способ диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом

Формула изобретения

Способ диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом, включающий исследование венозной крови, отличающийся тем, что определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14^bright CD16^-HLA-DR⁺ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14^bright методом многоцветной проточной цитометрии и при его значении более 68,8% диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, педиатрии и детской хирургии, и может быть использовано для диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом.

Вторичная иммунная недостаточность (ВИН) - это нарушение иммунной системы, которое развивается в позднем постнатальном периоде или у взрослых и не является результатом генетического дефекта. ВИН клинически проявляется часто рецидивирующими или хроническими бактериальными, грибковыми, вирусными инфекциями бронхолегочного аппарата, придаточных пазух носа, урогенитального тракта, глаз, кожи, мягких тканей, вызванных оппортунистическими и условно-патогенными микроорганизмами. Для ВИН характерен недостаточный ответ на адекватно проводимую терапию и другие традиционные методы лечения. Для спонтанной формы ВИН характерно отсутствие видимой причины, вызвавшей нарушение и/или недостаточность защитной функции иммунной системы. Наиболее трудными для диагностики являются спонтанные формы ВИН, протекающие без явных изменений базовых показателей иммунной системы (Сетдикова Н.Х., Латышева Т.В., Пинегин Б.В., Ильина Н.И.. Иммунодефициты: принципы диагностики и лечения. ФАРМАРУС ПРИНТ Москва - 2006, 20 с.).

Первичный перитонит (Primary peritonitis) - острое воспаление брюшины при отсутствии источников воспаления в брюшной полости. Распространенность первичного перитонита (ПП) в настоящее время составляет от 1 до 4% всех случаев острого живота, потребовавших хирургического вмешательства. Причины возникновения ПП не известны. Развитие ПП наиболее вероятно при наличии очагов хронической инфекции, частых заболеваниях верхних дыхательных путей, органов мочевыделительной и половой систем, острой кишечной инфекции и сенсибилизации организма. По нашим данным примерно за месяц до возникновения ПП дети переносят острое хроническое заболевание или его обострение. Наиболее часто ПП выявляют у девочек в возрасте от 5 до 10 лет. Признаки ПП развиваются стремительно за несколько часов на фоне здоровья - у ребенка появляются классические признаки перитонита (лихорадка, боль в животе, симптомы раздражения брюшины). На современном этапе наиболее объективным и точным методом диагностики и дифференциальной диагностики ПП является лапароскопия. Хирургическое вмешательство проводят в ближайшие 10 часов от начала заболевания, объем вмешательства заключается в ревизии брюшной полости и ее санации от воспалительного выпота. После операции пациенты получают антибиотикотерапию, на фоне которой происходит быстрое выздоровление, чаще всего без осложнений. Однако пациентам с ПП необходимо тщательное обследование для выявления хронических очагов инфекции и заболеваний, предрасполагающих к воспалению, в частности, пузырно-мочеточниково-лоханочный рефлюкс. В послеоперационном периоде при длительном наблюдении у большей части детей выявляют боли в животе, частые инфекции верхних дыхательных путей, инфекции мочевыводящих путей, т.е. сохранение жалоб, которые были до операции, что означает неэффективность проведенного хирургического вмешательства и сохранение основного патогенетического пускового механизма развития воспаления брюшины.

Отсутствие единства в трактовке причин возникновения ПП ставит перед исследователями актуальную задачу выявления особенностей иммунного ответа у детей, перенесших ПП.

Известен способ диагностики состояния иммунной системы у детей с ПП, который стандартно и широко выполняют в практике хирургических стационаров до и после операции: у всех пациентов с перитонитом, как первичным, так и другой этиологии, оценивают показатели клинического анализа крови. В подавляющем большинстве случаев выявляют лейкоцитоз в пределах 15000-20000×10 ⁹/л, за счет нейтрофилов и сдвигом формулы влево (Баиров Г.А. "Срочная хирургия детей", СПб: Питер, 1997. - 464 с., С.-333).

Первыми лабораторными критериями, позволяющими заподозрить у больного иммунодефицитное состояние, являются содержание лейкоцитов, в частности, лимфоцитов и нейтрофилов и концентрация общего белка и его фракций. При более углубленном исследовании состояния иммунной системы оценивают содержание иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgA, IgM); компоненты комплемента, субпопуляционный состав лимфоцитов.

Методически для формализации проведения оценки состояния иммунной системы диагностические исследования могут быть условно разделены на тесты 1-го и 2-го уровней (Сетдикова Н.Х., Латышева Т.В., Пинегин Б.В., Ильина Н.И.. Иммунодефициты: принципы диагностики и лечения. ФАРМАРУС ПРИНТ Москва - 2006, 20 с.). Тесты 1-го уровня - ориентировочные и направлены на выявление грубых дефектов иммунной системы; тесты 2-го уровня - функциональные и направлены на идентификацию конкретной патологии иммунной системы. Тесты 1-го уровня включают оценку:

A) фагоцитарного звена: абсолютное содержание нейтрофилов и моноцитов, их фагоцитарная и окислительная активность интенсивности поглощения микробов нейтрофилами и моноцитами (индекс фагоцитоза 2,3-3,0);

Б) системы гуморального иммунитета: концентрация иммуноглобулинов G, А, М, Е и абсолютное и относительное содержание В-лимфоцитов (по маркерам CD 19 и/или CD20) в периферической крови;

B) клеточного иммунитета: абсолютное и относительное содержание лимфоцитов, зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и их основных субпопуляций и пролиферативного ответа на действие митогенов: фитогемагглютинина и конканавалина А.

Совокупность тестов 1-го уровня, применяемая для оценки функционирования основных компонентов иммунной системы, принята авторами за прототип.

Недостатком прототипа является отсутствие оценки субпопуляционного состава моноцитов и невозможность выявления особенности иммунного ответа у детей с первичным перитонитом.

Техническим результатом изобретения является создание способа диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей (преимущественно девочек от 5 до 10 лет) с первичным перитонитом, обладающего высокой точностью и специфичностью, позволяющего выявить особенность иммунного ответа и предупредить возникновение рецидива.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом, включающем исследование венозной крови, согласно изобретению определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14^bright CD16 ^-HLA-DR⁺ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14^bright методом многоцветной проточной цитометрии и при его значении более 68,8% диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности.

Впервые детям с первичным перитонитом проведено иммунологическое обследование, оценена особенность иммунного ответа путем оценки субпопуляций моноцитов.

В иммунологическое обследование были включены 53 ребенка в возрасте от 3 до 13 лет, составивших четыре группы:

1 группа (n=13, девочки) - больные ПП через 4-20 дней после операции с клинически подтвержденными хроническими, рецидивирующими инфекциями, что позволило заподозрить спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности;

2 группа (n=14, соотношение мальчики: девочки = 8:6) - пациенты с вторичным перитонитом (гангренозно-перфоративный аппендицит, перитонит, аппендикулярный перитонит, АП) через 5-9 дней после операции, без хронических, рецидивирующих инфекций, что позволило клинически исключить спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности;

3 группа (n=15, соотношение мальчики: девочки = 7:8) - пациенты, не подвергавшиеся хирургическому вмешательству, без признаков воспаления, поступившие для планового оперативного лечения;

4 группа (девочки, n=11) - пациенты с первичным перитонитом через 180-1095 дней (3 месяца - 3,5 года) после операции с клинически подтвержденными хроническими, рецидивирующими инфекциями, что позволяет заподозрить спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности.

Оценку состояния иммунной системы пациентов с первичным перитонитом (1 группа) проводили в сравнении со 2, 3, 4 группами сопоставления:

2 группа - для сопоставления параметров состояния иммунной системы у пациентов с вторичным перитонитом, обусловленным наличием четкого очага воспаления в брюшной полости, то есть перитонитом другой этиологии, в краткосрочном послеоперационном периоде;

3 группа - для сопоставления параметров состояния иммунной системы детей без признаков воспаления и с отсутствием хронических заболеваний инфекционно-воспалительной природы в анамнезе;

4 группа - для сопоставления состояния иммунной системы пациентов ПП в краткосрочном и долгосрочном послеоперационном периодах.

Все пациентки 1 и 4 групп, оперированные с послеоперационным диагнозом первичный перитонит, из социально благополучных семей, желанные, любимые и ухоженные дети. В большинстве случаев родители девочек безуспешно пытаются справиться с их частыми воспалительными заболеваниями.

После получения информированного согласия родителей детей был проведен комплекс исследований образцов периферической крови:

1. Клинический анализ крови (гематологический анализатор UniCel D×H 800 Beckman Coulter) с определением показателей красной крови, а также содержание лейкоцитов, в том числе нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов;

2. Развернутый анализ клеточного состава крови по протоколу Hematoflow с определением относительного и абсоютного содержания Т-лимфоцитов и НК клеток в зависимости от экспрессии маркера CD 16; В-лимфоцитов, незрелых гранулоцитов; моноцитов в зависимости от экспрессии маркера CD 16;

3. Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов, включая относительное и абсолютное содержание Т-лимфоцитов и их субпопуляций (Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов), В-лимфоцитов, НК и Т-НК клеток, активированных и неактивированных лимфоцитов;

4. Анализ субпопуляционного состава моноцитов, включая определение относительного содержания (от CD 14 bnght моноцитов) CD16+и CD 16" моноцитов в зависимости от экспрессии HLA-DR.

5. Параметры гуморального иммунитета, включая уровень иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgA и IgG), компоненты комплемента C3 и C4, антистрептолизин и ревматоидный фактор были оценены методом кинетической нефелометрии (Immage 800, Beckman Coulter), а также оценен уровень циркулирующих иммунных комплексов и антистрептокиназы;

6. Оценка функциональной активности клеток включала:

а) определение фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием частиц латекса и учетом результатов исследования с применением световой микроскопии;

б) определение способности клеток к хемотаксису проведено с помощью реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с фитогемагглютинином (ФГА).

Было проведено исследование информативности полученных показателей с точки зрения различения 4-х групп пациентов с использованием программы Statistica 6.0. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. В случае выявления значимых различий было проведено попарное сравнение групп с помощью критерия множественных сравнений Шеффе.

Наиболее высокий уровень статистически значимых различий 1 группы (ПП) от 2 и 3 групп выявлен по показателям, описывающим классические активированные моноциты CD14^bright CD16^-HLA-DR⁺: относительное содержание указанных клеток от всех моноцитов (CD14^bright), F=6,42; р=0,01 (табл.).

Для определения чувствительности и специфичности описываемого способа использован ROC-анализ, проведенный с помощью MedCalc Software. Способ обладает высокой чувствительностью - 72,7% и специфичностью - 93,3%.

Специфичность способа заключается в том, что повышение относительного содержания активированных классических моноцитов показывает высокую вероятность неадекватного иммунного ответа на патогены.

Чувствительность способа заключается в том, что у детей 3-13 лет с хроническими часто рецидивирующими заболеваниями высока вероятность повышенного относительного содержания активированных классических моноцитов, что является иммунологическим признаком спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности и может быть предрасполагающим фактором к развитию первичного перитонита.

В таблице представлена сравнительная характеристика содержания классических активированных моноцитов у пациентов 1-4 групп.

Показатель	Группы				Отличия групп, F=6,42; р=0,01
	1 n=13	2 n=14	3 n=15	4 n=11
Классические активированные моноциты, относительное количество (CD16-DR+, % от общего количества CD14bright моноцитов)	80,8±14,3	51,7±26,9	43,3±1 9,3	51,1±27,5	1 vs 2; 1 vs 3

Как видно из таблицы, при первичном перитоните происходит повышение относительного содержания классических активированных CD14^brightCD16 ^- HLA-DR⁺ моноцитов и соответственно значительно уменьшается относительное содержание классических неактивированных CD14brightCD16-HLA-DR- моноцитов.

Таким образом, при первичном перитоните можно говорить об изменении соотношения субпопуляций моноцитов относительно пациентов с выраженным гнойным воспалением (аппендикулярный перитонит, 2 группа) и здоровых детей (3 группа) и о спонтанной форме вторичной иммунной недостаточности по отношению именно к этому виду моноцитов.

HLA-DR - белок, принадлежащий к молекулам гистосовместимости II класса. Этот белок экспрессируется в основном на антиген-презентирующих клетках (АПК), таких как: моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки. Повышение экспрессии HLA-DR⁺ происходит при воспалительных процессах под действием цитокинов.

Проведенные исследования показали, что наиболее информативной для данного способа является оценка экспрессии HLA-DR⁺ на классических моноцитах (CD14^brightCD16^- ). При сравнительном анализе исследуемых групп пациентов было выявлено пороговое значение, равное 68,8%, моноцитов с фенотипом CD14^bright CD16^-HLA-DR⁺ относительно общего количества моноцитов с фенотипом CD14^bright , при котором выявляется спонтанная форма вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом.

Способ выполняют следующим образом.

Для определения относительного содержания активированных классических моноцитов (CD14brightCD16-HLA-DR+) венозной крови используют метод иммунофенотипирования на проточном цитометре.

Предварительно производят подготовку пробирки с пробой венозной крови. Для этого в пробирку вносят аликвоту периферической крови из пробирки с ЭДТА и реактивы: диагностические моноклональные антитела CD14-FITC, CD16-PE, CD45-ECD и HLADR-PC5. После перемешивания на вортексе образец инкубируют 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. После этого в пробирку добавляют необходимый объем лизирующего раствора в объемном соотношении 1:10 (кровь: лизирующий раствор). После перемешивания на вортексе образец инкубируют не менее 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Вторым этапом метода образцы анализируют на проточном цитофлуориметре. Получаемые данные представляют графически - на цитограммах и в числовом отражении - как относительное содержание популяций моноцитов. Таким образом, получают процентное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14^bright CD16^-HLA-DR⁺ относительно общего количества моноцитов с фенотипом CD14^bright. Если полученное значение превышает 68,8%, диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности.

Способ иллюстрируется следующим клиническим примером.

Пример. Пациентка А., 3 года. Поступила в стационар с подозрением на острый аппендицит, острый гастроэнтерит.

Анамнез заболевания: поступила через 5 часов от появления интенсивной постоянной боли в животе без четкой локализации, которая не иррадиировала и не уменьшалась от приема спазмолитиков. Также отмечалась тошнота, рвота 2 раза без патологических примесей, оформленный стул. Лихорадила максимально до 38°С.

Анамнез жизни: доношенная полновесная девочка родилась с весом 3100 г., оценкой по Апгар 7/8 баллов. Прививки по календарю. Состоит на диспансерном учете у офтальмолога с диагнозом гиперметропический астигматизм и у хирурга с диагнозом гемангиома передней брюшной стенки и спины.

Перенесенные заболевания (выписка из амбулаторной медицинской карты). Впервые заболела в 9 месяцев острым бронхитом. До 3х лет перенесла острый гастроэнтерит; ОРВИ (ринит, фарингит, трахеит) 9 раз, в одном случае осложнившийся риносинуситом, тубоотитом; инфекционно-аллергический конъюнктивит. С 3х лет ставились диагнозы: за 6 мес до операции крапивница (без положительного эффекта от приема антигистаминных препаратов), за 5 мес - вирусная экзантема, за 4 мес - аллергодерматит, за 2 мес ОРВИ, острый ринофарингит, за 1 мес - лакунарная ангина.

В стационаре через 15 часов после поступления выполнена операция - лапаротомия, доступ в правой подвздошной области поперечный. Выпот мутный, липкий в умеренном количестве. При ревизии брюшной полости и малого таза патологии не выявлено. Червеобразный отросток не изменен, однако из-за аппендэктомического доступа выполнено его удаление. Операционная рана ушита наглухо. Послеоперационный диагноз - первичный перитонит. Получала клафоран и амикацин в возрастной дозировке одним курсом, после - флагил ректально. Послеоперационный период без осложнений, лихорадила субфебрильно. Госпитализация в отделение реанимации не потребовалась. Девочка выписана из стационара на 8 сутки.

Бактериологическое обследование. В посеве выпота из брюшной полости - E.coli. В посеве из носа, зева S.aureus. Мазки из вульвы: лейкоциты 3-11 в поле зрения, эпителиальные клетки, плоский эпителий в умеренном количестве, слизь, флора отсутствует. Посев кала на дизентерийную группу и РИГА с кишечной группой отрицательные.

Лабораторное обследование. При поступлении клинический анализ крови: гемоглобин (Hb) 122 г/л, эритроциты (Er) 4* 1012/л, гематокрит (Ht) 34%, тромбоциты (Тц) 347* 1012/л, СОЭ 4 мм/час, лейкоциты 12*109/л: палочкоядерные 20%, сегментоядерные 68%, эозинофилы 1%, моноциты 3%, лимфоциты 8%.

Проведено иммунологическое обследование. На 4 сутки после операции по стабилизации состояния взята кровь из вены (в 10⁰⁰, натощак). Все показатели в норме.

Относительное от общего числа моноцитов (CD14⁺) содержание классических, HLA-DR позитивных моноцитов (CD14+CD16-HLA-DR+)=85,5%. Таким образом, в соответствии с предлагаемым способом у девочки выявлена спонтанная форма вторичной иммунной недостаточности.

Предлагаемый способ позволяет диагностировать спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности у детей, перенесших первичный перитонит, и принять своевременные меры для предупреждения рецидива. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью.