применение опиорфина в качестве психостимулирующего агента

Формула изобретения

1. Применение пептида при изготовлении лекарственного средства для лечения или для профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из обсессивно-компульсивного расстройства, нарколепсии, гиперсомнии, снижения вигильности, дефицита внимания у детей, гиперактивности у детей, биполярного заболевания, дистимического расстройства и циклотимического расстройства, где указанный пептид:

(i) содержит последовательность X₁-X₂ -Arg-Phe-Ser-Arg (SEQ ID NO:1), где:

- X₁ представляет собой атом водорода, тирозин или цистеин;

- если X₁ представляет собой атом водорода, то Х ₂ представляет собой глутамин или пироглутамат;

- если X₁ представляет собой тирозин или цистеин, то X₂ представляет собой глутамин; и

последовательность С-концевой области указанного пептида состоит из X₁ -X₂-Arg-Phe-Ser-Arg,

(ii) получен из пептида, определенного в (i), одной или несколькими химическими модификациями, улучшающими его стабильность и/или его биодоступность, выбранными из:

- NH2-QRFSR-CONH2;

- NH2-QRGPR-COOH;

- NH2-QR(4БромоF)SR-COOH;

- NH2-QRFPR-COOH;;

- N-(ацетил)QRFSR-COOH;

- N-(С8-полиэтилен)QRFSP-СООН;

- N-(биотин-C6)QRFSR-COOH;

- NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(D-энантиомер ретроинверсия);

- NH2-Y-(C6-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH2-Y-(С12-полиэтелиен)QRFSR-СООН;

- NH2-QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-CQRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-CQRF[S-O-C12-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH2-C-(C12-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH2-С-(С8-полиэтилен)QRSFR-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH2-[C 2]QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-С-(С8-полиэтилен)QRFS[( 3R]-СООН;

- NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFS[dR];

- NH2-[dC]QRF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH2-[C 2]QRF[S-O-C8-полиэтилен][( 3R]-COOH; и

- [CQRFSR]2, т.е. дипептида, образованного после окисления SH-групп N-концевого цистеина и цистиновой связи (дисульфидного мостика);

где:

- С 2 замещает естественный цистеиновый остаток на цистеин- 2 содержащий метильный остаток, прилегающий к углероду рядом с карбонильной группой цистеина;

- 3R замещает естественный остаток аргинина на аргинин- 3, содержащий метильный остаток, прилегающий к углероду рядом с аминогруппой аргинина;

- [S-O-С8-полиэтилен] является [S-O-октаноилом]; и

- С6, С8 или С12 полиэтилены соответствуют спейсерной группе, состоящей из этиленовой цепи из 6, 8 или 12 углеродов; и

(iii) проявляет психостимулирующую активность и/или активирует опиоидергический путь, зависящий от µ- и/или -опиоидных рецепторов.

2. Пептид по п.1, где указанный пептид состоит из последовательности X₁-X₂ -Arg-Phe-Ser-Arg, где

- X₁ представляет собой атом водорода, тирозин или цистеин;

- если X₁ представляет собой атом водорода, то Х₂ представляет собой глутамин или пироглутамат; и

- если X₁ представляет собой тирозин или цистеин, то Х₂ представляет собой глутамин. и

3. Применение по п.1, где указанный пептид состоит из последовательности, выбранной из последовательностей QRFSR (SEQ ID NO: 2), YQRFSR (SEQ ID NO: 3) и CQRFSR (SEQ ID NO: 4).

4. Применение по п.1, последовательность которого отличается от последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, консервативными заменами.

5. Применение по п.1, для лечения или для профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из обсессивно-компульсивного расстройства, нарколепсии, гиперсомнии и снижения вигильности.

6. Применение по п.1, предназначенный для введения взрослому в дозе, составляющей менее чем или равной 75 мг в день.

7. Применение по п.6, предназначенное для введения три раза в день.

8. Применение по п.1, предназначенное для введения ребенку в дозе, составляющей менее чем или равной 25 мг в день.

9. Применение по п.8, предназначенное для введения три раза в день.

10. Применение по п.1, предназначенное для введения посредством пути, выбранного из перорального, чрескожного, назального, подъязычного и внутривенного пути.

11. Применение по п.1, предназначенный для введения в комбинации со вторым активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из психостимулятора, антидепрессанта и анксиолитика.

12. Способ лечения или профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из обсессивно-компульсивного расстройства, нарколепсии, гиперсомнии, снижения вигильности, синдрома дефицита внимания у детей, гиперактивности у детей, биполярного заболевания, дистимического расстройства и циклотимического расстройства, включающий стадию введения нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества пептида, который:

(i) содержит последовательность X₁-X₂ -Arg-Phe-Ser-Arg (SEQ ID NO:1), где:

- X₁ представляет собой атом водорода, тирозин или цистеин;

- если X₁ представляет собой атом водорода, то Х ₂ представляет собой глутамин или пироглутамат;

- если X₁ представляет собой тирозин или цистеин, то X₂ представляет собой глутамин; и

последовательность С-концевой области указанного пептида состоит из X₁ -X₂-Arg-Phe-Ser-Arg, или

(ii) получен из пептида, определенного в (i), одной или несколькими химическими модификациями, улучшающими его стабильность и/или его биодоступность, выбранными из:

- NH2-QRFSR-CONH2;

- NH2-QRGPR-COOH;

- NH2-QR(4БромоF)SR-COOH;

- NH2-QRFPR-COOH;

- N-(ацетил)QRFSR-COOH;

- N-(С8-полиэтилен)QRFSR-СООН;

- N-(биотин-C6)QRFSR-COOH;

- NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(D-энантомер ретроинверсия);

- NH2-Y-(C6-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH2-Y-(C12-полиэтелиен)QRFSR-СООН;

- NH2-QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-CQRF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH2-CQRF[S-O-C12-полиэтилен]R-СООН;

- NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH2-С-(С12-полиэтилен)QRFSR-СООН;

- NH2-С-(С8-полиэтилен) QRF[S-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH2-[C 2]QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH2-С-(С8-полиэтилен)QRFS[ 3К]-СООН;

- NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFS[dR];

- NH2-[dC]QRF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH2-[С 2]QRF[S-O-С8-полиэтилен][ 3R]-СООН; и

- [CQRFSR]2, т.е. дипептида, образованного после окисления SH-групп N-концевого цистеина и цистиновой связи (дисульфидного мостика);

где:

- С 2 замещает естественный цистеиновый остаток на цистеин- 2 содержащий метальный остаток, прилегающий к углероду рядом с карбонильной группой цистеина;

- 3R замещает естественный остаток аргинина на аргинин- 3, содержащий метальный остаток, прилегающий к углероду рядом с аминогруппой аргинина;

- [S-O-С8-полиэтилен] является [S-O-октаноилом]; и

- С6, С8 или С12 полиэтилены соответствуют спейсерной группе, состоящей из этиленовой цепи из 6, 8 или 12 углеродов.

13. Способ по п.12, где указанный пептид состоит из последовательности X₁-X₂ -Arg-Phe-Ser-Arg, где

- X₁ представляет собой атом водорода, тирозин или цистеин;

- если X₁ представляет собой атом водорода, то X₂ представляет собой глутамин или пироглутамат;

- если X₁ представляет собой тирозин или цистеин, Х₂ представляет собой глутамин.

14. Способ по п.12 или 13, где указанный пептид состоит из последовательности, выбранной из последовательностей QRFSR (SEQ ID NO:2), YQRFSR (SEQ ID NO:3) и CQRFSR (SEQ ID NO:4).

15. Способ по п.14, последовательность которого отличается от последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, консервативными заменами.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к пептидам, выделенным из человеческого белка BPLP (Basic Proline-rich Lacrimal Protein - основный пролин-богатый лакримальный белок), кодируемого геном Proll, в особенности опиорфина, для применения в качестве психостимулирующих агентов. Изобретение также относится к применению таких пептидов для получения психостимулирующего лекарственного средства.

Психостимулирующие агенты представляют собой психотропные вещества, рассматриваемые в качестве психостимуляторов, ускоряющих активность нервной системы и стимулирующих мотивацию и хорошее самочувствие. Согласно классификации психотропных агентов, созданной Delay и Deniker, психостимулирующие агенты, в частности, содержат нооаналептики (nooanaleptics), такие как стимуляторы бдительности (амфетамины), антидепрессанты-тимоаналептики, а также различные стимуляторы, такие как кат и кофеин.

Психостимуляторы действуют путем стимуляции нейропередачи. Они используются для лечения различных симптомов, включающих снижение вигильности, нарколепсию, ожирение, дефицит внимания и/или гиперактивность у детей, обсессивно-компульсивные расстройства (ОКР), депрессию, манию и биполярное расстройство.

Однако психостимуляторы часто ассоциированы с побочными эффектами, такими как зависимость, устойчивость, депрессия после внезапного прерывания и тревожность. Таким образом, существует необходимость получения психостимуляторов, которые обладают ограниченными и/или минимальными побочными эффектами.

В 1988 г. был идентифицирован регулируемый андрогенами ген, в основном экспрессирующийся в подчелюстной железе и в предстательной железе взрослых крыс (Rosinski-Chupin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85(22):8553-7; EP 0394424). Этот ген кодирует предшественник «крысиный белок 1 подчелюстной железы» (SMR1-submandibular rat₁ protein). Этот предшественник расщепляется in vivo по мультиосновным сайтам с образованием трех структурно близких пептидов (Rougeot et al., Eur. J. Biochem. 1994; 219(3):765-73).

Было установлено, что выделенный из SMR1 пептид, с последовательностью QHNPR (SEQ ID NO:6), названный сиалорфин, представляет собой гормональный мессенджер межклеточной связи. Таким образом, сиалорфин представляет собой экзокринный и эндокринный гормональный пептид, экспрессия которого регулируется андрогенами, и его секреция вызвана воздействием окружающей среды, опосредованным адренергическими сигналами (Rougeot et al., Am. J. Physiol. 1997; 273(4 Pt2):R1309-20).

Тот факт, что сиалорфин секретируется в ответ на воздействие окружающей среды у самцов взрослых крыс, приводит к гипотезе о том, что этот пептид может играть роль в интеграции физиологических и поведенческих сигналов, связанных с репродукцией. Была охарактеризована роль, которую играет сиалорфин в половом поведении, и с помощью экспериментальных данных было показано, что сиалорфин способен модулировать половое поведение самцов крыс в зависимости от состояния окружающей среды. Международная патентная заявка WO 01/00221 описывает применение продуктов созревания SMR1 для лечения психических и/или поведенческих расстройств, включающих половые расстройства.

Кроме того, было обнаружено, что продукты созревания SMR1 распознают специфические сайты в органах, причем указанные сайты вовлечены в концентрацию минеральных веществ. Международная патентная заявка WO 98/37100 описывает терапевтическое применение продуктов созревания SMR1 для лечения или предотвращения заболеваний, ассоциированных с несбалансированностью минеральных веществ.

Rougeot et al., Proc. Natl. Аса. Sci. USA 2003; 100(14):8549-54) продемонстрировали, что поверхностный рецептор, с которым сиалорфин связывается in vivo, представляет собой эндопептидазу NEP (Неприлизин; ЕС 3.4.24.11). Кроме того, было доказано, что сиалорфин представляет собой лиганд и физиологический антагонист активности NEP. Таким образом, сиалорфин представляет собой первый физиологический ингибитор энкефалиназы NEP, идентифицированный у млекопитающих (Европейская патентная заявка ЕР 1216707) и который демонстрирует потенциальный анальгетический эффект в крысиной модели боли.

Европейская патентная заявка ЕР 1577320 описывает человеческий функциональный гомолог сиалорфина. Этот пептид с последовательностью SEQ ID NO:2 назвали опиорфин. Геномный анализ in silico обнаружил, что он соответствует фрагменту созревания белка BPLP с последовательностью SEQ ID NO:5. Белок BPLP представляет собой так называемый «основный пролин-богатый лакримальный белок», «пролин-богатый белок I» (Proline-rich protein 1) или «PRL1», который кодируется человеческим геном Proll. Было продемонстрировано, что опиорфин ингибирует деградацию физиологических субстратов NEP и APN, т.е. вещества Р и метионин-энкефалина. Европейская патентная Заявка ЕР 1577320 указывает на то, что опиорфин обладает анальгетическими свойствами, и на то, что он может быть использован, в частности, для лечения или предотвращения боли.

Анальгетический эффект опиорфина подтвердили впоследствии Rougeot и Messaoudi (Med. Sci. (Paris) 2007; 23(1):37-9). Было также продемонстрировано, что этот анальгетический эффект не сопровождается антиперистальтическим эффектом в отличие от того, что происходит с морфином, который представляет собой наиболее сильный анальгетик, применяемый в настоящее время (Rougeot С, Proceedings of the 4^th International Peptide Symposium; J. Wilce (Editor) on behalf of the Australian Peptide Society, 2007).

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что опиорфин обладает не только анальгетическими свойствами, но также и психостимулирующим эффектом. Кроме того, этот психостимулирующий эффект не ассоциирован с каким-либо побочным эффектом типа амнезии, седативного эффекта, гиперактивности или привыкания. Наконец, было обнаружено, что анальгетический потенциал опиорфина является таким же сильным, как у морфина, и что его психостимулирующий потенциал является таким же сильным, как у имипрамина.

Таким образом, опиорфин и выделенные пептиды могут быть преимущественно использованы в качестве психостимуляторов для лечения или предотвращения заболеваний, таких как нарколепсия, гиперсомния, снижение вигильности, дефицит внимания у взрослых и детей, гиперактивность у взрослых и детей, синдром дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), обсессивно-компульсивные расстройства (ОКР), и расстройства настроения, такие как депрессия, биполярное заболевание, дистимическое расстройство и циклотимическое расстройство.

Пептиды согласно изобретению

Изобретение относится к терапевтическим применениям пептида, который содержит или состоит из продукта созревания основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5, называемого эталонным пептидом или эталонной последовательностью, или который содержит или состоит из производного указанного продукта созревания. Такие пептиды обозначаются как «пептиды согласно изобретению» в тексте настоящей заявки.

В рамках настоящего изобретения с помощью термина «пептид» обозначается молекула, содержащая линейную цепь аминокислот, соединенных друг с другом посредством пептидных связей. Цепь, возможно, может быть циклической, т.е. оба конца линейного пептида или боковые группы аминокислот являются связанными с помощью химической связи. Пептиды согласно изобретению содержат менее чем 100 аминокислот. Предпочтительно, пептид состоит из 4-40, 4-35, 4-30, 4-20, 4-10, 5-40, 5-35, 5-30, 5-20, 5-10, 5-8 или 5-6 аминокислот.

С помощью термина «продукт созревания» обозначают пептид, полученный с помощью селективного протеолитического расщепления белка-предшественника в консенсусных сайтах созревания с помощью прогормональной конвертазы. Прогормональная конвертаза конвертирует неактивный предшественник в активные пептиды и включает, например, фурин, РС-конвертазы или РАСЕ 4. Последовательность консенсусных сайтов созревания предпочтительно представляет собой следующий консенсус: [H/R/K]-X₃ -[R/K]-[R/K], где [H/R/K] обозначает, что аминокислота представляет собой Н, R или K, Х₃ обозначает цепь из трех аминокислот, и [R/K] обозначает, что аминокислота представляет собой R или K. Прогормональные конвертазы расщепляют консенсусный элемент между двухосновными остатками [R/K]-[R/K]. Прогормональные конвертазы хорошо известны специалисту в данной области и, в частности, описаны в работе Scamuffa et al. (2006 FASEB J. 20(12):1954-63).

Один из продуктов созревания основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5 представляет собой пептид QRFSR с последовательностью SEQ ID NO:2. Последовательность препробелка BPLP содержит концевой консенсусный сайт сигнального пептида, при расщеплении по которому образуется пробелок QRFSRRX_(n). Этот пробелок содержит двухосновный сайт и основную аминокислоту в положении -4-концевого сайта между 2R. Пептид QRFSR образуется после действия прогормональной конвертазы.

Пептиды согласно изобретению также включают производные пептидов, содержащие или состоящие из продуктов созревания основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5.

С помощью термина ((пептидные производные» обозначают пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, содержащую одну или более мутаций (замен, вставок или делеций) по отношению к эталонным пептидам. Предпочтительно, указанные пептиды содержат только мутации типа замены. Замены могут быть консервативными или неконсервативными. Предпочтительно, если указанные пептиды содержат по большей мере 1, 2, 3, 4 или 5 мутаций или замен по отношению к эталонным пептидам. С помощью термина «пептидные производные» также обозначают пептидомиметики пептидов, содержащие или состоящие из продуктов созревания основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5 (см., например, Abell, 1997, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press; Gante, 1994, Peptidmimetica, massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106:1780-1802; и Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3039-3049). Предпочтительные пептидомиметики согласно изобретению включают те, что описаны в предварительной заявке США US 61/042922 от 7 апреля 2008 года и в международной заявке РСТ/ЕР2009/054171 от 7 апреля 2009 года.

В предпочтительном воплощении пептид согласно изобретению отличается от эталонной последовательности только присутствием консервативных замен. Консервативные замены представляют собой замены аминокислот того же класса, такие как замены аминокислот с незаряженными боковыми цепями (таких как аспарагин, глутамин, серин, цистеин, тирозин), аминокислот с основными боковыми цепями (таких как лизин, аргинин и гистидин), аминокислот с кислыми боковыми цепями (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), аминокислот с неполярными боковыми цепями (таких как аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин и триптофан).

Предпочтительно, пептид согласно изобретению представляет собой выделенный пептид. С помощью термина «выделенный» пептид в настоящем документе обозначают пептид, выделенный из тела человека или из организма млекопитающего, отличного от человека, предпочтительно в очищенной форме. Однако выделенный пептид может, например, быть представлен в фармацевтической композиции или в наборе реагентов. Предпочтительно, пептид представлен в одной из фармацевтических композиций, описанных ниже.

Пептиды согласно изобретению проявляют психостимулирующую активность. С помощью термина «пептид, проявляющий психостимулирующую активность», обозначают пептид, который:

- проявляет защитный эффект против пассивности в тесте поведенческого отчаяния (например, тест принудительного плавания у крыс); и/или

- ингибирует активность металлоэктопептидаз, таких как NEP (Нефлизин; Neutral endopeptidase; EC 3.4.24.11) и/или APN (Аминопептидаза N; ЕС 3.4.11.2). Предпочтительно, если пептид ингибирует обе активности, NEP и APN. Не будучи ограниченными конкретной теорией, авторы изобретения считают, что пептиды согласно изобретению путем ингибирования деградации энкефалинов с помощью этих двух металлоэктопептидаз усиливают их физиологическое действие в выражении амплитуды действия и продолжительности действия и, таким образом, активируют опиоидные сигнальные пути, более конкретно энкефалин-зависимые µ- и -опиоидные рецепторы.

Защитный эффект против пассивности может быть определен с помощью теста принудительного плавания у крыс. В этом тесте, если пептид проявляет защитный эффект против пассивности, то время неподвижности крыс, которым вводили указанный пептид, уменьшается по отношению ко времени неподвижности контрольных крыс. Настоящий тест содержит следующие тесты:

- сеанс претеста, во время которого крыс помещают в воду на определенное время (от 10 до 20 мин, например, 15 мин) и затем удаляют из воды, сушат и помещают обратно в клетки.

- несколькими часами позже (через 20-25 часов, например, через 24 часа) проводят сеанс теста, во время которого крыс снова помещают в воду на определенное время (от 5 до 8 мин, например, 5 мин) и затем удаляют из воды, сушат и помещают обратно в клетку.

Тестируемые пептиды вводят после сеанса претеста и перед тестом. Время неподвижности крыс записывают в течение 5 мин во время претеста и теста. Время неподвижности крыс, которым вводили пептид, сравнивают со временем неподвижности контрольных крыс и со временем неподвижности тех же крыс во время сеанса претеста. Пример 3 более подробно описывает протокол теста принудительного плавания у крыс. Ингибирование активности металлоэктопептидаз, таких как NEP и/или APN, может быть измерено с помощью любого метода, хорошо известного специалисту в данной области. Например, может использоваться один из методов, описанных в примере 2 Европейской патентной заявки ЕР 1577320. Например, возможно измерять ингибирующую активность NEP путем измерения ингибирования деградации вещества Р в препаратах мембран LNCaP-клеток. Этот протокол подробно описан у Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100(14):8549-54) и в международной заявке РСТ/ЕР2009/050567 от 19 января 2009 г.

В конкретном воплощении пептиды согласно изобретению содержат или состоят из фрагмента последовательности SEQ ID NO:5, или содержат или состоят из пептида, выделенного из указанного фрагмента последовательности SEQ ID NO:5.

Предпочтительно, пептиды согласно изобретению содержат или состоят из последовательности X₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg (SEQ ID NO:1), где:

- X₁ представляет собой атом водорода, тирозин или цистеин;

- если X₁ представляет собой атом водорода, то X₂ представляет собой глутамин или пироглутамат;

- если X₁ представляет собой тирозин или цистеин, то Х₂ представляет собой глутамин; и

- указанная последовательность X ₁-X₂-Arg-Phe-Ser-Arg представляет собой C-концевую область указанного пептида.

Предпочтительно, если пептид по изобретению состоит из последовательности X₁ -X₂-Arg-Phe-Ser-Arg (SEQ ID NO:1). Пептид по изобретению, например, может состоять из последовательности QRFSR (SEQ ID NO:2), YQRFSR (SEQ ID NO:3) или CQRFSR (SEQ ID NO:4). В ином случае пептид согласно изобретению может отличаться от последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 консервативными заменами.

В другом конкретном воплощении пептиды согласно изобретению содержат или состоят из продуктов созревания аллельного варианта основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5.

Для полной ясности уточняется, что сиалорфин с последовательностью SEQ ID NO: 6 исключен из пептидов по изобретению.

Пептид по изобретению может дополнительно включать одну или более химических модификаций, улучшающих его стабильность и/или биодоступность. Эта модификация может, например, быть направлена на получение более стабильного и более липофильного пептида, чем исходный пептид. Пептиды, включающие одну или более химических модификаций, улучшающих их стабильность и/или биодоступность, являются частью пептидов согласно изобретению.

Такие химические или ферментативные модификации хорошо известны специалисту в данной области. В частности, могут быть, например, сделаны следующие модификации:

- модификации C-концевых или N-концевых областей пептидов, такие как N-концевое дезаминирование или ацилирование (предпочтительно, ацетилирование), или такие как C-концевое амидирование или этерификация;

- модификации амидной связи между двумя аминокислотами, такие как ацилирование (предпочтительно, ацетилирование) или алкилирование альфа-атома азота или углерода;

- изменения в хиральности, такие как замена природной аминокислоты (L-энантиомера) на соответствующий D-энантиомер. Эта модификация может, возможно, сопровождаться инверсией боковой цепи (от C-концевой области к N-концевой области);

- изменения в азапептиды, в которых один или более альфа-атомов углерода заменены атомами азота; и/или

- изменения в бета-пептиды, в которых один или более атомов углерода добавляются со стороны атома N-альфа или со стороны атома С-альфа основной цепи.

Как таковые могут быть модифицированы одна или несколько из аминокислот серина (Ser) и/или треонина (Thr) в пептидах, в частности путем введения в ОН-группу боковой цепи серина и/или треонина сложноэфирной группы, простой эфирной группы или C₈-октаноильной группы. Этерификация, простая операция, может быть проведена с карбоновой кислотой, ангидридом, по мостикам и т.д., с целью образования, например, ацетатов или бензоатов. Этерификация, которая дает более стабильные соединения, может проводиться со спиртом, галогенидом и т.д., с целью образования, например, метилового эфира или O-гликозида.

Кроме того, также в пептидах могут быть альтернативно модифицированы одна или несколько аминокислот лизина (Lys), в частности путем:

- амидирования: эта модификация является простой для выполнения, положительный заряд лизина заменяется на гидрофобные группы (например, ацетильную или фенилацетильную);

- аминирования: путем образования вторичных амидов из первичного амина R=(CH₂)₄ -NH₃ ⁺, например путем образования N-метильной, N-аллильной или N-бензильной групп; и

- образования N-оксидной, N-нитрозо-, N-диалкилфосфорильной, N-сулфенильной или N-гликозидной групп.

Кроме того, одна или несколько аминокислот глутамина (Gln) также могут быть альтернативно модифицированы, например путем амидирования, путем образования вторичных или третичных аминов, в частности, с группами метального, этильного типа, как функциональными, так и нет.

Кроме того, одна или более аминокислот глутамата (Glu) и/или аспартата (Asp) также могут быть альтернативно модифицированы, например:

- путем этерификации с целью образования сложных метиловых эфиров или замещенных,или нет, сложных этиловых эфиров, сложных бензиловых эфиров, тиолов (активированных эфиров); и

- путем амидирования, а именно с целью образования N,N-диметильной группы, нитроанилидной, пирролидинильной группы.

С другой стороны, предпочтительно не модифицировать аминокислоты пролина, которые участвуют в образовании вторичной структуры пептидов, учитывая, кроме того, что аминокислоты Gly, Ala и Met, как правило, не обеспечивают возможностей модификаций, которые обычно представляют интерес.

Примеры таких пептидов, включающие одну или несколько химических модификаций, которые улучшают их стабильность и/или биодоступность, описаны в предварительной заявке США US 61/042922 от 7 апреля 2008 года и в международной заявке РСТ/ЕР2009/054171 от 7 апреля 2009 года. Они включают пептиды следующей формулы (I):

,

где:

- представляет собой атом водорода, тирозин, Y-[линкер]- или Zn- хелатирующую группу, такую как цистеин, С-[линкер]-, N-ацетил-цистеин, N-меркаптоацетил (HS-CH₂-CO-), гидроксамовую кислоту (HO-NH-CO-) или необязательно замещенный гидроксихинолин,

- AA₁ представляет собой Q или Glp,

- АА₂ представляет собой K, R или Н, предпочтительно R,

- АА₃ представляет собой Y, G, N, F или F(X), предпочтительно F или Р(Х),

- АА ₄ представляет собой Р, S или S(OAlk), предпочтительно S или S(OAlk),

- АА₅ представляет собой K или R, предпочтительно R,

- С-[линкер]- линкер Cys-[NH-(CH2)n-CO]-, где n целое число от 1 до 20,

- Y-[линкер]- линкер Tyr-[NH-(CH2)n-CO]-, где n' целое число от 1 до 20,

- F(X) обозначает фенилаланин, фенильная группа которого замещена одним или несколькими атомами галогенов,

- S(OAlk) обозначает серин, гидроксильная группа которого замещена линейной или разветвленной алкильной группой, содержащей от 1 до 20 атомов углерода,

- указанные AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ могут быть независимо представлены или в L-конфигурации, или в D-конфигурации, а любая из AA₁, АА₂ , АА₃, АА₄, и AA₅ необязательно может представлять собой аминокислоту, аза-аминокислоту или b-аза-аминокислоту;

где если производное пептида содержит цистеин, то указанное производное пептида необязательно представляет собой димер при условии, что пептид не является QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR или GIpRFSR.

Среди пептидов формулы (I), предпочтительные пептиды включают пептиды, ингибирующие как NEP, так и APN. Такие пептиды могут иметь следующую формулу (IV):

,

где:

- ^m представляет собой атом водорода или Zn-хелатирующую группу, такую как цистеин, С-[линкер]-, N-ацетил-цистеин, N-меркаптоацетил (HS-СН₂-СО-), гидроксамовую кислоту (HO-NH-CO-) или необязательно замещенный гидроксихинолин,

- AA ^m ₃ представляет собой F или F(X), предпочтительно F(X),

- AA^m ₄ представляет собой S или S(OAlk), предпочтительно S или S(OAlk),

- С-[линкер]-, F(X) или S(OAlk), как определено выше в настоящем документе для пептидов формулы (I),

- указанные Q, R, АА₃, АА ₄, и R могут быть независимо представлены или в L-конфигурации или в D-конфигурации, и любой элемент из Q, R, АА₃ , АА₄, и R необязательно могут представлять собой -аминокислоту, аза-аминокислоту или -аза-аминокислоту;

где в случае если производное содержит цистеин, то указанное пептидное производное необязательно представляет собой димер, при условии, что пептид не является QRFSR или YQRJFSR.

Конкретные примеры такого пептида формулы (I) и/или (IV) включают:

- QRFSR-NH ₂;

QR-F[4Br]-SR, где -F[4Br]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в параположении атомом брома;

- QRFPR;

- (Ацетил)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

- биотин-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

- dR-dS-dF-dR-dQ;

- Y-(-HN-(CH ₂)₆-CO-)-QRFSR;

- Y-(-HN-(CH ₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

- QRF-S(O-октаноил)-R;

- CQRFSR;

- CQRF-S(O-октаноил)-R;

- СОРР-S(O-додеканоил)-Р;

- C-(-HN-(CH ₂)₈-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH ₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH ₂)₈-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;

- [C 2]QRF-S(O-октаноил)-R;

- C-(-HN-(CH ₂)₈-CO-)-QRFS-[ 3R];

- C-[dQ]-RF-S(O-октаноил)-[dR];

- C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];

- [dC]-QRF-S(O-октаноил)-[dR];

- [C 2]-QRF-S(O-октаноил)-[p3R];

- [CQRFSR] ₂;

- QRYSR;

- QR-F[4F]-SR, где -F[4F]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в параположении атомом фтора;

- QR-F[4Br]-SR, где -F[4Br]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в параположении атомом брома;

- QKFSR;

- QRFSK;

- C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

- C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;

- C(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)QRF-S(O-октаноил)-R;

- C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR;

- C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-октаноил)- 3R;

- C-(-HN-(CH₂)₈ -CO-)-QRF-S(O-октаноил) 3R;

- где:

- C 2 представляет собой H₂N(-CH₂-SH)-CH ₂-CO-;

- 3R представляет собой -NH-CH₂-C[-(CH₂ )₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH;

- -S(-О-октаноил) обозначает серии, гидроксильная группа которого замещена октаноильной группой,

- -S(-О-додеканоил) обозначает серин, гидроксильная группа которого замещена додеканоильной группой.

Пептиды, включающие одну или несколько химических модификаций, которые улучшают их стабильность и/или биодоступность, описанные в предварительной патентной заявке США US 61 /042922 от 7 апреля 2008 года и в международной заявке РСТ/ЕР2009/054171 от 7 апреля 2009 года, дополнительно включают:

- NH₂-QRFSR-CONH₂;

- NH₂-QRGPR-COOH;

- NH₂ -QHNPR-COOH;

- NH₂-QR(4БромоF)SR-COOH;

- NH₂-QRFPR-COOH;

- N-(ацетил)QRFSR-COOH;

- N-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- N-(биотин-C6)QRFSR-COOH;

- NH₂-dRdSdFdRdQ-COOH(D-энантиомер ретроинверсия);

- NH₂-YQRFSR-COOH;

- NH₂-Y-(С6-полиэтилен)QRFSR-СООН;

- NH₂-Y-(C12-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH₂-QRF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH₂-CQRFSR-COOH;

- NH₂-CQRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

- NH₂-CQRF[S-O-C12-полиэтилен]R-COOH;

- NH₂-C-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

- NH₂-C-(C12-полиэтилен)QRFSR-СООН;

- NH₂-С-(С8-полиэтилен)QRF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH₂-[С 2]QRF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

- NH ₂-С-(С8-полиэтилен)QRFS[ 3R]-СООН;

- NH₂-C[dQ]RF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH₂-C-(C8-полиэтилен)QRFS[dR];

- NH₂-[dC]QRF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

- NH₂-[С 2]QRF[S-O-С8-полиэтилен][ 3R]-СООН; и

- [CQRFSR]2, т.е. дипептид, образованный после окисления SH-групп N-концевого цистеина и цистеиновой связи (дисульфидный мостик);

где:

- С 2 замещает природный остаток цистеина на цистеин- 2, содержащий метальный остаток по соседству с углеродом рядом с карбонильной группой цистеина;

- 3R замещает природный остаток аргинина на аргинин- 3, содержащий метальный остаток по соседству с углеродом рядом с аминогруппой аргинина;

- [S-O-C8-полиэтилен] представляет собой [S-O-октаноил]; и

- С6, С8 или С12 полиэтилены соответствуют спейсерной группе, состоящей из этиленовой цепи из 6, 8 или 12 атомов углерода.

Если пептид содержит, но не состоит из продукта созревания основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP) с последовательностью SEQ ID NO:5, или содержит, но не состоит из производного указанного продукта созревания, то пептид содержит дополнительные аминокислоты в его N- или C-концевой области. Эти дополнительные аминокислоты могут, например, соответствовать части последовательности BPLP или последовательности аминокислот, улучшающих его стабильность и/или биодоступность. Однако размер пептида предпочтительно не должен превышать 30-40 аминокислот.

Пептиды согласно изобретению могут быть синтезированы с помощью любого метода, хорошо известного специалисту в данной области. Такие методы в частности включают обычный химический синтез (в твердой фазе или в гомогенной жидкой фазе), ферментативный синтез из аминокислот, составляющих производные пептидов, а также методы биологического продуцирования с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Синтез посредством химического способа является особенно предпочтительным ввиду чистоты, антигенной специфичности, отсутствия нежелательных вторичных продуктов и ввиду легкости получения. Синтез посредством химического способа включает среди других методов структурный синтез Меррифилда и метод пептидного синтеза на основе твердофазного синтеза с использованием Fmoc (см., например, «Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach», опубликовано W. C. Chan и Р. D. White, Oxford University Press, 2000).

Терапевтическое применение пептидов согласно изобретению

Было продемонстрировано, что опиорфин проявляет как антидепрессантный, так и психостимулирующий эффект в крысиной модели анализа поведенческого отчаяния. Кроме того, было продемонстрировано, что антидепрессантный и психостимулирующий эффекты опиорфина зависят от активации эндогенных µ- и -опиоидных рецепторов, но не от активации -опиоидных рецепторов.

Таким образом, изобретение относится к описанным в абзаце выше пептидам по изобретению для применения в качестве психостимуляторов. Такие пептиды согласно изобретению могут использоваться для активации опиоидергического сигнального пути, зависящего от µ- и/или -опиоидных рецепторов. Кроме того, пептиды согласно изобретению не активируют опиоидергические сигнальные пути, зависящие от -опиоидных рецепторов.

Эти пептиды, в частности, могут использоваться для лечения или для профилактики нарколепсии, гиперсомнии, снижения вигильности, дефицита внимания (у взрослых и детей), гиперактивности (у взрослых и детей), синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), обсессивно-компульсивных расстройств (ОКР) и расстройств настроения, таких как депрессивные состояния и депрессия («Большое Депрессивное Расстройство»), причем последнее включает первичную депрессию («Большое Депрессивное Расстройство, Единичный Эпизод») и устойчивую депрессию («Большое Депрессивное Расстройство, Рецидивирующее»), биполярное расстройство (типа I и/или типа II), дистимическое расстройство и циклотимическое расстройство.

В рамках лечения одного из этих заболеваний пептиды согласно изобретению предпочтительно вводят подгруппе пациентов, нуждающихся в психостимуляторах и/или в активации опиодергического сигнального пути, зависящего от µ- или -опиоидных рецепторов.

Пептиды согласно изобретению также могут использоваться в виде комбинации (т.е. путем одновременного или последовательного введения) со вторым активным ингредиентом, направленным на лечение или предотвращение того же заболевания. Этот второй активный ингредиент также может обладать психостимулирующим, антидепрессантным или даже анксиолитическим эффектом. Например, пептиды могут использоваться в комбинации, по меньшей мере, с одним вторым активным ингредиентом, выбранным из:

- антидепрессанта, такого как имао (ипрониазид, моклобемид, и т.д.), имипраминового антидепрессанта (имипрамин, кломипрамин, амитриптилин, амоксапин, дозулепин, доксепин, мапротилин, тримипрамин и т.д.), селективного ингибирующего антидепрессанта с обратным захватом серотонина (циталопрам, флуоксетин, пароксетин, сертралин, эсциталопрам и т.д.) или ингибирующего антидепрессанта с обратным захватом серотонина и адреналина (милнаципран, венлафаксин, миртазапин и т.д.);

- анксиолитика, такого как бензодиазепин (алпразолам, клобазам, диазепам, лоразепам, празепам и т.д.), мепробамат, гидроксизин, буспирон, каптодиам или этифоксин; и

- психостимулятора, такого как морфин, модафинил, метилфенидат, производные деанола (акти 5, клерегил, дебрумил и т.д.), кетоглутарат, адрафинил или сулбутиамин.

Большинство этих известных активных ингредиентов при эффективных дозах обладают значительными побочными эффектами. В отличие от известных активных ингредиентов пептиды согласно изобретению действуют на систему физиологической регуляции, а не непосредственно на трансфертные системы рецепторов. Действие пептидов согласно изобретению, таким образом, не выходит за рамки регулируемой системы и не может нейтрализовать систему. Таким образом, они не обладают совсем или обладают очень слабыми побочными эффектами.

Пептиды по изобретению, путем усиления эффектов второго активного ингредиента, дают возможность вводить последние в концентрации, меньшей, чем эффективная доза, по сравнению с индивидуальным введением второго активного ингредиента. Таким образом, предпочтительное воплощение изобретения относится к применению пептидов согласно изобретению в комбинации, по меньшей мере, с одним вторым активным ингредиентом, причем указанный второй активный ингредиент вводится в концентрации меньшей, чем эффективная доза, конкретно, с дозой, при которой побочный эффект ограничен, уменьшен, минимизирован или отсутствует.

Пептид по изобретению, а также второй активный ингредиент могут присутствовать внутри одной и той же фармацевтической композиции или в двух отдельных фармацевтических композициях. Во втором случае фармацевтические композиции могут вводиться пациенту, по существу, как одновременно, так и последовательно.

Заболевание, упомянутое в настоящем документе, может быть подвергнуто лечению на любой стадии заболевания. С помощью термина «лечение» обозначают лечение с помощью лекарственного средства (направленное, по меньшей мере, на облегчение, замедление или прекращение прогрессии патологии). С помощью термина «профилактика» обозначают профилактическое лечение (направленное на уменьшение риска появления патологии).

С помощью термина «психостимулятор» или «психостимулирующий агент» обозначают соединение, которое вызывает увеличение допаминергической и норадренергической нейротрансмиссии. Более конкретно, психостимуляторы стимулируют нейромедиаторы, ответственные за контроль внимания, мотивацию, бдительность и концентрацию. Допамин и адреналин представляют собой два основных нейромедиатора, которые ответственны за контроль внимания, мотивацию, бдительность и концентрацию.

Термин «опиоидергический сигнальный путь, зависящий от µ- и/или -опиоидных рецепторов» хорошо известен специалисту в данной области. Эти сигнальные пути в значительной мере включают те, что описаны Henriksen и Willoch (2008 Brain. 131 (Pt 5):1171-96). Специалисту в данной области известно несколько доступных тестов, с помощью которых можно оценить, активирует ли соединение опиоидергический сигнальный путь, зависящий от µ- и/или -опиоидных рецепторов, таких как те, что описаны в примере 2. Например, возможно сравнить эффект соединения в присутствии и в отсутствии специфического опиоидного антагониста µ- и/или -опиоидных рецепторов. Исчезновение эффекта соединения в присутствии антагониста выявляет, что соединение активирует исследуемый опиоидергический сигнальный путь.

Настоящее изобретение относится к применению пептидов по изобретению для активации опиоидергического сигнального пути, зависящего от µ- и/или -опиоидных рецепторов, как in vitro, так и in vivo.

Изобретение также касается применения пептидов по изобретению для получения:

- психостимулятора;

- лекарственного средства, способного активировать опиоидергический сигнальный путь, зависящий от µ- и/или -опиоидных рецепторов; и/или

- лекарственного средства для предотвращения или лечения заболевания, выбранного из нарколепсии, гиперсомнии, снижения вигильности, дефицита внимания у взрослых и детей, гиперактивности у взрослых и детей, синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), обсессивно-компульсивных расстройств (ОКР) и расстройств настроения, таких как депрессия, биполярное заболевание, дистимическое расстройство и циклотимическое расстройство.

Кроме того, изобретение касается способа:

- лечения или предотвращения заболевания, выбранного из группы, состоящей из нарколепсии, гиперсомнии, снижения вигильности, дефицита внимания у взрослых и детей, гиперактивности у взрослых и детей, синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), обсессивно-компульсивных расстройств (ОКР) и расстройств настроения, таких как депрессия, биполярное заболевание, дистимическое расстройство и циклотимическое расстройство; и/или

- активации опиоидергического сигнального пути, зависящего от µ- и/или -опиоидных рецепторов;

причем способы содержат стадию введения индивидууму пептида по изобретению. Предпочтительно, индивидуум является нуждающимся в этом индивидуумом и/или пациентом. Предпочтительно, если вводится эффективное количество указанного пептида. Индивидуум и/или пациент предпочтительно нуждается в психостимуляторе и/или в активации опиоидергического сигнального пути, зависящего от µ- и/или -опиоидных рецепторов.

Фармацевтические композиции и дозировка

Пептиды по изобретению предпочтительно применяются в качестве фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один пептид по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

С помощью термина «вспомогательное вещество» или «фармацевтически приемлемый носитель» обозначают любой растворитель, дисперсионную среду, агент абсорбции-задержки и т.д., который не производит какой-либо побочной, например аллергической реакции у людей и животных.

Пептиды по изобретению могут соответствовать любым описанным выше пептидам.

Например, фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит от 3 до 100, от 5 до 50, или от 10 до 25 мг пептида по изобретению на однократную дозу фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может сопровождаться инструкциями относительно терапевтического применения (например, как упомянуто выше) и дозировки (например, совместимой с дозировками, упомянутыми в предыдущем абзаце).

Доза в значительной мере зависит от соответствующего активного ингредиента, способа введения, терапевтического показания, возраста, веса и состояния пациента.

Исходная дозировка, как правило, выбирается так, чтобы она была настолько низкой, насколько это возможно (минимальная эффективная доза). Если необходимо, дозировка постепенно увеличивается в зависимости от реакции пациента. При условии, что может существовать задержка перед проявлением эффектов активного ингредиента, поэтому предпочтительно будет необходимо подождать в течение нескольких недель перед увеличением дозировки.

В случае пептида по изобретению исходная доза для взрослого может составлять, например, менее чем или равную 75 мг в день, при введении в три приема. При необходимости эта дозировка может постепенно увеличиваться до 150 мг в день. Дозировки выше 200 мг в день не рекомендуются. Однако, когда пациентов отправляют в больницу в тяжелом состоянии, дозировки могут достигать 250 или 300 мг в день. У пациентов старшего возраста исходная доза может, например, составлять менее чем или равную 30 мг в день, и, предпочтительно, она не должна превышать 100 мг в день. У детей исходная доза может, например, составлять менее чем или равную 10-25 мг в день, и предпочтительно, она не должна превышать 75 мг в день.

Фармацевтические композиции по изобретению могут дополнительно содержать, по меньшей мере, один второй активный ингредиент, выбранный из психостимулятора, антидепрессанта и/или анксиолитика. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть составлены так, чтобы вводиться пациенту одним путем или различными путями.

Фармацевтическая композиция может, например, вводиться пероральным, подъязычным, назальным, буккальным, чрескожным, внутривенным, подкожным, внутримышечным и/или ректальным путем.

В случае введения посредством перорального или подъязычного пути композиции по изобретению представляют собой, например, желатиновые капсулы, шипучие таблетки, таблетки с покрытием или без, саше, «драже», ампулы или растворы для питья, микрогранулы или формы с пролонгированным высвобождением.

В случае введения посредством назального или буккального пути композиции по изобретению существуют, например, в виде спрея.

В случае введения посредством чрескожного пути композиции по изобретению существуют, например, в виде пластыря.

Когда предполагается введение посредством парентерального пути, более конкретно посредством инъекции, то композиции по изобретению, содержащие активный ингредиент(ы) существуют в виде инъецируемых растворов и суспензий, упакованных в ампулы или флаконы для медленной перфузии. Инъекция может в значительной мере осуществляться посредством подкожного, внутримышечного или внутривенного пути. Формы парентерального введения получают путем обычного смешивания активного ингредиента(ов) с буферами, стабилизаторами, консервантами, солюбилизаторами, изотоническими агентами и суспензионными агентами. Согласно известным методам эти смеси затем стабилизируются (например, с помощью фильтрации) и затем упаковываются в виде внутривенных инъекций. В качестве буфера специалист в данной области может использовать буферы на основе источника органического фосфата.

Примеры суспензионных агентов включают метилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гуммиарабик и натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы.

Кроме того, применяемые стабилизаторы по изобретению представляют собой сульфит натрия и метасульфит натрия, причем в качестве консервантов могут быть упомянуты p-гидроксибензоат, сорбиновая кислота, крезол или хлоркрезол. Для получения перорального раствора или суспензии активные ингредиенты растворяют или суспендируют в подходящем носителе вместе с диспергирующим, увлажняющим, суспензионным агентом (например, поливинилпирролидоном), консервантом (таким как метилпарабен или пропилпарабен), агентом коррекции вкуса или красителем.

Для получения микрокапсул активные ингредиенты объединяют с подходящими разбавителями, подходящими стабилизаторами, агентами, стимулирующими продолжительное высвобождение активных веществ, или с добавками любого другого типа для образования центрального ядра, которое затем покрывают с помощью подходящего полимера (например, водорастворимой смолы или не растворимой в воде смолы). Для этой цели будут использоваться методы, известные специалисту в данной области.

Полученные таким образом микрокапсулы затем необязательно включают в состав подходящих дозированных форм.

Термины «содержащий (comprising)», «содержащий (containing)», «включающий» и «состоящий из» хотя и имеют отличные значения, но используются взаимозаменяемо в описании изобретения и могут быть заменены друг другом.

Следующие примеры и чертежи иллюстрируют изобретение без ограничения его объема.

Описание фигур

Фигура 1 иллюстрирует психостимулирующий и антидепрессантный эффект опиорфина в тесте принудительного плавания путем измерения продолжительности неподвижного состояния во время претеста (n=40) и теста (dry, n=8 крыс/на группу) (среднее ± стандартная средняя ошибка). Результаты теста Манна-Уитни (Man-Whitney) (против носителя) следующие: ^Tp<0,1; *p<0,05; ***p<0,001. Во время теста крысы, которым вводили опиорфин, не смирялись со своим положением, в отличие от крыс, которым вводили носитель. Это демонстрирует, что опиорфин обладает антидепрессантным эффектом. Кроме того, во время теста период неподвижности крыс, которым вводили опиорфин, был короче, чем период неподвижности тех же крыс во время претеста. Это демонстрирует, что опиорфин обладает психостимулирующим эффектом.

Фигура 2 демонстрирует, что опиорфин проявляет анальгетическую активность в модели боли в тесте отдергивания хвоста. Реакцию на боль оценивали с помощью функции времени к вредным тепловым стимулам после введения человеческого опиорфина или морфина. Латентный период в тесте отдергивания хвоста оценивали для 4 различных моментов времени: 5, 15, 25 и 60 мин после введения опиорфина или носителя по отношению к морфину. Два последовательных измерения, разделенных 30-секундными интервалами проводили перед инъекцией опиорфина, морфина или носителя для оценки исходного латентного периода в тесте отдергивания хвоста. Эффекты опиорфина (черный круг; 2 мг/кг внутривенно) сравнивали с носителем (не закрашенный круг) и морфином (незакрашенный треугольник; 1 мг/кг внутривенно) по латентному периоду в тесте отдергивания хвоста. Результаты выражают в виде средних значений ± стандартная средняя ошибка для 6 крыс. Звездочка обозначает **Р<0,01 против носителя согласно U-тесту Манна-Уитни.

Фигура 3 демонстрирует, что человеческий опиорфин проявляет анальгетический эффект в модели боли в тесте отдергивания хвоста. Реакцию на боль оценивали с помощью функции к вредным тепловым стимулам после внезапного и продолжительного введения человеческого опиорфина или морфина. Латентные периоды теста отдергивания хвоста оценивали после внезапного (День 1) или ежедневного внутривенного введения в течение 7 дней (День 7) опиорфина, носителя или морфина. Два последовательных измерения, разделенных 30-секундными интервалами, проводили перед инъекцией опиорфина, морфина или носителя для оценки исходного латентного периода теста отдергивания хвоста. Эффекты опиорфина (не закрашенный треугольник; 2 мг/кг внутривенно) сравнивали с носителем (не закрашенный круг) и морфином (не закрашенный квадрат; 1 мг/кг внутривенно) по периоду латентности. Результаты выражают в виде средних значений ± стандартная средняя ошибка для 6 крыс. Звездочка обозначает *Р<0,05, **Р<0,01 против носителя согласно U-тесту Манна-Уитни.

Описание списка последовательностей

SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4 соответствуют пептидам согласно изобретению. Более конкретно, SEQ ID NO:2 соответствует опиорфину.

SEQ ID NO:5 соответствует последовательности человеческого основного пролин-богатого лакримального белка (BPLP).

SEQ ID NO:6 соответствует сиалорфину.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Синтез опиорфина (т.е. пептида QRFSR) компаниями «Genosphere Biotechnologies» (Франция) и «Almac Sciences» (Великобритания)

Партии опиорфина синтезировали в «Genosphere Biotechnologies» (Франция) и «Almac Sciences» (Великобритания). Дозозависимым способом подтверждали, что эти синтезированные партии защищены in vitro:

- вещество Р (физиологический субстрат NEP) и синтетические флуорогенные субстраты [Abz]-dRGL-[EDDnp], [Abz]-RGFK-[DnpOH] (Thermo-Fisher Scientific), защищены от эндопротеолиза рекомбинантным человеческим NEP (ингибирующие концентрации пептидов QRFSR, содержащиеся в количестве от 5 до 50 µM); и

- синтетический субстрат Ala-AMC защищены от аминопротеолиза рекомбинантным человеческим APN.

Пример 2. Эффект опиорфина на ноцицептивные трансмиссионные сигнальные пути

В аналитической модели поведенческой реакции на острую боль у самцов крыс «Тест причинение боли булавкой» (механические стимулы), описанной у Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(14):8549-54), было продемонстрировано, что опиорфин проявляет потенциальную антиноцицептивную активность при введении 1 мг/кг внутривенно (p=0,0002, U-тест Манна-Уитни, n=8-12 крыс/на группу), эквивалентную такой активности морфина при интраперитонеальном введении 6 мг/кг морфина (Rougeot and Messaoudi, Med. Sci. (Paris). 2007; 23(1):37-9).

Удивительным образом, среди основных побочных эффектов, антиперистальтический эффект морфина (80-90% ингибирования перистальтики у крыс, подвергнутых обработке морфином, по сравнению с контрольными крысами) не наблюдался у крыс, подвергнутых обработке опиорфином.

Затем в аналитической модели поведенческой реакции на хроническую боль по отношению к подкожному хроническому воспалению (химический стимул к задней лапе), с помощью «формалинового теста», описанного у Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(14):8549-54), исследовали анальгетическое действие опиорфина. Эталонное вещество представляет собой морфин дозой 2 мг/кг.

На основе двух наиболее важных переменных в так называемом «формалиновом» тесте боли, продолжительности зализывания лапы и количестве спазмов, опиорфин демонстрировал продолжительный анальгетический профиль (поведенческую реакцию записывали и анализировали по кинетике в течение 60 мин) при значительном дозозависимом эффекте (p 0,002, дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса, n=8 крыс/на группу) и с максимальным антиноцицептивным потенциалом при внутривенном введении 1-2 мг/кг (тест Манна-Уитни р=0,036-0,003 против носителя).

Следующая стадия была предназначена для определения специфичности антиноцицептивного механизма действия опиорфина и, в частности, вовлечения эндогенных опиоидных рецепторов. Анализировали антагонистический эффект следующих лигандов: опиоидного антагониста широкого спектра (Налоксон, 3 мг/кг) и селективных антагонистов опиоидных µ-рецепторов (СТОР, 0,8 мг/кг), -рецепторов (Налтриндол, 10 мг/кг) и -рецепторов (Нор-Биналторфимин, 5 мг/кг) соответственно.

Таблица 1
Обработка переменная	Носитель (n=8)	Опиорфин (n=8)	Налтриндол + опиорфин (n=8)	Hop-Биналторфимин + опиорфин (n=8)	«СТАР» + опиорфин (n=8)
Количество спазмов	287+31	149+28	176+29	169+26	285+36
H(dd1=4)=		U=8	U=10	U=9	U=32
13,12;
р<0,01
Значимость теста		р=0,01	р=0,02	р=0,02	р=1,00
Манна-Уитни
(относительно носителя)
Тест Манна-Уитни (относительно 1 мг/кг опиорфина)			U=26,5	U=29	U=11
Значимость			p=0,56	р=0,75	р=0,02

Было продемонстрировано, что анальгетический эффект опиорфина в «формалиновом тесте» нивелируется в присутствии Налоксона или «СТРА», специфических антагонистов µ-опиоидных рецепторов (таблица 1 выше). Этот результат демонстрирует, что антиноцицептивное действие опиорфина опосредовано сигнальными путями эндогенных опиоидов, которые зависят от опиоидных рецепторов и требуют специфической активации рецепторов опиоидов µ-подтипа. Эти рецепторы вовлечены в трансмиссию физиологических сигналов, вовлеченных в негативный ретроконтроль трансмиссии боли (энкефалины, -эндорфин и эндоморфины), и в действие морфина.

Таким образом, было продемонстрировано, что опиорфин проявляет потенциальную антиноцицептивную активность при 1 мг/кг посредством активации эндогенных опиоидергических сигнальных путей в двух аналитических моделях поведенческой реакции на боль у крыс, «Тест причинение боли булавкой» (резкая механическая боль) и в «Формалиновом Тесте» (хроническая химическая воспалительная боль). С другой стороны, опиорфин при внутривенном введении 1 мг/кг способен индуцировать в обоих из этих тестов максимальный анальгетический эффект, индуцированный морфином при интраперитонеальном введении 2-6 мг/кг, который является наиболее активной анальгетической молекулой при лечении тяжелой и хронической боли у людей.

Кроме того, с помощью модели воспаления толстой кишки у крыс наблюдали, что опиорфин при внутривенном введении 1 мг/кг не защищает стенку толстой кишки от воспаления, индуцированного интраректальным введением «TNBS», в отличие от ибупрофена. Опиорфин, таким образом, не проявляет какого-либо значительного кишечного противовоспалительного эффекта в этом тесте. Противоболевой эффект опиорфина при введении в количестве 1 мг/кг в «Формалиновом Тесте», таким образом, по-видимому, не ассоциирован с противовоспалительной активностью пептида.

Пример 3. Эффект опиорфина на сигнальные пути контроля эмоций: антидепрессантный потенциал

- Тест поведенческого отчаяния (Тест принудительного плавания)

Эффекты опиорфина на поведение отчаяния и пассивности исследовали у взрослых самцов крыс. Тест включает 15-минутный сеанс претеста и через 24 часа 5-минутный сеанс теста. Во время сеанса претеста поведение крыс записывали в течение первых 5 минут. В конце претеста крысу удаляли из воды, аккуратно сушили, обрабатывали и затем помещали обратно в ее клетку. Во время теста крысу снова помещали в воду и ее поведение записывали в течение 5 минут.

Опиорфин вводили внутривенно сразу после сеанса претеста и за 300 и за 15 минут перед сеансом теста с помощью трех доз (0,5, 1 или 2 мг/кг). Эталонное вещество представляет собой 8-OH-DOAT (0,5 мг/кг), которое является антагонистом 5-НТ1а, или имипрамин (20 мг/кг), который является ингибитором обратного захвата серотонина.

Таблица 2
Группа	Носитель	Опиорфин 0,5 мг/кг	Опиорфин 1 мг/кг	Опиорфин 2 мг/кг	8-OH-DPAT 0,5 мг/кг
Претест Тест Краскела-Уоллиса H(dd14)=1,828 Р=0,767

Тест Тест Краскела-Уоллиса H(dd14)=20,046 Р=0,0005
Тест Вилкоксона (Тест против Ре-теста)	z=2,24 р=0,025	z=1,05 p=0,293	z=2,524 p=0,012	z=2,313 p=0,021	z=2,524 p=0,012

Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса продемонстрировал, что период неподвижности крыс различных групп во время претеста значительно не отличается, в то время как для тех же групп после обработки наблюдали значительную гетерогенность (таблица 2 выше).

Тест Манна-Уитни продемонстрировал, что период неподвижности крыс, подвергнутых обработке с помощью 1 и 2 мг/кг опиорфина и 8-OH-DPAT, значительно меньше, чем у крыс контрольной группы, тогда как период неподвижности у крыс группы, подвергнутой обработке с помощью 0,5 мг/кг опиорфина, имеет тенденцию к уменьшению по сравнению с периодом неподвижности у крыс из контрольной группы (фиг.1).

Тест Уилкоксона продемонстрировал, что период неподвижности в воде у контрольных крыс значительно увеличивается между сеансами теста и претеста. Действительно, контрольные крысы проявляют пассивность во время теста, так как они помнят, что вскоре их заберут из воды. В отличие от контрольных крыс, период неподвижности крыс из групп, подвергнутых обработке с помощью 1 и 2 мг/кг опиорфина и 8-OH-DPAT, значительно снижается между претестом и тестом. Это указывает на то, что крысы, подвергнутые обработке опиорфином, не ведут себя пассивно и, таким образом, опиорфин обладает эффектом антипассивности (антидепрессантным). Кроме того, период неподвижности у крыс из групп, подвергнутых обработке с помощью 1 и 2 мг/кг опиорфина и 8-OH-DPAT, значительно снижается относительно периода неподвижности контрольной группы. Это указывает на то, что опиорфин проявляет не только антидепресантный эффект, но также психостимулирующий эффект.

В качестве заключения стоит отметить, что опиорфин, вводимый внутривенно, индуцирует защитный дозозависимый эффект против пассивности и, таким образом, проявляет максимальный антидепрессантный потенциал при концентрации 1 мг/кг в поведенческом тесте отчаяния у самцов взрослых крыс.

С целью исключения возможной амнезии или эффекта гиперактивности от опиорфина, который может также объяснить отсутствие пассивности крыс, подвергнутых обработке, проводили два дополнительных поведенческих теста с целью подтверждения специфичности антидепрессантного эффекта опиорфина.

- Тест условного рефлекса пассивного избегания

С помощью теста устранения пассивности у крыс есть возможность оценить степень запоминания животного во время применения аверсивного раздражителя, которого оно не может избежать. Устройство состоит из двух компартментов, разделенных открытой перегородкой, дающей возможность крысе переходить из одного компартмента в другой. Первый компартмент, где располагается крыса в начале теста, освещается и сообщается посредством застекленной двери с темным компартментом, пол которого включает в себя сетку с подведенным электрическим током. Тест устранения пассивности включает сеанс претеста, где животные получают электрический шок (2 мА, 2 сек), когда они входят в темный компартмент, и 3-минутный сеанс теста через 24 часа, где поведение животного анализируют на предмет способности запоминания усвоенной задачи (к сетке темного компартмента в тесте ток больше не подключается). Опиорфин вводили (1 мг/кг внутривенно) сразу после сеанса претеста. С помощью этого теста можно оценить эффект амнезии от действия опиорфина. Таблица, приведенная ниже, демонстрирует латентный период для входа в темный компартмент (среднее ± стандартная средняя ошибка, n=8 крыс/на группу).

Таблица 3
Группа	Носитель (n=8)	Опиорфин 1 мг/кг (n=8)	U-критерий Манна-Уитни
Претест	23,1±4,7	24,6±6,6	U=31 p=0,91
Тест	171,3±6,6	15 8,5±20,5	U=32 p=0,99
Тест Вилкоксона	z=2,52 р=0,012	z=2,53 р=0,012

Тест Манна-Уитни продемонстрировал, что латентный период крыс из обеих групп, контрольной и группы опиорфина, для входа в темный компартмент во время сеансов претеста и теста не отличался значительным образом. Тест Уилкоксона продемонстрировал, что латентный период крыс для каждой из двух контрольных групп во время теста значительно выше (x 6-7), чем латентный период, полученный во время претеста. Это указывает на то, что животные были способны запоминать усвоенную задачу в течение продолжительного времени. Опиорфин с внутривенной дозой 1 мг/кг, таким образом, не демонстрирует никакого эффекта амнезии в тесте условного рефлекса пассивного избегания.

- Тест на локомоторную активность

Устройство состоит из двух компартментов, разделенных открытой перегородкой, дающей возможность крысе переходить из одного компартмента в другой. Измеряемые переменные представляют собой количество передвижений в вертикальном положении (вертикальная активность) и количество переходов в двух компартменах (горизонтальная активность) в течение 3-минутного периода. Эталонная молекула представляет собой имипрамин (20 мг/кг).

Таблица 4
Группа	Носитель (n=8)	Имипрамин 20 мг/кг (n=8)	Опиорфин 1 мг/кг (n=8)
Среднее ± стандартная средняя ошибка	30,13+2,56	18,75+1,91	35,25+2,84
Тест Краскела-Уоллиса: (H(adf)=15,6; p=0,004)		U=5	U=21
Значимость теста Манна-Уитни (относительно носителя)		р=0,008	р=0,25

По сравнению с контрольными группами, опиорфин с внутривенной дозой 1 мг/кг не индуцировали ни какого-либо седативного эффекта в отличие от имипрамина (20 мг/кг интраперитонеально), ни какого-либо значительного эффекта гиперактивности в тесте на локомоторную активность крыс.

Таким образом, в аналитической модели поведенческого отчаяния было продемонстрировано, что у самцов крыс дополнительно к психостимулирующему эффекту опиорфин проявляет специфический антидепрессантный эффект при внутривенном введении 1 мг/кг.

Следующая стадия заключалась в тестировании специфичности его механизма действия и, в частности, вовлечения эндогенных опиоидных рецепторов в тесте принудительного плавания. Таблица, приведенная ниже, демонстрирует эффект обработки в тесте принудительного плавания путем измерения периода неподвижности во время сеансов претеста и теста (s, n=8/на группу; среднее ± стандартная средняя ошибка)

Таблица 5
Группа	Носитель (n=8)		Имипрамин 20 мг/кг	Опиорфин 1 мг/кг	Naltrindole Опиорфин 10-1 мг/кг	СТАР-Опиорфин 1-1 мг/кг
	(n=8)		(n=7)*	(n=8)	(n=8)	(n=8)
Претест	62,9+11,8		97,4+7,8	93,6+15,5	48,8+6,0	71,9+8,9
Тест	128,3±21,1		63,9+10,6	53,6+11.4	86,0+15,6	57,6+8,7
ТКУ:			U=6	U=10	U=16	U=6
(H(4df)=11,64; P=0,02)
Значимость теста Манна-Уитни (относительно Носителя в тесте)			p=0,011	p=0,021	p=0,093	р=0,006
Значимость		Z=2,52	z=2,36	z=2,38	z=2,52	z=0,98
тест Вилкоксона
(претест против теста)		p=0,012	p=0,018	p=0,017	p=0,012	р=0,33

Эта вторая серия тестов в крысиной модели поведенческого отчаяния подтвердила, что дополнительно к психостимулирующему эффекту внутривенная доза опиорфина 1 мг/кг индуцирует антидепрессантный эффект. Этот эффект сравним с эффектом, проявляемым эталонным веществом имипрамином при интраперитонеальной дозе 20 мг/кг. Эффекты опиорфина нивелируются в присутствии «Налтриндола», специфического антагониста 5-опиоидных рецепторов (таблица 5 выше). Это указывает на то, что действие опиорфина антидепрессантного и психостимулирующего типа опосредовано эндогенными опиоидными сигнальными путями и требует специфической активации опиоидных рецепторов 5-подтипа.

Пример 4. Эффект опиорфина на сигнальные пути, контролирующие эмоции: анксиолитический потенциал

- Тест на условное защитное закапывание

Анксиолитические эффекты опиорфина, вводимого внутривенно в дозе 1 мг/кг, оценивали в тесте на условное защитное закапывание на самцах крыс линии Вистар. Во избежание ложных положительных результатов при условии, что опиорфин проявляет анальгетический эффект, тест проводили в течение двух сеансов: сеанс для выбора тревожных крыс с последующим сеансом теста с обработкой. Тест на условное защитное закапывание для выбора экспериментальных крыс проводили в первые часы фазы темного времени суток, фазы, когда крысы наиболее активны. Каждую крысу помещали в экспериментальное устройство со стороны, противоположной зонду, и крысу подвергали однократному электрошоку низкой интенсивности (2 мА) в момент, когда она в первый раз клала переднюю лапу на зонд, и затем наблюдали ее поведение в течение 3 минут. Опилки заменяли и выравнивали до единой высоты 5 см перед проходом каждой крысы. Были выбраны шестнадцать крыс, которые закапывали зонд, по меньшей мере, в течение 25 секунд.

На следующий день крыс подвергали обработке за 15 минут до теста и помещали в часть экспериментального устройства, противоположную зонду. В этом сеансе крыса не подвергалась электрошоку, один вид зонда придавал крысам тревожность. Поведение крыс записывали в течение 5 минут. Анализируемые переменные представляли собой время закапывания зонда, количество движений в направлении зонда, количество приближений мордой к зонду и количество уходов от зонда. Эти различные переменные использовались для расчета общей бальной оценки тревожности для каждой крысы. Таблица, приведенная ниже, демонстрирует результаты, полученные касательно эффектов опиорфина (1 мг/кг, внутривенно) на общую бальную оценку тревожности в тесте условного защитного закапывания.

Таблица 6
Группы	Носитель	Опиорфин 1 мг/кг
	(n=8)	(n=8)
Среднее ± стандартная средняя ошибка	25,06+2,94	25,94+3,74
Значимость тест Манна-Уитни	U=29,50 p=0,79

На основании общей бальной оценки тревожности опиорфин с внутривенной дозой 1 мг/кг не демонстрировал анксиолитической активности по отношению к контролю в тесте условного защитного закапывания у самцов крыс Вистар. Что касается передвижений в вертикальном положении, то крысы, подвергнутые обработке опиорфином, демонстрировали тенденцию совершать меньше движений в вертикальном положении, чем контрольные крысы (р=0,11 против носителя, n=8 крыс/на группу).

Пример 5. Эффект опиорфина в фармакозависимом поведении: потенциал типа привыкания

- Тест на предпочтение мест введения психоактивного вещества

Устройство состоит из двух компартментов, разделенных открытой стеклянной дверью во время фазы привыкания и теста, дающей возможность крысе свободно проходить из одного компартмента в другой. Один компартмент освещен, и пол включает в себя металлическую сетку. Этот компартмент представляет собой непредпочтительный негативный компартмент, и время, проводимое в этом компартменте, представляет собой измеряемую переменную. В течение периода выработки условного рефлекса в течение 10 дней (45 мин, закрытая стеклянная дверь) аверсивный компартмент ассоциирован с введением тестируемого продукта (контроль и лекарственные средства), в то время как предпочтительный компартмент (темный с подстилкой) ассоциирован с контролем (носитель). Тест проводили в три фазы: привыкание или фаза претеста, фаза обработки и конечная фаза обучения, опиорфин вводили в анальгетически эффективной дозе внутривенно 1 мг/кг, а морфин использовали в качестве эталонного вещества, вводимого внутривенно в дозе 2 мг/кг.

Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса, применяемый на основе времени, проводимого в непредпочтительном компартменте, соответственно в течение фазы 1 (претест, день 0) и в течение фазы 3 (тест, день 11), выявил, что три группы не отличаются значительным образом после фазы привыкания в день 0 (H(2df)=1,21; p=0,55), в то время как эти же самые группы значительно отличаются во время теста в день 11 после фазы обработки, вызывающей реакцию (H(2df)=7,91; p=0,02). В последнем случае тест Манна-Уитни продемонстрировал значительное отличие между крысами, подвергнутыми обработке морфином, и крысами, подвергнутыми обработке носителем (U=1; p=0,001). С другой стороны, не существует значительного отличия между крысами, подвергнутыми обработке опиорфином, и контролями, подвергнутыми обработке носителем (U=31; р=0,92).

После продолжительной обработки анальгетическими дозами опиорфина у крыс не развилось значительное предпочтение по отношению к компартменту, исходно установленному как непредпочтительный. Действительно, эти крысы проводили столько же много времени в не предпочтительном компартменте как во время исходной фазы претеста (тест Уилкоксона: z=1,54; p=0,12). С другой стороны, после продолжительной обработки с помощью анальгетических доз морфина у крыс развилось значительное предпочтение к местонахождению по отношению к компартменту, во время претеста исходно установленному как непредпочтительный (z=2,52; p=0,012).

Таким образом, в эффективных анальгетических дозах в «Формалиновом Тесте» опиорфин не вызывает фармакозависимости в отличие от морфина. Повторное введение опиорфина в дозах 1 мг/кг не индуцирует значительного негативного эффекта типа привыкания в тесте на предпочтение мест введения психоактивного вещества.

Пример 6. Отсутствие антиноцицептивного привыкания к опиорфину в тесте отдергивания хвоста

- Материалы и Методы

В данном использовали исследовании самцов крыс линии Вистар (Харлан, Франция) весом 250-280 г на момент начала эксперимента. После 7-дневного периода акклиматизации их взвешивали и размещали случайным образом согласно группам обработки в помещение с 12-ти часовым циклом изменения света/темноты (21:00 вечера/9:00 утра), контролируемой температурой (21±1°С) и влажностью (50±5%). Пища и вода были в свободном доступе. Экспериментальному тестированию их подвергали только однократно. Поведенческие тесты, уход за животными и эвтаназию исследуемых животных осуществляли согласно инструкциям Директивы Европейского Сообщества 86/609/ЕЕС и Этического Комитета ASAB для применения лабораторных животных в поведенческом исследовании 71:245-53.

Опиорфин (Genosphere Laboratory, Франция) растворяли в растворе носителя (55% PBS 100 мМ - 45% уксусной кислоты 0,01 N) и системно инъецировали за 5-15 мин перед поведенческими тестами в дозах, колеблющихся от 0,5 до 2 мг/кг веса тела. Морфин HCl, приобретенный у «Francopia» (Франция), растворяли в солевом растворе (0,9% хлорид натрия в дистиллированной воде) и инъецировали посредством внутривенного пути за 15 мин до поведенческого теста в дозе 1-2 мг/кг. Налоксон (опиоидный антагонист центрального и периферического действия), приобретенный у «Sigma Chemical» (Франция), и растворяли в солевом растворе и вводили подкожно в количестве 3 мг/кг за 15 мин до введения опиорфина. Налтриндол ( -опиоидный антагонист), Нор-Бинаторфимин ( -опиоидный антагонист) и «СТАР» (µ-опиоидный антагонист), приобретенные у «Sigma Chemical» (Франция), растворяли в солевом растворе и вводили в количестве 10 мг/кг интраперитонеально за 20 мин; 5 мг/кг интраперитонеально за 3 часа и 0,8 мг/кг внутривенно за 25 мин до тестов соответственно. Все лекарственные средства вводили в количестве 1 мл/кг веса тела.

Тест отдергивания хвоста, оценивающий время, требуемое для реакции на внезапный тепловой раздражитель, предпочтительно отражает ноцицептивный спинальный рефлекс. Использовали стандартный прибор для теста отдергивания хвоста (Harvard Apparatus LTD, Эденбридж, Англия) с источником теплового излучения, связанного с автоматизированным анальгезиметром для теста отдергивания хвоста. Крыс приучали к предлагаемой ситуации в течение двух 2-минутных сеансов за день перед тестом. В день эксперимента их мягко удерживали руками так, чтобы источник теплового излучения сфокусировался на хвосте. Ранее отрегулированная интенсивность теплового стимула была установлена на 30% для получения базального латентного периода отдергивания хвоста <2-3 сек. В этих экспериментальных условиях и по отношению к морфину было установлено время отключения 5 сек для предотвращения поражения ткани. Для каждого поведенческого теста использовали крысу как ее собственный контроль и проводили 2 последовательных измерения, разделенных интервалами 30 секунд перед инъекцией опиорфина, морфина или носителя для оценки базального периода латентности при отдергивании хвоста. В день тестирования крысы получали внутривенное введение одного из следующих свежеприготовленных растворов: раствор носителя, 1 мг/кг морфина или 2 мг/кг опиорфина. Для индукции привыкания крысы получали ежедневно внутривенное введение свежих приготовленных растворов в течение семи последовательных дней. Результаты выражали в виде средних значений латентного периода при отдергивании хвоста ± стандартная средняя ошибка для n=6 крыс.

Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная средняя ошибка. Значимость отличий между группами оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса по рядам (ТКУ, непараметрический метод) для сравнения между несколькими переменными в экспериментальных условиях. Когда получали значимое отличие среди обработок, применяли апостериорный тест Манна-Уитни (ТМУ) для определения того, какая группа внесла вклад в эти отличия путем сравнения каждой группы, подвергнутой обработке, с контрольной группой (носитель или базальные величины). Использовали непараметрический тест Уилкоксона с согласованными парами (ТУ) для сравнения двух парных переменных с повторными измерениями в группе каждой обработки. Для всех статистических оценок уровень значимости установили на уровне Р<0,05. Все статистические анализы проводили с использованием компьютерной программы «StatView®5» пакета программ обработки статистических данных (SAS, Institute, Inc., США).

- Человеческий опиорфин демонстрирует антиноцицептивный эффект в тесте отдергивания хвоста

Тест отдергивания хвоста измеряет время, требуемое для реакции на болезненный тепловой раздражитель. Латентный период отдергивания хвоста определял тепловой ноцицептивный порог, который функционально связан с болевой реакцией на вреднодействующие стимулы. Индуцированное лекарственным средством ослабление реакции отдергивания хвоста представляет собой предварительное подтверждение для болевой антиноцицепции, которая предпочтительно интегрирована на спинальном уровне. Целью исследования было оценить потенциал и продолжительность анальгетического эффекта опиорфина по сравнению с морфином с использованием теста отдергивания хвоста крыс.

Для этого исследования выбрали системную дозу опиорфина 2 мг/кг с целью исследования максимальной реакции в отношении продолжительности действия в тесте отдергивания хвоста на крысах. Эту дозу оценивали согласно предварительным данным, демонстрирующим, что опиорфин индуцировал значительные дозозависимые антиноцицептивные реакции с максимальным эффектом при 2 мг/кг. Периоды латентности отдергивания хвоста оценивали для 4 различных моментов времени: через 5, 15, 25 и 60 мин после введения опиорфина или носителя по сравнению с морфином (1 мг/кг, внутривенно).

На фигуре 2 продемонстрирован средний период латентности отдергивания хвоста как функция от времени при условиях обработки опиорфином, или морфином, или носителем (n=6 крыс на группу). Базальные величины, соответствующие преинъекции, не отличались значительным образом между 3 группами (Р=0,54 согласно тесту Краскела-Уоллиса). Аналогично, никакого значительного отличия не проявлялось между средними периодами латентности 3 групп в момент времени через 5 минут после инъекции (Р=0,34). С другой стороны, однофакторный анализ Краскела-Уоллиса обнаружил значительный эффект обработок через 15, 25 и 60 минут после инъекции (Р=0,005, Р=0,005 и Р=0,02 соответственно). Сравнения последовательных индивидуальных средних значений периодов латентности отдергивания хвоста между крысами, подвергнутыми обработке опиорфином или морфином, и контрольными крысами, подвергнутыми обработке носителем, выявили, что период латентности значительно увеличивался через 15 и 25 минут после введения как опиорфина, так и морфина: от 2,57±0,10 и 2,51±0,06 секунд для носителя до 3,56±0,32 секунд и 3,29±0,15 секунд, Р=0,01 и Р=0,008 против носителя, соответственно для морфина; и до 3,12±0,07 секунд и 3,19±0,07 секунд, Р=0,005 и Р=0,004 против носителя, соответственно для опиорфина согласно тесту Манна-Уитни (ТМУ). Он еще оставался значительным через 60 минут для морфина (Р=0,01 против носителя), в то время как имелась тенденция к увеличению для опиорфина (Р=0,08 против носителя). Крысы, подвергнуты обработке опиорфином, не отличались значительным образом по латентности реакции от крыс, подвергнутых обработке морфином через 15, 25 и 60 минут после обработки (Р=0,20, Р=0,34 и Р=0,26 против морфина согласно тесту MWT соответственно).

Кроме того, сравнение с соответствующими базальными величинами перед инъекцией продемонстрировало, что латентный период отдергивания хвоста значительно увеличивался через 5, 15 и 25 минут после обработки морфином (Р=0,05, Р=0,03 и Р=0,05 согласно тесту Уилкоксона ТУ соответственно). С другой стороны, обработка опиорфином индуцировала значительное увеличение латентного периода реакции в моменты времени через 15 и 25 мин после инъекции (Р=0,03 и Р=0,03 согласно тесту ТУ, соответственно). Интересно, что сравнение с соответствующей базальной реакцией для контрольной группы обнаружило значительный временной эффект на тепловой болевой порог после повторного воздействия теста, т.е. нарастающее уменьшение латентного периода отдергивания хвоста. Уменьшение болевого порога по отношению к повторному стимулу может отражать болезненную сенсибилизацию или изменение поведения в результате стимула, приводящее к облегчению ноцицептивной реакции у этих животных. Усиленная ноцицептивная реакция на тепловой стимул после повторных измерений полностью отменялась у крыс, подвергнутых обработке опиорфином, подобно морфину, подтверждая его анальгетический потенциал при внезапной тепловой боли.

В парадигме отдергивания хвоста крысами, максимальный анальгетический эффект опиорфина (2 мг/кг внутривенно) возникал через 15-25 мин после внутривенного введения и по величине находился в том же интервале, что и у морфина (1 мг/кг внутривенно), а также в том, что касается амплитуды и продолжительности действия. Это демонстрирует, что опиорфин ингибирует поведение внезапной боли, вызванное тепловым ожогом, которое контролируется спинальными энкефалинергическими сигнальными путями.

- Сравнение возникновения антиноцицептивного привыкания между продолжительными обработками Человеческим Опиорфином и морфином в тесте отдергивания хвоста

Целью эксперимента было исследование с использованием теста отдергивания хвоста потенциального проявления опиорфин-индуцированного антиноцицептивного привыкания. Для индукции привыкания крысы получали ежедневное внутривенное введение опиорфина (2 мг/кг), морфина (1 мг/кг) или носителя в течение семи последовательных дней. Затем измеряли латентный период отдергивания хвоста в момент времени максимального эффекта, т.е. через 15 мин и 25 мин после разрешающей дозы.

Сравнивая базальные величины перед инъекцией, не наблюдали никаких значительных отличий между средними латентными периодами отдергивания хвоста у 3 групп (Р=0,54 в день 1 и Р=0,14 в день 7 согласно ТКУ, n=6 крыс/на группу). В то время как анализ Краскела-Уоллиса обнаружил значительный эффект обработки в латентном периоде отдергивания хвоста среди 3 групп (Р=0,005 в день 1; Р=0,003 в день 7 в моменты времени через 15 и 25 минут после инъекции соответственно). При сравнении профиля реакции во времени между днем 7 и днем 1, периоды латентности отдергивания хвоста оставались стабильными (Р>0,99 согласно тесту Уилкоксона, ТУ) для группы обработки носителем, с тенденцией к уменьшению периодов латентности для групп обработки морфином (Р=0,06) и с тенденцией к увеличению для групп обработки опиорфином (Р=0,06 согласно ТУ) после ежедневного повторения обработок (фигура 3).

При сравнении с группой обработки носителем наблюдали значительное увеличение латентных периодов реакции после однократного внезапного введения морфина или опиорфина в первый день (Р=0,01 или Р=0,01, соответственно согласно апостериорным сравнениям ТМУ в моменты времени через 15 и 25 минут после инъекции). Через 7 последовательных дней непрерывного введения, морфин и опиорфин все еще были способны индуцировать значительное увеличение реакции отдергивания хвоста через 15 и 25 мин после инъекции по сравнению с непрерывным введением носителя (Р=0,02 и Р=0,004 соответственно). Однако морфин-индуцированное увеличение имело тенденцию снижаться по сравнению с реакцией, индуцированной опиорфином (Р=0,08 согласно ТМУ в момент времени через 15 мин после инъекции).

С другой стороны, сравнение с соответствующими базальными величинами, соответствующими периоду перед инъекцией, продемонстрировало, что через 7 дней непрерывных обработок период латентности отдергивания хвоста оставался стабильным через 15 минут после разрешающей дозы морфина и значительно уменьшался в момент времени через 25 минут после введения (Р=0,69 и Р=0,03 согласно ТУ), отражая отсутствие антиноцицептивного потенциала морфина после непрерывного введения. В тех же экспериментальных условиях разрешающая доза опиорфина значительно увеличивала реакцию отдергивания хвоста через 15 мин после инъекции (Р=0,03 согласно ТУ), тогда как, по-видимому, она не обладала значительным эффектом через 25 мин после инъекции (Р=0,67). Таким образом, анальгетическая интенсивность опиорфина оставалась неизменной после непрерывной обработки, в то время как, по-видимому, наблюдалось уменьшение продолжительности антиноцицептивной реакции.

В заключение, в отличие от морфина, непрерывное системное введение опиорфина (2 мг/кг, внутривенно), вводимого один раз в день в течение 7 дней не индуцирует развития привыкания к максимальному антиноцицептивному эффекту в тесте отдергивания хвоста у крыс.

Пример 7. Заключение

Таким образом, экспериментальные данные, представленные выше, демонстрируют, что опиорфин проявляет при внутривенном введении в количестве 1 мг/кг сильную и стимулирующую антиноцицептивную активность посредством активации опиоидергических сигнальных путей, зависящих от эндогенных µ-опиоидных рецепторов. Этот результат подтверждали с помощью трех аналитических моделей резкой поведенческой реакции у крыс «Теста причинения боли булавкой» (резкая механическая боль), «Формалинового теста» (хроническая воспалительная боль химического происхождения) и «Теста отдергивания хвоста» (резкая боль теплового происхождения). В этих тестах опиорфин способен индуцировать максимальный анальгетический эффект, который индуцирует морфин (2-6 мг/кг интраперитонеально), без индуцирования какого-либо из основных побочных эффектов морфина, т.е. антиперистальтического эффекта, эффекта фармакозависимости и эффекта привыкания (Rougeot С., Proceedings of the 4th International Peptide Symposium; J. Wilce (Editor) on behalf of the Australian Peptide Society, 2007). Кроме того, специфический (не противовоспалительный) и ясно выраженный анальгетический эффект опиорфина в тесте постоянной боли химического происхождения идет на пользу потенциального антиноцицептивного действия опиорфина при тяжелой невропатической боли.

Кроме того, в аналитической модели поведенческого отчаяния у самцов крыс, авторы изобретения продемонстрировали, что опиорфин дополнительно к психостимулирующему эффекту проявляет специфический антидепрессантный эффект при внутривенном введении опиорфина в количестве 1 мг/кг, посредством активации опиоидергических сигнальных путей, зависимых от эндогенных -опиоидных рецепторов. Эффект опиорфина в данном тесте является специфическим, так как крысы, подвергнутые обработке с такой же дозой, не проявляли никакой реакции типа амнезии, седативного эффекта или гиперактивности в различных подходящих поведенческих тестах.

Противоболевой, антидепрессантный и психостимулирующий эффекты опиорфина зависят от активации эндогенных µ- и -опиоидных рецепторов, которые опосредуют действие эндогенных энкефалинов, высвобождаемых в ответ на стимул (боль, стресс, эмоции ).

Кроме того, опиорфин при внутривенной дозе 1 мг/кг не демонстрирует никакой анксиолитической активности во время теста условного защитного зарывания у самцов крыс.

В заключение, в тесте на предпочтение мест введения психоактивного вещества и при эффективных анальгетических дозах в формалиновом тесте опиорфин не вызывает какой-либо значительной фармакозависимости. Повторное введение 1 мг/кг опиорфина не индуцирует какого-либо побочного эффекта типа привыкания и/или устойчивости к лекарственному средству в отличие от морфина.