способ обнаружения микроорганизма вида vibrio parahaemolyticus

Формула изобретения

1. Способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus, включающий использование индикаторного штамма с последующим лизированием исследуемой культуры фагом, отличающийся тем, что в качестве индикаторного штамма используют Vibrio parahaemolyticus КМ-97, из которого перед применением готовят диагностический фаг путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n·10⁸ БОЕ/мл, затем проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°C в течение 20-24 часов и по присутствию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают его принадлежность к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что газон культуры исследуемого штамма готовят с предварительным выращиванием последнего в термостате в течение 4-х часов при 37°C после посева в бульон Мартена с 3% NaCl, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают его вторым слоем на пластинку агара Мартена с 3% NaCl в чашки Петри, посев подсушивают с последующим нанесением препарата фага.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, лабораторной диагностике острых кишечных заболеваний, вызываемых Vibrio parahaemolyticus.

В настоящее время в лабораторной диагностике большинства бактериальных кишечных инфекций используются специфические бактериофаги, позволяющие идентифицировать выделенные микробные штаммы с высокой степенью достоверности.

В связи с возрастающей заболеваемостью пищевыми отравлениями, обусловленными Vibrio parahaemolyticus, значение фагодиагностики галофильных микроорганизмов усиливается и актуально в осуществлении поиска новых, простых и эффективных методов их детекции, так как позволяет выделить специфические свойства определенного вида вибрионов при взаимодействии с фагами, осуществить дифференциацию от микроорганизмов близкородственных родов, семейств, а отсутствие специфического препарата фага для диагностики Vibrio parahaemolyticus снижает эффективность противоэпидемических и лечебно-профилактических мероприятий. Известны способы диагностики заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами (см. Методические указания МУК 4.2.1793-03, Москва, 2004 г. стр.23), заключающиеся в серологическом типировании парагемолитических вибрионов, которое проводят по схеме. Набор агглютинирующих О и К-сывороток для серологического типирования на стекле выпускает японская фирма Toschiba Kazaki Co. Ltd.

Недостатком такого способа является то, что проведение серологического типирования является трудоемким процессом, так как для каждого серотипируемого штамма необходима индивидуальная агглютинирующая сыворотка, а это обстоятельство значительно увеличивает время проведения одного лабораторного анализа и, кроме того, агглютинирующие сыворотки (Япония), недоступны и дорогостоящи.

За прототип выбран способ фагодиагностики парагемолитических вибрионов серотипа O5:К15 (см. а.с. СССР № 1671690, кл. С12 № 7/00, 23.08.91 г.), заключающийся в том, что используют штамм фага V. parahaemolytici Ф-139, который размножают с помощью метода Грациа на щелочных средах, содержащих 3% NaCl, и индикаторной культуре, внесенной в агар.

Однако использовать фаг Ф-139 для идентификации V. parahaemolyticus других О и К-сероваров не представляется возможным из-за ограниченных литических свойств фага в пределах штаммов серогруппы O5:К15 V. parahaemolyticus.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке эффективного способа, позволяющего ускорять идентификацию штаммов V. parahaemolyticus различных сероваров, расширяя спектр его действия.

Поставленная задача достигается тем, что в способе обнаружения микроорганизмов вида Vibrio parahaemolyticus, включающем использование индикаторного штамма с последующим лизированием исследуемой культуры фагом, в качестве индикаторного штамма используют Vibrio parahaemolyticus KM-97, из которого перед применением готовят путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n·10⁸ БОЕ/мл, затем проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°C в течение 20-24 часов и по присутствию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают его принадлежность к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus.

При этом газон культуры исследуемого штамма готовят с предварительным выращиванием последнего в термостате в течение 4-х часов при 37°C после посева в бульон Мартена с 3% NaCl, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают его вторым слоем на пластинку агара Мартена с 3% NaCl в чашки Петри, посев подсушивают с последующим нанесением препарата фага.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа используют: индикаторный штамм Р-14706, депонированный в ГКПБ «Микроб» г. Саратов, под номером КМ-97, фаг 1154 Vibrio parahaemolyticus, фаг 3256 Vibrio parahaemolyticus.

Фаг 1154 Vibrio parahaemolyticus депонирован и хранится под номером ФК-44 (1154) в коллекции лаборатории бактериофагов ФКУЗ Рост НИПЧИ. При электронно-микроскопическом изучении фаг характеризуется III морфогруппой по классификации А.С. Тихоненко. По серологическим свойствам фаг ФК-44 принадлежит к III серотипу. Диапазон литической активности распространяется на 80,4% штаммов Vibrio parahaemolyticus различных О-сероваров.

Фаг 3256 Vibrio parahaemolyticus депонирован под номером ФК-46 (3256) и хранится в коллекции лаборатории бактериофагов ФКУЗ Рост НИПЧИ. При электронно-микроскопическом изучении установлено, что фаг относится к IV морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко. Результаты изучения серологических свойств показали его принадлежность к IV серотипу фагов парагемолитических вибрионов. Важной особенностью фага является специфичность логического действия в отношении 60,1% штаммов V. parahaemolyticus различных О-сероваров.

Для размножения бактериофагов ФК-44 (1154) и ФК-46 (3256) используют индикаторный штамм Vibrio parahaemolyticus КМ-97 (Р-14706). Фаги ФК-44 и ФК-46 сохраняют в ампулах, срок хранения 1 год. Титр фагов составляет n·10⁸-10 ⁹ БОЕ/мл.

Препарат фага (ДИФ) получают перед непосредственным его использованием для высокой сохранности активных частиц фагов. Готовят бивалентную смесь фагов ФК-44 и ФК-46 в соотношении 1:1 в титре n·10⁸ БОЕ/мл, берут 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46, которые соединяют в пробирке и препарат ДИФ готов к использованию.

Следующим этапом готовят газон культуры исследуемого штамма, который может быть выделен от больного, из пищевых продуктов, пробы воды, рыбы, гидробионтов. По методу Грациа газон выполняют двухслойным. Нижний слой представляет агаровую среду pH 7,6 с добавлением 3% NaCl. Верхний слой получают из 4,0 мл исследуемой пробы, которую выращивают в бульоне Мартена с 3% NaCl при 37°C в течение четырех часов, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластинки агара в чашках Петри. После застывания агар подсушивают. Затем препарат ДИФ наносят каплей в виде дорожки на газон исследуемой культуры и инкубируют при 37°C в течение 20-24 часов.

Учет результатов, а именно идентификацию Vibrio parahaemolyticus, проводят по наличию зоны фаголизиса на выросшей культуре. Прозрачная зона лизиса подтверждает присутствие V. parahaemolyticus, а его отсутствие исключает принадлежность к этому виду микроба.

Пример 1, подтверждающий специфичность действия фага ДИФ в отношении вибрионов и других близкородственных организмов.

При создании препарата ДИФ были выбраны 9 различных типов фагов с учетом их биологических особенностей (фаги 109, 123, 154, 616, 124, 175, 227, 1154, 3256). Диапазон действия этих фагов (по лизису штаммов) составил от 7,0 до 34,7%. Затем комбинируют 3 варианта смесей: 1) 1154+3256; 2) 1154+227; 3) 3256+154. Проводят испытания этих смесей на 184 штаммах парагемолитических вибрионов различных серотипов (см. таблицу 1). Первая смесь лизировала 92,5% изученных штаммов, вторая - 72,09%; третья - 41,39%. Из таблицы видно, что первый вариант смеси, препарат фага ДИФ, обладает высоким специфическим действием в отношении вибрионов и других близкородственных организмов. Титр фага составил n·10⁸ БОЕ/мл.

Фаг ДИФ лизирует 92,5% штаммов Vibrio parahaemolyticus и не оказывает литического действия в отношении бактерий семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae.

Пример 2. Использование препарата фага ДИФ для идентификации V. parahaemolyticus.

Из испражнений больного (48 лет) с признаками пищевой токсикоинфекции выделяют культуру, подозрительную по морфологическим признакам на V. parahaemolyticus. Фагодиагностику этой культуры проводят следующим образом: первоначально исследуемую культуру в количестве 4,0 мл выращивают в бульоне Мартена с 3% NaCl в течение 4-х часов при 37°C. После этого 0,3 мл выросшей культуры смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластину застывшего 1,5% агара Мартена (pH 7,6) с 3% NaCl в чашки Петри. После застывания агар подсушивают и в центр чашки наносят пипеткой каплю фага ДИФ. Посевы оставляют при 37°C на 20-24 часа и на месте нанесения фага ДИФ обнаруживают зону просветления. В результате исследуемую культуру классифицируют как V. parahaemolyticus.

Пример 3. Культуру, выделенную из проб морской воды (проба из воды Черного моря по мониторингу на вибриофлору, август 2012 года), подозрительную на V. parahaemolyticus, изучали по методике, описанной в примере 1. После лизирования исследуемой культуры фагом ДИФ в течение суток диагностировали присутствие в пробах галофильных вибрионов V. parahaemolyticus.

Использование предложенного способа позволяет эффективно применять его в лабораторной диагностике, так как выраженная чувствительность к фагу ДИФ у Vibrio parahaemolyticus, условия выращивания в присутствии NaCl в среде позволяет использовать его в качестве дополнительного теста дифференциации возбудителей пищевой токсикоинфекции, гастроэнтеритов, который может быть применен в лабораторной диагностике для того, чтобы:

- использовать при проведении эпиданализа острых кишечных заболеваний с пищевыми токсикоинфекциями;

- применять в лабораторной диагностике штаммов V. parahaemolyticus, выделенных от больных и из внешней среды (из морской воды, гидробионтов и др.);

- проводить типирование фагом ДИФ штаммов V. parahaemolyticus различных К и О-сероваров;

- дифференцировать фагочувствительные штаммы V. parahaemolyticus от резистентных к фагу бактерий;

- экономичность и простота выполнения анализа, ускоренное получение результатов, доступность любой лаборатории позволяют рекомендовать ДИФ для широкого применения, особенно при массовых исследованиях и чрезвычайных эпидемиологических обстоятельствах. При этом эффективность диагностических мероприятий может быть существенно повышена за счет использования диагностического фага.

Таблица
Семейство	Род	Вид	Кол-во штаммов	Из них чувствительны к ДИФ (%)
Vibrionaceae	Vibrio	V. parahaemolyticus	184	92,5
		V. cholerae cholerae	56	0
		V. cholerae eltor	252	0
		V. cholerae non O1/non O139	57	0
		V. cholerae O139	36	0
		V. metschnikovii	7	0
		V. mimicus	5	0
		V. fluvialis	1	0
		V. vulnificus	4	0
		V. furnissii	5	0
		V. diazotrophicus	2	0
		V. splendidus	2	0
		V. cambellii	2	0
		V. pelagius	1	0
		V. orientalis	1	0
	Aeromonas		13	0
Pseudomonadaceae	Pseudomonas		19	0
Enterobacteriaceae	Escherihia		5	0
	Schigella		5	0
	Salmonella		12	0