штамм rhodococcus erythropolis для очистки воды и донных отложений от нефти и нефтепродуктов

Формула изобретения

Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM Ac-2611D, для очистки воды и донных отложений водоемов от нефти и нефтепродуктов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки воды и донных отложений от загрязнений нефтью в течение 3-40 суток в диапазоне температур от 0 до +25°C.

Известен способ очистки водных поверхностей от нефтяных загрязнений путем внесения в воду консорциума клеток микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 с последующей аэрацией водных объектов, патент RU N 2241032, 2004. Недостатком способа является ограничение по температуре эффективной очистки среды - не ниже +14°С.

Известен штамм Pseudomonas putida, патент RU N 2053296, 1996, обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды.

Известен штамм Mycobacterium flavescens, патент RU N 2023686, 1994, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-28°C).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°C и снижение уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.

Задача изобретения - получение штамма бактерии, обеспечивающего эффективное разрушение нефти в воде и донных отложениях пресноводных объектов в диапазоне температур от 0 до +25°C.

Штамм выделен в 2007 году из накопительной культуры из проб загрязненного нефтью донного грунта пресноводного озера с глубины 7 м в зоне хронического нефтяного загрязнения путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды Стейниера. Далее выделенную культуру изучали с целью установления субстратспецифичности к нефтяным углеводородам путем исследования возможности использования штаммом в качестве единственного источника углерода углеводородов сырой нефти. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM Ac-2611D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм растет на агаризованной среде, которая может содержать жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамоположительные бактерии с морфологическим циклом от клеток с элементарным ветвлением в молодой культуре, палочки на стадии зрелой культуры и кокки в старой культуре. Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, матовые, розоватого цвета. Консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует, микобактины отсутствуют, кислотоустойчив. Аэроб, факультативный анаэроб.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH ₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H ₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; сахароза - 15,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; сахароза - 15,0; алканы - 10 г. Наработка биомассы в колбах на шейкере при 15-25°C, 180-220 об/мин, 3-5 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах, результаты приведены в примерах ниже. Для исследования нефтеокисляющих свойств штамма проводили культивирование бактерии путем высева соскоба из пробирки на среду для культивирования. Титр клеток после культивирования не менее 10¹⁰/1 мл.

Пример 1. Исследование нефтеокисляющих свойств штамма Rhodococcus erythropolis KP-216O_2.

Для опытов готовили минеральную среду, содержащую на 1 л дистиллированной воды: NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,5 г; KCl - 1 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г. Среду разливали в колбы по 100 мл и стерилизовали. После остывания в колбы (кроме контроля) добавляли 1 мл препарата на основе Rhodococcus erythropolis KP-216O_2 с исходным титром не менее 10¹⁰ кл/1 мл. В начале опыта титр живой культуры в опытных колбах был не менее 10⁸ кл/1 мл. В опытные колбы добавляли сырую нефть по 5 мл. Колбы устанавливали на качалку и выдерживали 5-7 суток, затем проводили анализ состава остаточной нефти.

Краткое описание фигуры 1

Разрушение алкановой фракции нефти штаммом KP-216O_2

Как можно увидеть на фигуре 1, за 5-7 суток происходит заметное изменение структуры алкановой фракции нефти, причем наибольшее изменение массовой доли н-алканов характерно для соединений с длиной цепи от C13 до C36. Массовая доля н-алканов в составе остаточной нефти снижается в присутствие испытуемого штамма на 67%. В то же время общая концентрация нефти снижается на 85%. Уровень растворенных в воде углеводородов в первые сутки возрастает с 12,7 мг/л до 65 мг/л, затем резко снижается до исходных значений и далее до 1,68 мг/л к концу 7-х суток (табл.1).

Таблица 1
Изменение массовой доли нефтяных углеводородов в присутствие штамма KP-216O_2 за 5-7 суток при температуре 25°C в условиях интенсивной аэрации
Оцениваемые показатели	в начале опыта	через сутки	через 7 дней
общая масса нефти, г	4,58	4,01	0,69
раствореные углеводороды, мг/л	12,7	65	1,68
сумма ПАУ, мкг/кг	242	215	25

Таким образом, испытуемый штамм проявляет хорошие нефтеокисляющие свойства в условиях интенсивной аэрации при температуре +20-+25°C.

Пример 2. Изучение способности штамма KP-216O_2 окислять нефть при отличающейся температуре среды без проведения дополнительной аэрации среды.

Хорошо известно, что основные процессы нефтеокисления в присутствии нефтеокисляющих микроорганизмов проходят при нормальном парционном давлении кислорода и при температуре от +10 до +25°C. Однако в природных условиях колебание температуры может быть значительным, а в загрязненных нефтью водоемах с глубиной резко снижается уровень растворенного кислорода. Применение методов аэрации воды для промышленных масштабов зачастую весьма проблематично, а с учетом того, что в России основные месторождения нефти сосредоточены в районы Севера и Крайнего Севера, встает вопрос о возможности и целесообразности использования методов биологической очистки загрязненных экосистем в условиях холодного климата. В этой связи, а также с учетом того, что штамм выделен из донных отложений озера с довольно низкой из-за близости мерзлотных слоев температурой, мы предприняли попытку оценить возможность использования штамма Rhodococcus erythropolis KP-216O_2 при низкой температуре среды и без дополнительной аэрации. Для этого был проведен лабораторный опыт, где на дно колб размещали по 20 г донных отложений загрязненных нефтью с исходной концентрацией нефтепродуктов 25 г/кг. Колбы заливали водой (200 мл) и добавляли 1 мл готового препарата из Rhodococcus erythropolis KP-216O_2.

Колбы помещали в холодильники и термостат при отличающихся температурах: 0, +10, +20°C на 45 дней. В начале и в конце опыта проводили анализ общей концентрации нефти в пробах донных отложений (табл.2).

Таблица 2
Изменение массы нефти (мг/кг) в пробах донных отложений
Вариант	температура среды, °C	донные отложения в начале опыта	донные отложения в конце опыта	Эффективность разрушения нефти, %
Контроль	0	25	24,6	1,6
	10	25	23,1	7,6
	20	25	21,1	15,6
Rhodococcus erythropolis KP-216O_2	0	25	14,65	41,4
	10	25	6,35	74,6
	20	25	0,56	97,76

Как следует из результатов, представленных в таблице 2, в присутствие исследуемого штамма общая концентрация нефти при нулевой температуре может снижаться без проведения дополнительной аэрации на 41,4%, при увеличении температуры до +10 градусов масса нефти снижается за 45 дней на 74%, и при +20°C на 97,76%. Снижение массы нефти в контрольном варианте обусловлено нефтеокисляющими свойствами аборигенной микробиоты самих донных отложений. Исходя из полученных результатов лабораторных испытаний можно говорить о том, что штамм Rhodococcus erythropolis KP-2160_2 может оказаться перспективным для активизации очистки нефтезагрязненных водных экосистем и донных отложений водоемов после аварийных разливов нефти в условиях холодного климата.

Таким образом, получен технический результат очищения водных сред от нефти, заключающийся в том, что при добавлении штамма Rhodococcus erythropolis KP-216O_2 в воду снижается концентрация нефти в воде и массе донных отложений в температурном диапазоне от 0 до +25°C как с проведением дополнительной аэрации, так и без нее, что позволяет использовать полученный штамм для восстановления нефтезагрязненных пресноводных экосистем в условиях холодного климата.