способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки

Формула изобретения

1. Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки, включающий получение белкового раствора, его пастеризацию, ультрафильтрацию, ферментативный гидролиз и пастеризацию полученного гидролизата, отличающийся тем, что белковый раствор с содержанием жира не более 0,05% получают из сухого концентрата сывороточного белка, сухой молочной сыворотки или нативной подсырной сыворотки, ультрафильтрацию белкового раствора проводят при температуре 8-12°C на ультрафильтрационных мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа до массовой доли сухих веществ в ретентате 8-18%, перед внесением ферментного препарата температуру ретентата молочной сыворотки доводят до 50-55°C, а его начальное значение pH - до 7,0-7,2 добавлением 20%-ного водного раствора гидроксида натрия, ферментативный гидролиз ведут препаратом «Protamex» в дозировке 2,5-4,0% от массы белка в ретентате при температуре 50-55°C в течение 1,5 ч без pH-статирования, а полученный гидролизат пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 мин.

2. Пептидная композиция, полученная указанным выше способом, со степенью гидролиза не более 6%, суммарным содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты не более 4 мг/мл, пониженным содержанием аллергенов молочной сыворотки -лактальбумина, -лактоглобулина и бычьего сывороточного альбумина, и обладающая антиоксидантной и гипотензивной активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к получению низкогидролизованных пептидных композиций из белков молочной сыворотки с антиоксидантными и гипотензивными свойствами и привлекательными органолептическими характеристиками, используемых при производстве функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных продуктов для лиц с пищевой непереносимостью белков молока.

В последнее десятилетие большое внимание уделяется разработке функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных продуктов для питания ключевых категорий лиц с пищевой непереносимостью или аллергией на определенные пищевые компоненты, или алиментарно-зависимыми заболеваниями. При этом основой данных категорий пищевых продуктов, придающих им соответствующие свойства, являются функциональные пищевые ингредиенты. Многочисленные исследования показали, что ферментативные гидролизаты пищевых белков, в том числе гидролизаты казеина и белков молочной сыворотки, обладают не только питательной ценностью за счет содержания незаменимых и заменимых аминокислот в легкоусвояемой форме, но и являются источником биологически активных пептидов, участвующих в регуляции различных функций организма, включая поддержание баланса микрофлоры желудочно-кишечного статуса, антиоксидантного и иммунного статуса, регуляцию артериального давления и др. Таким образом, очевидно, что для профилактики развития клинических признаков пищевой непереносимости молочных белков, повышения антиоксидантного статуса, профилактики функциональных нарушений со стороны деятельности сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и восстановления баланса его микрофлоры необходимо разрабатывать способы получения пептидных композиций, обладающих антиоксидантным, гипотензивным и пребиотическим действием.

В частности, известен способ получения гидролизата белка молочной сыворотки, предусматривающий смешивание сывороточного белкового продукта, содержащего по меньшей мере 65% белка из расчета по сухому веществу, и воды с получением суспензии с содержанием белка до 20%, протеолитический гидролиз суспензии до степени гидролиза 15 и 35%, выделение из смеси на ультра- или микрофильтрационном устройстве со значением отсекания выше 10000 белкового гидролизата в виде пермеата, отличающийся тем, что перед протеолитическим гидролизом суспензию подвергают тепловой обработке при температуре выше 60°C, нагретую таким образом смесь подвергают регулированию pH щелочным веществом, гидролиз ведут протеазой, продуцируемой В. licheniformis, предпочтительно Alcalase, и/или протеазой, продуцируемой В. subtilis, предпочтительно Neutrase, посредством метода нестатичного pH, после выделения белкового гидролизата проводят инактивацию ферментов (см. Патент РФ № 2084172, 27.05.1992 г.).

Недостатком данного способа является получение средне (степень гидролиза 5-20%) и глубоко (степень гидролиза более 20%) гидролизованных пептидных композиций со средней длиной пептидной цепи не более 5 аминокислотных остатков, обладающих низкой степенью горечи, что снижает как потребительские свойства гидролизатов, так и пищевых продуктов на их основе. Кроме того, в примерах, раскрывающих данное изобретение, приводятся данные по использованию для гидролиза сывороточных белков молока композиции из двух ферментных препаратов (Neutrase и Alcalase 2.4L), что приводит к увеличению себестоимости получения гидролизатов.

Известен способ получения частичного гидролизата молочных белков (при соотношении сывороточные белки/казеин от 40/60 до 80/20), включающий гидролиз, концентрирование и сушку. Гидролиз осуществляют в одну стадию под действием смеси ферментов трипсина и химотрипсина, при этом белок предварительно термически денатурируют при (70-80)°C. Гидролиз проводят в 4-6% растворе субстрата при фермент-субстратном соотношении 0,6-0,8% при температуре (30-50)°C в течение 2-6 часов. Устанавливают исходный pH 7,5-8,0 ед. и далее в ходе процесса не pH-статируют, позволяя pH опуститься до величины 6,5-6,8 ед. Далее проводят термическую инактивацию фермента при температуре (80-90)°C, концентрирование и сушку. Гидролизат используют в продуктах непосредственно, без дальнейшей очистки. По данным иммуноферментного анализа (проводимого в варианте метода торможения непрямого иммуноферментного теста) антигенность гидролизата снижается на 75-95% в сравнении с исходным белком (см. Патент US № 5405637, НКИ 426/580, 11.04.1995 г.).

Приведены исследования молекулярно-массового распределения методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке TSK, которые, однако, были получены в водно-органических средах и поэтому недостаточно адекватно отражают состав гидролизата.

Аналогичный метод получения "частичных" гидролизатов молочного белка приводится в патенте (см. Патент US № 5589357, НКИ 435/68.1, 31.12.1996 г.). В отличие от описанного выше способа инактивацию смеси ферментов трипсин+химитрипсин в гидролизате проводят острым паром.

Недостатки представленных выше аналогов следующие:

- дополнительно необходима стадия термической инактивации фермента, которая может приводить к ухудшению качества продукта (снижению биологической ценности из-за потери части незаменимых аминокислот);

- непосредственно после проведения гидролиза и инактивации ферментов гидролизат сушат без дополнительной очистки. Это приводит к тому, что в состав продукта попадают остаточные количества нерасщепленного белкового субстрата и компоненты ферментных препаратов, которые могут сами по себе обладать аллергенным действием, что ухудшает качество продукта и снижает возможность его использования в гипоаллергенных смесях;

- степень снижения антигенности получаемого продукта составляет 75-95%, что соответствует снижению в 4-20 раз. Этого крайне недостаточно для использования данного гидролизата в гипоаллергенных продуктах питания. В составе гипоаллергенных смесей профилактического назначения степень снижения антигенных свойств должна составлять 10⁴ (10.000) раз или более;

- в ходе проведения процесса производится мониторинг молекулярно-массового распределения пептидов методом эксклюзионной хроматографии на колонке TSK G-2000 SWXL. Однако при этом применяется растворитель, содержащий ацетонитрил, что может исказить результаты анализа, а именно привести к занижению содержания пептидов с молекулярными массами более 10 кДа (килодальтон) вследствие выпадения их в осадок при растворении в подвижной фазе, содержащей ацетонитрил. При этом следует отметить - степень потери белково-пептидного материала зависит от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе, что делает результаты анализа неопределенными.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролиза. Способ включает получение белкового раствора, его пастеризацию, ферментативный гидролиз панкреатином, ультра- и диафильтрацию полученного гидролизата с разделением на фильтрат и концентрат, сушку. Белковый раствор получают из сухого концентрата сывороточного белка, а гидролиз ведут при фермент-субстратном соотношении 1,5-2,5%, при температуре 48-54°C в течение 3-3,5 часов, с начальным pH 7,9-8,3 (см. Патент РФ № 2375910).

Недостатками предложенного способа являются:

- использование панкреатина для получения гидролизата, что приводит к увеличению его себестоимости по сравнению с гидролизатами, полученными при использовании бактериальных пищевых ферментных препаратов.

- диафильтрация полученного раствора, приводящая к дополнительным потерям белка.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении низкогидролизованных пептидных композиций из белков молочной сыворотки с привлекательными органолептическими характеристиками (без горечи), с антиоксидантной и гипотензивной активностью и пониженным содержанием белков-аллергенов молочной сыворотки, что дает возможность их использования при производстве функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных пищевых продуктов для людей с пищевой непереносимостью белков молока.

«Protamex» является протеазным комплексом, продуцируемым микроорганизмами рода Bacillus. Активность ферментативного препарата составляет не менее 400 Протеолитических единиц на 1 г. Использование фермента «Protamex», разрешенного для применения в пищевых производствах и пищевых системах, обеспечивает приятный вкус готовому продукту без наличия горечи в отличие от известных аналогичных продуктов и серо-бежевый или кремовый цвет.

Технический результат достигается тем, что способ получения низкогидролизованных пептидных композиций белков молочной сыворотки включает приготовление белкового раствора (очистку молочной сыворотки, сепарирование), его пастеризацию, ультрафильтрацию, ферментативный гидролиз препаратом «Protamex» и пастеризацию полученного гидролизата для термической инактивации ферментного препарата «Protamex». Белковый раствор получают из сухого концентрата сывороточного белка, сухой молочной сыворотки или используют нативную подсырную сыворотку. При содержании жира в белковом растворе более 0,05% его обезжиривают пропусканием через сепаратор. Пастеризацию белкового раствора проводят при температуре от 75 до 85°C с выдержкой 20-30 с. Ультрафильтрацию белкового раствора проводят при температуре 8-12°C на ультрафильтрационных мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа до содержания сухих веществ в ретентате 8-18%. Перед внесением ферментного препарата «Protamex» ретентат подогревают до температуры 50-55°C и его начальное значение pH доводят добавлением 20% водного раствора гидроксида натрия до 7,0-7,2, а гидролиз ведут при температуре 50-55°C, дозе (E/S) ферментного препарата «Protamex» 2.5-4,0% от содержания белка в ретентате в течение 1,5 часов без pH-статирования, после чего полученный гидролизат пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 минут.

Экспериментально было установлено, что оптимальная температура проведения гидролиза составляет 50-55°C. Отклонение в меньшую сторону ниже 50°C нежелательно, т.к. приводит к увеличенному содержанию остающихся в реакционной смеси негидролизованных высокомолекулярных белковых структур, что снижает выход получаемого продукта и приводит к снижению качества, повышению остаточной аллергенности гидролизата. Отклонение в большую сторону (свыше 55°C) также нежелательно, т.к. приводит к ускорению процесса термической инактивации ферментного препарата, что влечет за собой уменьшение выхода готового продукта. Кроме того, это приводит к перерасходу энергии на поддержание температуры в ходе процесса и последующее охлаждение готового продукта, что вызывает увеличение себестоимости продукта.

Экспериментально было установлено, что ультрафильтрация белкового раствора на мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа позволяет получить концентрат белков молочной сыворотки (ретентант) с максимальным выходом. Использование мембран с меньшей пористостью снижают выход как ретентата, так и конечного продукта (гидролизата).

Проведение гидролиза ретентата ферментным препаратом «Protamex» при установлении начального pH 7,0-7,2 ед., которое в течение гидролиза постепенно снижается, позволяет не проводить в дальнейшем pH-статирование, что уменьшает количество солей, поступающих в продукт, и, следовательно, улучшает его качество. Регулирование начального pH реакционной смеси осуществляют 20%-ным раствором щелочи (гидроксида натрия).

Пастеризация гидролизата необходима для улучшения его микробиологических показателей, а также термической инактивации ферментного препарата «Protamex». Уменьшение температуры пастеризации ниже заявленного диапазона значений приводит к возрастанию риска микробной контаминации гидролизата и продуктов на его основе при их последующем хранении.

Заявляемая совокупность признаков позволяет получить низкогидролизованные пептидные композиции белков молочной сыворотки с привлекательными органолептическими характеристиками, пониженной антигенностью, антиоксидантной и гипотензивной активностью. В заявляемом изобретении остаточная антигенность контролируется методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа и рассчитывается как отношение содержания аллергенов молочной сыворотки в гидролизате и ретентате.

Результаты определения содержания белков-аллергенов в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 1. Как видно из представленных данных остаточная антигенность гидролизатов по содержанию бычьего сывороточного альбумина не превышает 1,5%, -лактальбумина - 11%, молочных белков, главным образом -лактоглобулина - 85%.

Антиоксидантную емкость ретентата и гидролизатов белков молочной сыворотки определяли спектрофотометрическим методом TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) по отношению к катион-радикалу АБТС (диаммонийная соль 2-азинобис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)) и спектрофлуориметрическим методом ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) по отношению к пероксильному радикалу. Антиоксидантную емкость выражали концентрацией эквивалентов водорастворимого аналога витамина E - тролокса. Результаты определения антиоксидантной емкости в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 2. Показано, что в процессе ферментативного гидролиза антиоксидантная емкость гидролизатов увеличивалась в 1,8-2,0 раза по отношению к катион-радикалу АБТС и в 1,08-1,57 раза по отношению к пероксильному радикалу, что обусловлено образованием антиоксидантных пептидов и снятием стерических барьеров для взаимодействия остатков редокс-активных аминокислот с радикалами за счет разрушения третичной структуры белков молочной сыворотки. При этом увеличение дозы ферментного препарата «Protamex» с 2,5 до 4,0% от белка в ретентате приводит к увеличению антиоксидантной емкости получаемого гидролизата на 15-39% в зависимости от типа радикала (таблица 2).

Гипотензивную активность ретентата и гидролизатов белков молочной сыворотки определяли спектрофлуориметрическим методом по их способности ингибировать ангиотензин-1-превращающий фермент (АПФ), являющийся ключевым звеном реннин-ангиотензин-альдостероновой системы регуляции артериального давления. Для определения АПФ-ингибирующей активности гидролизатов и ретентата использовали субстрат с внутренним тушением флуоресценции трифторацетат o-аминобензоил-фенилаланил-аргинил-лизил(динитрофенил)-пролина. За величину гипотензивной активности принимали концентрацию гидролизатов и ретентата (мл/л), при которой наблюдалось 50% ингибирование активности АПФ. Результаты определения гипотензивной активности в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 2. Показано, что в процессе ферментативного гидролиза гипотензивная активность гидролизатов увеличивалась в 3,7-5,3 раза, что обусловлено образованием АПФ-ингибирующих пептидов. При этом увеличение дозы ферментного препарата «Protamex» с 2,5 до 4,0% от белка в ретентате приводит к увеличению гипотензивной активности получаемого гидролизата на 16% (таблица 2).

Идентификацию пептидов, присутствующих в гидролизатах молочной сыворотки, проводили путем их фракционирования методом препаративной гель-проникающей хроматографии с последующим хроматографическим анализом полученных фракций методом обращено-фазовой хроматографии с детекцией методом масс-спектрометрии ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-ICR-MS) и автоматическим поиском по базе данных белковых последовательностей UniProt KB_SwisProt sprot_v.57.9. В гидролизатах из белков молочной сыворотки идентифицировано 199 пептидов размером от 5 до 25 аминокислотных остатков (таблица 3), для которых основными белками предшественниками являлись бычий сывороточный альбумин, -лактоглобулин, казеины. Среди идентифицированных пептидов 86 содержат остатки редокс-активных аминокислот (тирозина, триптофана, метионина, цистеина и гистидина), ответственных за антиоксидантные свойства соответствующих пептидов. Анализ последовательностей идентифицированных пептидов с помощью базы данных BioPep позволил установить наличие в составе пептидных композиций 2 пептидов VKEAMAPK и ЕАМАРК из -казеина, обладающих антиоксидантной активностью, и 3 пептидов ALKAWSVAR (бычий сывороточный альбумин), AMKPWIQPK ( s₂-казеин) SAPLR (белок, взаимодействующий с белком, подобным фактору 6 АДФ-рибозилирования), обладающих АПФ-ингибирующей активностью.

Качественные преимущества получаемых гидролизатов заключаются в следующем:

- в пониженной антигенности за счет сниженного содержания аллергенов молочной сыворотки - -лактальбумина, -лактоглобулина, бычьего сывороточного альбумина;

- в наличии антиоксидантных и гипотензивных свойств;

- в привлекательных органолептических характеристиках, нейтральном вкусе без привкуса горечи;

- возможности использования при производстве функциональных пищевых продуктов массового спроса.

Благодаря этому гидролизаты в качестве белковых компонентов могут быть использованы для получения функциональных продуктов для профилактического питания детей и взрослых, предрасположенных к пищевой аллергии и непереносимости белков коровьего молока;

Способ получения пептидных композиций из белков молочной сыворотки осуществляется следующим образом.

Сухой концентрат сывороточных белков (КСБ) растворяют при постоянном перемешивании в питьевой воде с температурой (40-45)°C, охлаждают и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 минут. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, охлаждают и подают на ферментативный гидролиз.

Сухую молочную сыворотку растворяют при постоянном перемешивании в питьевой воде с температурой (40-45)°C, охлаждают и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 минут. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, охлаждают и подают на ультрафильтрацию.

Сыворотку подсырную нативную очищают, сепарируют на сепараторах-сливкоотделителях для обезжиривания, пастеризуют при температуре от 75 до 85°C с выдержкой 20-30 с, охлаждают и подают на ультрафильтрацию.

Раствор сывороточных белков разделяют на ультрафильтрационной установке с пропускной способностью мембран от 1 до 5 кДа, трансмембранном давлении 0,2-0,4 атм на ретентат (массовая доля сухих веществ 8-11% и фильтрат.

Ретентат или раствор КСБ подогревают до температуры 50-55°C, pH раствора доводят до 7,0-7,2 добавлением необходимого количества 20% водного раствора гидроксида натрия, псосле чего в реакционную смесь вносят ферментный препарат «Protamex» в дозировке 2,5-4,0% от количества белка в реакционной смеси.

Ферментативный гидролиз раствора сывороточных белков ведут с использованием ферментного препарата «Protamex» при температуре 50-55°C в течение 1,5 часов.

По окончании ферментации гидролизаты пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 минут с последующим охлаждением до температуры 30±2°C. Полученные жидкие гидролизаты фасуют и направляют на хранение.

Следующие примеры иллюстрируют способ получения пептидных композиций из белков молочной сыворотки.

Пример 1

65 кг сухой сыворотки растворяют при перемешивании в питьевой воде (935 кг) с температурой 40°C до образования раствора с массовой долей сухих веществ (белок, жир, лактоза, соли) от 7%, охлаждают до 4°C и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 мин. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, затем охлаждают до температуры 40°C и подают на концентрирование на мембранах с пропускной способностью от 1 до 5 кДа. Используют полисульфоновые мембраны UF DHT 20-6338/30FF.

По окончании ультрафильтрации полученный ретентат с массовой долей сухих веществ 9% направляют на ферментативный гидролиз.

Ретентат подогревают до температуры 52-54°C, доводят его pH до 7,1 добавлением 3,2 л 20% раствора гидроксида натрия, после чего в реакционную смесь вносят 687.5 г ферментного препарата «Protamex» (2,5% от количества белка в реакционной смеси).

Ферментативный гидролиз ретентата ведут при температуре 52-54°C в течение 1,5 часов.

Гидролизаты пастеризуют при температуре 82-84°C в течение 10 минут с последующим охлаждением до температуры 30°C.

Получают 167 л пептидной композиции из белков молочной сыворотки с массовой долей сухих веществ 10,6%, массовой долей общего азота 0,43%, общим содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты 3,44±0,23 мг/мл, степенью гидролиза 4,91±0,26%, остаточной антигенностью по содержанию -лактальбумина 4,6%, бычьего сывороточного альбумина 0,6%, -лактоглобулина 72,1%, обладающей антиоксидантной и гипотензивной активностью (таблица 2).

Пример 2

Процесс проводят аналогично примеру 1. Отличается тем, что в реакционную смесь вносят 1100 г ферментного препарата «Protamex» (4,0% от количества белка в реакционной смеси).

Получают 160 л пептидной композиции из белков молочной сыворотки с массовой долей сухих веществ 9,9%, массовой долей общего азота 0,44%, общим содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты 3,78±0,25 мг/мл, степенью гидролиза 5,37±0,30%, остаточной антигенностью по содержанию -лактальбумина 10,8%, бычьего сывороточного альбумина 1,3%, -лактоглобулина 84,8%, обладающей антиоксидантной и гипотензивной активностью (таблица 2).

Таблица 1
Содержание белков-алергенов и остаточная аллергенность ретентатов и гидролизатов белков молочной сыворотки
Образец	C(молочного белка - s1-, s2-, -, к-казеины и -лактоглобулин), мг/мл, при иммуноанализе набором Ridascreen Fast Milk (R-Biopharm, Германия)	Остаточная антигенность, %	C( -лактальбумина), мг/мл, при иммуноанализе набором E91018Bo (Life Science Inc., США)	Остаточная антигенность, %	C(бычьего сывороточного альбумина), мг/мл при иммуноанализе набором Bovine serum albumin (BSA) assay (Cygnus technologies Inc., США)	Остаточная нтигенность, %
Получение пептидной композиции при E/S=2,5%
УФ-ретентат молочной сыворотки	53,07±8,87	100,00	1,21±0,18	100,00	0,96±0,10	100,00
Гидролизат молочной сыворотки	38,24±7,60	72,06	0,055±0,001	4,55	0,006±0,002	0,63
Получение пептидной композиции при E/S=4,0%
УФ-ретентат молочной сыворотки	53,42±7,78	100,00	0,87±0,13	100,00	0,98±0,07	100,00
Гидролизат молочной сыворотки	45,32±1,72	84,84	0,094±0,006	10,80	0,013±0,003	1,33

Таблица 2
Антиоксидантная емкость (мМ эквивалентов тролокса) и гипотензивная активность (IC50 мл/л) ретентатов и гидролизатов белков молочной сыворотки
Образец	Антиоксидантная емкость		Гипотензивная активность (IC50)
	TEAC	ORAC
Получение пептидной композиции при E/S=2,5%
УФ-ретентат молочной сыворотки	4,31±0,18	2,83±0,18	321,8
Гидролизат молочной сыворотки	7,77±0,19	3,07±0,19	86,8
Получение пептидной композиции при E/S=4,0%
УФ-ретентат молочной сыворотки	4,47±0,15	2,72±0,14	395,0
Гидролизат молочной сыворотки E/S=4,0%	8,95±0,23	4,27±0,14	74,4

Таблица 3
Пептидный профиль гидролизатов белков молочной сыворотки
Белок-предшественник Bos taurus	Последовательность пептида	Молекулярная масса, Да
Acetyl-CoA carboxylase 1	LIAEK	572,3533
Sodium- and chloride-dependent glycine transporter	ILEAK	572,3533
WDR12	LLEAK	572,3533
CE290	D1LQK	615,3592
Ras GTPase-activating protein 3	VFQSVK	706,4014
Beta-catenin-like protein 1	LLNKFTENDSEK	1436,715
Serum albumin	DTHKSEIAHR	1192,595
K2CA	LQDLK	615,3592
Structural maintenance of chromosomes protein 1A	QESSR	605,2769
MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein	LLKCHFIPPEK	1323,737
Nuclear migration protein nudC	INPENSK	800,4028
Adenylate cyclase type 1	LLNELFGK	932,5331

UPF0490 protein Clorf201 homolog	AGFVSK	607,333
Complement C3	ADALVGK	672,3806
Protein KRI1 homolog	KEILAK	700,4483
Thyroglobulin	GQEIPGTR	856,4403
Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM50	QMIIEPTSPCLLPDPLR	1922,001
Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (Fragments)	XKNLLLNHMDVLK	1564,876
Endoplasmic reticulum protein ERp29	LIEKNK	743,4541
Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase	SRAAVGNK	801,4457
Alpha-S2-casein	ISQRYQK	921,5032
Cytochrome с oxidase subunit 8B, mitochondrial	GWAVPK	656,3646
DnaJ homolog subfamily С member 14	EPKSAR	686,3711
Rho guanine nucleotide exchange factor 10-like protein	LMRVK	661,3945
Pyruvate carboxylase, mitochondrial	DTQAMK	692,3163
Selenium-binding protein 1	VIQVPPK	779,4905
Palmitoyl-protein thioesterase 1	KMVEKK	777,4418
Rab GTPase-binding effector protein 2	ASLPR	542,3176
Rho GDP-dissociation inhibitor 3	EIVSGLK	744,4381
ERP27	LVDNK	587,3279
Beta-2-microglobulin	IVKWDRDL	1043,576
Serum albumin	ALKAWSVAR	1000,582
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1	LGREAASR	858,4671
Mitochondrial Rho GTPase 1	IDLQK	615,3592
Serum albumin	YTRKVPQVSTPTLVEVSR	2059,143
STMN1	EVLQK	615,3592
Interleukin-12 subunit alpha	LLMDPK	715,3938
Beta-casein	VKEAMAPK	872,4789
Aconitate hydratase, mitochondrial	NINIVRKR	1011,63
Seizure protein 6 homolog	LISSPK	643,3905
GLNA	KDPNK	600,3231
UPF0407 protein C2orf39 homolog	FDEITVKWEEGK	1479,725
Hexokinase-1	GESAIS	562,2598
JSPR1	EPVSK	558,3013

Peroxisome assembly protein 12 OS=Bos taurus GN=PEX12 PE=2 SV=1	LAGVR	514,3227
ACTN4	EAMLK	590,3098
Protein THEMIS	ILASEIR	800,4756
Myosin-2	VKQKLEK	871,5491
PAF	VVASR	530,3176
ADP-ribosylation factor-like protein 6-interacting protein 6	SAPLR	542,3176
Fibrinogen gamma-B chain	KTTMK	607,3363
Probable carboxypeptidase PM20D1	DGFIYGRGTLDNK	1454,715
Twinfilin-1	QLNYVQLEIDIK	1474,803
60S ribosomal protein L9	GTVQQADE	846,3719
Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1B	QEVIK	615,3592
Vacuolar protein-sorting-associated protein 36	LLLAEK	685,4374
N-terminal kinase-like protein	GPMKLGTR	858,4745
TM223	ALQSLSARR	1000,578
Serum albumin	SLGKVGTR	816,4818
Serum albumin	AEFVEVTK	921,4807
Serum albumin	AEFVEVTKLVTDLTK	1691,935
Serum albumin	LSQKFPKAEFVEVTK	1749,967
ZNHI1	RVLDR	657,3922
Transmembrane protein 131-like	QILSITK	801,496
Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein homolog (Fragment)	AGKHQR	695,3827
Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats protein	DLLQK	615,3592
UPF0453 protein C12orf44 homolog	VGEKLCEK	904,4688
Glucosamine-fructoses-phosphate aminotransferase [isomerizing] 2	NIENVK	715,3864
Tax 1-binding protein 1 homolog	EIADKTEK	932,4814
Allergen Bos d 2	DKIVEGGPLR	1082,608
DCE1	ANFFR	653,3285
Beta-lactoglobulin	LSFNPTQLEEQCHI	1657,777
Alpha-S2-casein	LTEEEKNR	1017,509
Uncharacterized protein KIAA1539 homolog	KGYSVPK	777,4385
WDR12	MPLFK	650,3462
Uncharacterized potential	VYEDSGIPLPADSPK	1586,783

DNA-binding protein C17orf49 homolog
MYB	TPAIK	528,3271
WD repeat-containing protein 92	DISMNK	706,332
DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunitRPABCl	QSLVDMAPK	1003,501
LIGA	QLDIK	615,3592
Protein ariadne-1 homolog	VQDKYR	807,4239
Lethal(3)malignant brain tumor-like 2 protein	GYLMK	626,3098
Complement C4 (Fragments)	VLREDSR	873,4668
Protein FAM92A1	MKRDDLK	904,48
RNA-binding protein 5	EGSGLGRK	802,4297
Complement factor B	VGSQYR	708,3555
MARCKS-related protein	MGSQSSKAPR	1047,513
Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A	KLENLK	743,4541
Semaphorin-3C	ICPNDTGGLR	1101,524
cGMP-dependent 3',5'-cyclic phosphodiesterase	MLDLMR	809,3775
Alpha-1-syntrophin	MPILISK	816,4779
LysM and putative peptidoglycan-binding domain-containing protein 2	LDLQIK	728,4432
Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1-like 1	VDGSVRGEER	1102,537
Leucine-rich repeat-containing protein 41	KSEAK	561.3122
RAB6-interacting golgin	TQAETMKLK	1048,559
COX assembly mitochondrial protein homolog	TGIPTK	615,3592
Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1	AVNQDK	673,3395
XPO2	LLAVSK	633,4197
Sodium-driven chloride bicarbonate exchanger	EYGLSYLSLR	1201,623
Serum albumin	DAFLGSFLYEYSR	1566,735
TT23L	ASPIR	542,3176
Coiled-coil domain-containing protein 104	KDMKIK	761,4469
	GTPIR	542,3176
E3 SUMO-protein ligase RanBP2 (Fragment) OS=Bos taurus GN=RANBP2 PE=2 SV=2	LVDTGR	659.3602

SDF2	EQVLK	615,3592
Flotillin-2	LKAEAYQK	949,5232
Myosin-Ic	SELSDK	677,3232
Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1	LPLSILKEK	1039,664
Cathelicidin-1	AVDQLNEQSSEPNIYR	1861,881
Alpha-1B-glycoprotein	VLSPAGPEAQFELR	1512,794
Alpha-1B-glycoprotein	SLLSELSDPVELRVAGS	1770,936
Ubiquitin-like domain-containing CTD phosphatase 1	DKELLK	744,4381
ERP27	QLDLK	615,3592
Leucine zipper putative tumor suppressor 2	LIPVSGKLEK	1082,67
RNA-binding protein 5	AAERREK	858,4671
Folate receptor alpha	FYAENPTSGSTPQGI	1567,715
Zinc-alpha-2-glycoprotein	RKWEAEAVYVQR	1533,805
Zinc-alpha-2-glycoprotein	SLTRPLTVPWDPRQQAE	1993,038
Zinc-alpha-2-glycoprotein	AEPLAPWSQVEGMEDWEKESALQR	2785,302
Zinc-alpha-2-glycoprotein	RAEPLAPWSQVEGMEDWEKESALQR	2941,403
1 -phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-4 (Fragment)	IVAQYDK	835,444
Phosphatidylcholine transfer protein	SGVIRVK	757,481
Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1	SLFSHAFEVVKT	1363,714
LETM1 domain-containing protein 1	ALQMKALCR	1048,552
Polymeric immunoglobulin receptor	AQDFQGR	820,3828
Polymeric immunoglobulin receptor	KAQDFQGR	948,4777
Serum albumin	IETMREK	905,464
Serum albumin	FKDLGEEHFK	1248,614
Serum albumin	LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTK	2520,42
Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-11	GSCIIS	578,2734
Dynamin-l-like protein	KEAADMLK	920,4637
UPF0609 protein C4orf27 homolog	MVGGGAKR	790,412
Alpha-1-acid glycoprotein	HAEDKLITR	1081,588
Monoacylglycerol lipase ABHD6	ELQESAAVEK	1102,551
KTEL motif-containing protein 1	MMAEVVRR	990,5103
Calcium-transporting ATPase type 2C member 1	YLSMLR	797,4105

Drebrin-like protein SV=1	LKSPFLQK	959,5804
Uncharacterized protein C14orf38 homolog	KVKQELK	871,5491
Zinc-alpha-2-glycoprotein	KWEAEAVYVQR	1377,704
Beta-casein	INKKIEK	871,5491
GA-binding protein subunit beta-2	DMLKMTALHWATEHHHRDVVELLIK	3022,563
Aldehyde dehydrogenase family 3 member B1	IVMTAAAK	819,4524
Ropporin-1	ERSERVALSNWAELTPELLK	2340,244
Alpha-Si-casein	EKVNELSK	945,5131
RL10A	KLNKNKK	871,5603
Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1	SSRQPQSQNPK	1255,627
Nicotinate phosphoribosyltransferase	LIAGPDK	712,4119
CDKN2AIP N-terminal-like protein	MVGGEAAAAVEELISGVR	1757,898
28S ribosomal protein S34, mitochondrial	LIAELARRVR	1195,751
Dynein intermediate chain 1, axonemal	LLNLVREVK	1082,681
Protein kintoun	QMLDATALEAVEK	1417,712
39S ribosomal protein L47, mitochondrial	MAAASLAVFCR	1138,563
Brain acid soluble protein 1	DAQDTTKPEDK	1246,568
Histone-binding protein RBBP7	EGKIVDAK	858,4811
Nuclear factor 1B-type	GIPLESTDGER	1172,567
Beta-casein	EAMAPK	645,3156
3-oxoacyl-[acy1-carrier-protein] synthase, mitochondrial	VSPFFVPK	919,5168
Transforming growth factor-beta receptor-associated protein 1	RNIPK	626,3864
NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 3, mitochondrial	QSPPK	555,3017
UPF0534 protein C4orf43 homolog	LNLIGEK	785,4647
F-actin-capping protein subunit beta	DIVNGLR	785,4395
Melanocyte-stimulating hormone receptor	MPALGSQRR	1014,539
Protein argonaute-2	VKFTK	621,385
S-adenosylmethionine synthetase isoform type-1	RSGQLPWLQPDSK	1510,789
Zinc finger CCHC domain-containing protein 12	TSIIARMSNSR	1250,64

COQ5	LLSQEK	716,4068
Uroplakin-3-like protein	FLVMSDR	866,432
Folliculin	FTKVDSRPKEDTQK	1677,869
Trichohyalin-like protein 1	QLPTKK	713,4436
Protein FAM92B	LKDIQK	743,4541
UDP-glucose 6-dehydrogenase	IAILGFAFK	978,5902
Transmembrane and coiled-coil domain-containing protein C6orf 129 homolog	RSLEKEKSSLMNK	1564,824
General transcription factor II-I	ALQSPKRPR	1051,625
Kinetochore protein Spc25	KENLLK	743,4541
Coiled-coil domain-containing protein 105	HSWVNISR	997,5094
Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-2	AQDILAR	785,4395
GNAT2	EAKTVK	674,3963
Alpha-S2-casein	AMKPWIQPK	1097,606
Electron transfer flavoprotein subunit beta	LAEKEK	716,4068
ASAP1	KPFDK	633,3486
Fibroblast growth factor 5	LHASAK	625,3547
Sterol-4-alpha-carboxylate 3-dehydrogenase, decarboxylating	MKFMIGNGK	1040,515
CO038	KFDPK	633,3486
SELT	YPDIR	662,3388
Galactose-3-O-sulfotransferase 3	LQQATK	687,3915
Factor Xlla inhibitor	VYDPKG	677,3384
Zinc finger protein 350	SPQSSVVLQEK	1200,635
SUCB1	LQGTR	573,3235
GMFB	VFEIR	662,3752
Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2	QVLLR	627,4068
Nucleotide exchange factor SIL1	LQQYR	706,3762
DNA nucleotidylexotransferase	KMGTTR	708,3589
Heat shock factor-binding protein 1	IDDMSSR	822,3542
Dynamin-1	DEMLR	678,3007
LisH domain-containing protein ARMC9	SMTYLK	741,3731
Uncharacterized protein KIAA1462 homolog	LDGAVPAPDPR	1106,572
DnaJ homolog subfamily C	NEFYK	699,3228

member 27
Calcyclin-binding protein	MQQKSQRK	1048,545
Leucine-rich repeat-containing protein 28	HKNLFLNYR	1203,651