способ определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека

Формула изобретения

Способ определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека при температуре 37°C с последующим выявлением лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что лизис эритроцитов барана проводят 10% сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека.

Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.

Известен способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при (37,0±0,5)°C в течение 30 мин с последующим выявлением степени лизиса эритроцитов по соответствующей формуле, а также титра гетерофильных антител. Определение нарушений иммунного статуса проводят сопоставлением коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов [1].

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что не отражается участие компонента C1q комплемента, связывающего циркулирующие иммунные комплексы.

Известен также экспресс-способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител в присутствии 0,29 M NaCl в буферном растворе. При наличии ингибирования лизиса эритроцитов менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека, 35-70% нормальную, более 70% - пониженную [2].

Недостатком этого экспресс-способа является недостаточная точность, связанная с тем, что используется нефизиологическая концентрация 0,29 M NaCl в гемолитической системе в качестве «нагрузки».

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности способа за счет исследования функциональной активности системы комплемента человека в условиях искусственного дефицита ионов кальция, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.

Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 10% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты (ЭГТУК) в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) (ЭБ) в вероналовом солевом буфере (ВСБ), содержащем 0,55 мМ MgCl₂, 0,15 М CaCl₂ (ВСБ²⁺ ) и 0,5 мМ ЭГТУК. Время проведения экспресс-способа 10 мин.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ЭГТУК для 50% ингибирования гемолитической активности системы комплемента сыворотки крови человека.

К 100 мкл суспензии ЭБ с концентрацией 1,5×10⁸ кл/мл добавляют 20 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 5-50 мкл 10 мМ ЭГТУК в ВСБ (концентрации ЭГТУК в пробах от 0,25 мМ до 0,75 мМ) и в общем объеме 200 мкл, доведенном буфером ВСБ²⁺, инкубируют 10 мин при 37°C. Одновременно ставят контроль на спонтанный (100 мкл ЭБ + 100 мкл ВСБ²⁺ ) и полный лизис ЭБ (100 мкл ЭБ + 100 мкл H₂O). После инкубации в течение 10 мин останавливают реакцию гемолиза добавлением 1,3 мл холодного 0,15 М раствора NaCl, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и определяют степень гемолиза по величине A ₄₀₅ супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (Y) определяют по формуле

Y(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,

где H, R и X - величины оптической плотности A₄₀₅ супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса E и в опытной пробе соответственно.

Степень ингибирования (СИ) определяют как разность показателей лизиса в контрольных и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации ЭГТУК, по формуле

СИ(%)=(100-Y),

где 100 - степень лизиса в контрольной пробе, Y - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 1).

Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолиз эритроцитов барана 10% сывороткой человека ингибируется дозозависимо от концентрации ЭГТУК. 50% ингибирование активности классического пути комплемента пулированной сыворотки крови наблюдается в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК. Ингибирование классического пути активации комплемента ЭГТУК обусловлено избирательным связыванием ионизированного кальция, который участвует в формировании и функционировании C1 компонента. При связывании ионов кальция происходит диссоциация C1r₂ и C1s₂ от субкомпонента C1q, связанного с иммунными комплексами. В данном случае иммунный комплекс представляет собой эритроциты барана, сенсибилизированные гетерофильными антителами человека.

Пример 2. Определение ингибирования гемолиза эритроцитов барана индивидуальной сывороткой человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК.

Исследования проведены аналогично выше описанным условиям только при постоянной концентрации ЭГТУК, равной 0,55 мМоль/л в гемолитической системе. Вместо пулированной сыворотки крови человека использовали индивидуальные сыворотки доноров (контрольная группа). Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, ингибирование лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека (контрольная группа) в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в гемолитической системе наблюдалось на уровне 35-70%. Ингибирование комплемента 0,55 мМ ЭГТУК на уровне 31-70% у здоровых доноров контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует оптимальную функциональную активность ионизированного кальция в сыворотке крови человека.

Пример 3. Определение ингибирования гемолиза в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в сыворотках крови неврологических больных. Разработанным способом были тестированы сыворотки крови 84 неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, только у 18 (21%) из 84 обследованных больных степень ингибирования гемолиза эритроцитов 10% сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК была в пределах референтных величин. В 50 пробах крови (60%) степень ингибирования комплемента была достоверно выше, чем у здоровых людей, и свидетельствовало о низкой функциональной активности ионизированного кальция. В 16 (19%) пробах крови неврологических больных СИ была меньше 30% и свидетельствовала о высокой функциональной активности ионизированного кальция.

Таким образом, из 84 обследованных проб в 66 (79%) сыворотках крови больных с атеросклерозом каротидных артерий наблюдаются сдвиги как в сторону повышения, так и в сторону снижения функциональной активности Ca²⁺.

Пример 4. Определение ионизированного и общего кальция в сыворотке крови неврологических больных.

Содержание общего кальция определяли с использованием коммерческого набора кальций (ЗАО «ЭКОлаб») в группе больных с повышенной и пониженной функциональной активностью кальция. Ионизированный кальций в сыворотке 84 неврологических больных измеряли с использованием ион-селективного электрода на автоматическом биохимическом анализаторе («Конелаб», Финляндия). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, содержание общего и ионизированного Ca²⁺ практически не отличается между двумя группами с повышенной и пониженной функциональной активностью Ca²⁺.

Таким образом, низкая и высокая функциональная активность Ca²⁺ в гемолитическом тесте не связана с концентрацией данного катиона в сыворотке крови. Тест с использованием ЭГТУК выявляет аффинность связывания ионов кальция в пентамолекулярном комплексе, C1q(C1r ₂C1s₂), C1 компонента системы комплемента. Функционирование данного ферментного комплекса находится под контролем C1-ингибитора, который необратимо связывается с димерным комплексом C1r-C1s и вызывает диссоциацию C1 компонента системы комплемента. От эффективности активации C1 комплекса зависит опсонизация иммунных комплексов активированным компонентом C3b и последующая их солюбилизация и элиминация.

Пример 5. Исследование гемолитической активности системы комплемента и эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител в сыворотках крови неврологических больных с высокой и низкой функциональной активностью Ca ²⁺.

В группах с повышенной и пониженной функциональной активностью ионизированного Ca²⁺ проведены исследования комплемент активирующей функции гетерофильных антител, как описано в работе [3], и реактивность системы комплемента в условиях «нагрузки» в виде 0,288% NaCl в гемолитической системе, как описано в работе [4]. Полученные результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, повышенная функциональная активность в 100% совпадает с повышенной комплемент активирующей функцией гетерофильных антител (КАФГА) и в 91% - с повышенной реактивностью системы комплемента. Высокий титр гетерофильных антител в сыворотке крови наблюдается у 64% тестированных пробах и соответственно низкий коэффициент эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител у 8 больных (73%). Только в одной сыворотке выявлен К_ЭФГА на уровне референтных величин (5,3±0,2 ЕД), в двух сыворотках К_ЭФГА в 4 раза выше.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, КАФГА только в 5 сыворотках больных (36%) была в пределах референтных значений (лизиса на уровне 30-70%), в 2 сыворотках (14%) повышенной и в 7 (50%) - пониженной. Причем титр гетерофильных антител во всех 14 исследованных сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного кальция была в пределах нормы (от (1:4) до 1:32). Расчетный коэффициент эффекторной функции гетерофильных антител (К_ЭФГА) в этой группе только у одного больного находился в референтной области (5,3±0,2 ЕД). У 8 больных (57%) К_ЭФГА был низкий, а у 5 (36%) - высокий. Реактивность системы комплемента у троих больных (21%) в пределах нормы, у 11 (79%) данный показатель был пониженный.

Таким образом, способ определения функциональной активности ионизированного кальция является более чувствительным тестом оценки иммунного статуса, чем определение К_ЭФГА и РСК.

Предлагаемый способ имеет преимущества по сравнению с известными, заключающиеся в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 10 мин, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.

Литература

1. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Сониев В.М., Онтобоев А.Н., Зинченко А.А., Алешкин В.А. Способ определения нарушения иммунного статуса // Патент РФ № 2247381 от 27.02.2005.

2. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Панченко Л.Ф., Зинченко А.А. Кубатиев А.А. Экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека // Патент РФ № 2422831 от 27.06.2011 г. Бюл. № 18.

3. Шойбонов Б.Б. и др. Хайбулин В.Р., Баронец В.Ю., Осипов А.В., Панченко Л.Ф. Коэффициент эффекторной функции антител (К_ЭФГА) - новый показатель состояния гуморального иммунитета // Патогенез. - 2011. - Т.9, № 1. - С.43-49.

4. Панченко Л.Ф., Шойбонов Б.Б., Тахаров И.Г., Зинченко А.А. Способ оценки состояния иммунной системы организма человека // Патент РФ № 2314529 от 10.01.2008 г.

Таблица 1
Ингибирование лизиса эритроцитов барана 10% пулированной сывороткой крови человека раствором ЭГТУК
ЭГТУК в гемсистеме, мМоль/л					0,35		0,45			0,55		0,65			0,7		0,75			0
СИ, %					16		32			50		71			82		92			0
Таблица 2
Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК
№ сыворотки	1	2		3		4		5			6		7			8			9		10
СИ,%	42	51		70		46		58			44		62			31			66		54
Таблица 3
Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови неврологических больных в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК
			Количество обследованных, n						Степень ингибирования гемолиза, %
									<30					31-70				>71
сыворотка крови больных			84						16					18				50
M±m									15±12					58±9				92±8

Таблица 4
Содержание общего и ионизированного кальция в сыворотке крови неврологических больных
	Сыворотки 84 больных	Сыворотки с высокой функциональной активностью Ca2+ (17 проб)	Сыворотки с низкой функциональной активностью Ca2+ (18 проб)
Ионизированный Ca2+, мМоль/л	1,24±0,075 (N=1,15-1,27)	1,21±0,05	1,24±0,09
Общий Ca2+, мМоль/л	2,22±0,12 (N=2,15-2,5)	2,20±0,09	2,23±0,14

Таблица 5
Сравнительные данные показателей в сыворотках с повышенной функциональной активностью ионизированного Ca2+ (ФАИ Ca2+ ), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (КЭФГА) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 11 больных с атеросклерозом каротидных артерий
№ сыв.	ФАИ Ca2+, % инг.	КАФГА, % лизиса	Титр ГА 1:	КЭФГА, ЕД	РСК, % инг.
4	12	78	64	1,2	20
23	5	90	512	0,2	1
36	7	91	512	0,2	0
38	4	81	64	1,3	2
42	2	90	4	22,5	0
43	12	77	16	4,8	16
45	2	78	64	1,2	8
66	17	86	64	1,3	24
70	17	85	4	21,3	60
73	2	87	64	1,4	0
74	25	84	32	2,6	16
M±m	9,5±7,7	84±5	1:(127±192)	5,3±8,3	13±18

Таблица 6
Сравнительные данные в сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного Ca2+ (ФАИ Ca2+ ), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (КЭФГА) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 14 больных с атеросклерозом каротидных артерий
№ сыв.	ФАИ Ca2+, % инг.	КАФГА, % лизиса	Титр ГА 1:	КЭФГА, Ед	РСК, % инг.
3	90	51	16	3,2	48
6	97	29	4	7,3	97
8	100	7	8	0,9	100
9	100	71	4	17,8	51
10	100	47	8	5,9	86
11	100	79	8	9,9	37
12	100	23	8	2,9	100
13	100	58	4	14,5	90
14	100	28	4	7,0	98
15	100	6	4	1,5	99
17	100	61	32	1,9	92
18	100	59	32	1,8	72
20	100	5	8	0,6	100
22	97	27	16	1,8	90
M±m	99±3	39±25	11±10	5,5±5,3	83±22