синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного рогатого скота и способ их применения

Классы МПК:C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-08-22
публикация патента:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы A у крупного рогатого скота и способ их применения. Предложенный способ включает проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами на район гена hyaD Pasteurella multocida, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции. Для постановки ПЦР используют ДНК, выделенную из патологического материала или бактериальных культур. ПЦР проводят в 1 раунд. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 218 п.н. Способ может быть использован в ветеринарной микробиологии для диагностики пастереллеза сельскохозяйственных животных. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.

синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153

Формула изобретения

1. Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота согласно изобретению имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:1 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 tgaaaggggcatcacaaggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , SEQ ID NO:2 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 cccaaggcatataagtcagggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 .

2. Способ идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А, включающий выделение ДНК из проб биоматериала или бактериальных культур и проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, отличающийся тем, что используют пару синтетических олигонуклеотидных праймеров по п.1, ПЦР проводят в 1 раунд, при получении фрагмента, соответствующего размеру 218 п.н., диагностируют штаммы и изоляты бактерии Pasteurella multocida серогруппы А.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностики пастереллеза сельскохозяйственных животных.

Pasteurella multocida - условно-патогенная грамотрицательная бактерия, являющаяся комменсальным обитателем поверхности слизистых оболочек верхних дыхательных путей животных и птиц, способная, при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды и/или вирусной инфекции, преодолевать защитные механизмы организма и вызывать тяжелые поражения легких.

На основании строения капсульного антигена все штаммы бактерии делятся на 5 серогрупп. Штаммы серогруппы А вызывают пневмонии у крупного рогатого скота, овец, а также пастереллез птиц и кроликов. Для штаммов этой серогруппы характерно наличие гиалуроновой кислоты в составе капсулы (Carter, G.R. Recommendations for a standard system of designating serotypes of Pasteurella multocida / G.R. Carter, M.M. Chengappa // American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 1981. P.37-42).

До настоящего времени основным способом типирования штаммов и изолятов Р. multocida серогруппы А в нашей стране является тест на выявление гиалуроновой кислоты в капсуле бактерии. Для этого изучаемую 18-часовую бульонную культуру Р. multocida высевают штрихом на чашку Петри с 1,5% агаром Хоттингера. Затем перпендикулярно ей высевают штрихом суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus, синтезирующую гиалорунидазу. Обе культуры должны пересекаться. Чашки с посевами инкубируют при 37°С в течение 18-24 часов. Штаммы Pasteurella multocida, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста S. aureus более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, считают синтезирующими гиалуроновую кислоту и относят к серогруппе А. Размер колоний штаммов и изолятов других серогрупп не изменяется (Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц. Утверждены Главным управлением ветеринарии министерства сельского хозяйства РФ № 22-7/82 от 20.08.1992 г.).

К недостаткам данного способа относятся необходимость получения чистой культуры Р. multocida и поддержания культуры S. aureus. Кроме этого, в процессе культивирования Р. multocida на питательных средах могут возникать спонтанные мутации, приводящие к появлению безкапсульных вариантов бактерии, что приводит к невозможности их типирования по данному способу.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ, основанный на выявлении фрагмента генов hyaC-hyaD, отвечающих за синтез гиалуроновой кислоты у сероварианта А Р. multocida в полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий, синтез 2 пар специфических олигонуклеотидных праймеров: RGPMA5 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 aatgtttgcgatagtccgttaga3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 и RGPMA6 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 atttggcgccatatcacagtc3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , RGPMANP1 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 gaagtcggcggaaacta3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 и RGPMANP2 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 agtcttttctttcgctttctg3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , амплификацию ДНК возбудителя в два раунда, специфическую идентификацию продукта ПЦР размером 374 п.н. с помощью электрофореза в 2% агарозном геле (Gautam R. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by PCR assay / R. Gautam, A.A. Kumar, V.P. Singh, Vijendra P. Singh, Т.К. Dutta, S.B. Shiva-chandra // Res.in Vet. Science. - 2004. - Vol.76. - P.179-185).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он разработан для идентификации штаммов и изолятов Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала, полученного от больных птиц, требует проведения ПЦР в два раунда, а в результате реакции синтезируется фрагмент размером 374 п.н. Чувствительность способа составляет 1,2×104 бактериальных клеток на пробу.

Задачей изобретения является разработка синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота и способа их применения.

Поставленная задача решается тем, что подобрана и синтезирована пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота, согласно изобретению имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:1 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 tgaaaggggcatcacaaggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , SEQ ID NO:2 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 cccaaggcatataagtcagggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 .

Задача решается также тем, что в способе идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота, включающем выделение ДНК из проб биоматериала или бактериальных культур и проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению используют пару олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO:1 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 tgaaaggggcatcacaaggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , SEQ ID NO:2 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 cccaaggcatataagtcagggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 , ПЦР проводят в 1 раунд, при получении фрагмента, соответствующего размеру 218 п.н., диагностируют штаммы и изоляты бактерии Pasteurella multocida серогруппы А.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Получение синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поиск новых синтетических олигонуклеотидных праймеров осуществляют на основе анализа полного генома штамма Pasteurella multocida «36950», представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе «Vector NTI Suite» с последовательностями геномов штаммов других серогрупп Р. multocida, представителей семейства Pasteurellaceae и Enterobacteriaceae, представленных в базе данных GenBank.

Окончательный выбор праймеров основывают на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и ДНК различных штаммов Pasteurella multocida серогруппы А, высокая температура отжига (GC- метод), большая длина консенсусов, отсутствие гетеродуплексов.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U. Концентрацию синтетических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, были выбраны синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома Pasteurella multocida участка гена hyaD, отвечающего за синтез гиалуронсинтетазы:

SEQ ID NO:1 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 tgaaaggggcatcacaaggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 ,

SEQ ID NO:2 - 5синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 cccaaggcatataagtcagggt 3синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 .

Пример 2. Способ выявления бактерии Pasteurella multocida серогруппы А с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в пробах патологического материала и культурах бактерий

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Подготовка проб патологического материала и бактериальных культур для исследования

Для исследования от павших или вынужденно убитых животных с признаками бронхопневмонии отбирают пробы внутренних органов (легких на границе нормального и измененного участка, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов) не позднее 3-5 часов после гибели животного.

Из полученных проб делают посев методом отпечатков на мясопептонный агар с добавлением 5% дефибрированной крови барана (кровяной мясопептонный агар). Инкубируют в термостате при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2.

Через 24±2 часа инкубации просматривают чашки Петри с агаром на наличие типичных для пастерелл колоний (прозрачных, диаметром до 3 мм, округлых с ровными краями, слизистой консистенции, серого цвета). Их этих колоний делают мазки на стекле и окрашивают их по Грамму для предварительного типирования. При обнаружении в мазке грамотрицательных кокобактерий, окрашенных биполярно, колонию отбирают для исследования в ПЦР.

Для этого отдельные колонии, не смешивая, снимают с поверхности агара, переносят в отдельные стерильные стеклянные пробирки, содержащие 200 мкл стерильной дистиллированной воды, перемешивают на вортексе. Взвесь бактерий разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 109 КОЕ/мл.

Пробы органов животных помещают в фарфоровые ступки, растирают с песком и разводят физиологическим раствором в соотношении 1/5-1/10, затем центрифугируют и надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.

Взвесь бактерий в концентрации 109 КОЕ/мл используют для выделения ДНК без подготовки.

Этап 3. Выделение ДНК из проб биоматериала или взвеси бактерий. Выделение ДНК проводят любым доступным способом, включающим лизис клеток, депротеинизацию лизата, осаждением ДНК из раствора, отмывку спиртами, высушивание и растворение ДНК в буферном растворе.

Этап 4. Амплификация участка ДНК Pasteurella multocida, кодирующего участок гена hyaD.

Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl2, 25 тМ KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, no 0,2 мкг каждого праймера, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл выделенной ДНК.

Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 10 сек, 55°С - 15 сек, 72°С - 20 сек - 35 циклов; 72°С - 5 мин.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0) по стандартной методике.

Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

Используют маркер молекулярного веса 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 218 нуклеотидную пару.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять штаммы и изоляты бактерий вида Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала от больных животных и бактериальных культурах.

Пример 3. Определение чувствительности, специфичности и эффективности ПЦР по заявленному способу и по способу, взятому за прототип

Для определения чувствительности метода по заявленному способу в сравнении с прототипом суточную культуру контрольного штамма Pasteurella multocida «W13Ф», выращенную на мясопептонном агаре с добавлением 5% дефибрированной крови барана, переносят в бактериологическую пробирку, содержащую 1000 мкл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора, разводят до концентрации 1011 КОЕ/мл, титруют методом 10-кратных разведении до разведения 101 КОЕ/мл, каждое разведение подвергают исследованию в ПЦР. Чувствительность разработанной ПЦР составляет 103 КОЕ/мл.

Результаты опытов по сравнению чувствительности реакции представлены в таблице 1.

Таблица 1
Концентрация Pasteurella multocida серогруппы А в пробе, КОЕ/мл Результаты ПЦР по заявленному способу Результаты ПЦР по способу, взятому за прототип
107+ +
106 ++
10 5++
104 ++
10 3+-
102 --

Результаты опытов по сравнению специфичности реакции представлены в таблице 2.

Таблица 2
БактерииРезультаты ПЦР по заявленному способуРезультаты ПЦР по способу, взятому за прототип
Pasteurella multocida серогруппа А (штамм «W130») ++
Pasteurella multocida серогруппа D (штамм Т80)- -
Pasteurella multocida серогруппа В (штамм 681)- -
Salmonella typhimurium--
E. coli- -
Примечание: «+» - положительный результат;
«-» - отрицательный результат.

Результаты опытов по сравнению эффективности реакции при исследовании патологического материала, полученного от больных телят, и культур бактерий, выделенных на искусственных питательных средах из органов телят, представлены в таблице 3.

Таблица 3
№ п/пИсследованные пробы КоличествоКоличество положительных проб по заявленному способу / % от исследованных Количество положительных проб по способу, взятому за прототип / % от исследованных
1 Легкое3030/100 25/83
2 Бронхиальные лимфатические узлы 3030/10020/67
3Средостенные лимфатические узлы30 30/10022/73
4Культура бактерий, выделенная из органов телят30/10030/100 30/100

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью (103 КОЕ/мл), специфичностью и эффективностью при выявлении участка гена hyaD бактерии Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала, полученного от больных телят, культурах бактерий, выделенных на искусственных питательных средах. Способ, принятый за прототип, обладает более низкой чувствительностью (104 КОЕ/мл) и на 17-33% менее эффективен при исследовании проб легких, бронхиальных и средостенных лимфоузлов от больных животных.

Пример 4. Сравнение эффективности типирования Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способу и по способу, взятому за аналог

Преимущества разработанного способа представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Штаммы и изоляты Pasteurella multocida Результаты типирования Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способуРезультаты типирования Pasteurella multocida серогруппы А по способу, взятому за аналог
Штамм W130 (серогруппа А) ++
Штамм Т80 (серогруппа В)- -
Штамм 681 (серогруппа D) --
Изолят Б37++
Изолят АГМ ++
Изолят СР++
Изолят Эвика/2012 +-
Изолят Ир+-
Примечание: «+» - положительный результат;
«-» - отрицательный результат.

Таблица 5
Вирус (штамм, изолят)Типирование Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способу Типирование Pasteurella multocida серогруппы А по способу, взятому за аналог
Время исследования одной пробы биоматериала4 часа 10 суток
Себестоимость исследования одной пробы (руб.):синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153 синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов   и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного   рогатого скота и способ их применения, патент № 2527153
Трудозатраты (чел.). 23
Оплата труда сотрудников500 2750
Стоимость реактивов и питательных сред60120
Прочие расходы 200500
Необходимость получения чистой культуры НеобязательноОбязательно

Таким образом, заявляемый способ обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется участок гена hyaD, отвечающего за синтез гиалуронсинтетазы Pasteurella multocida, непосредственно в пробах легких, бронхиальных и средостенных лимфоузлов и культурах бактерий. Он позволяет сократить сроки проведения исследований до четырех часов, снизить себестоимость диагностики в 4,5 раза, трудозатраты в 1,5 раза, исключить необходимость выделения чистой культуры.

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)
Наверх