И любые понятия или способы, выполняемые другими, следует рассматривать как эквиваленты, и они находятся в пределах объема, как определено формулой изобретения, если указанные понятия или способы являются такими же, как понятия и способы, определенные формулой изобретения.