способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани

Формула изобретения

Способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, включающий культивирование мезенхимальных стромальных клеток человека в среде DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, в присутствии провоспалительных факторов TNF- в концентрации 20 нг/мл и IFN- в концентрации 30 нг/мл, характеризующийся тем, что культивирование проводят в атмосфере, состоящей из 5% CO₂ и 95% воздуха, при температуре 37°С в течение 48 часов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к биофармакологии и медицине и заключается в новом способе повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток.

В последнее время обнаружено, что мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки (МСК) обладают антивоспалительными и иммуносупрессивными свойствами, выражающимися в подавлении пролиферации активированных Т-лимфоцитов, в подавлении созревания дендритных клеток, снижении способности В-клеток секретировать иммуноглобулины.

Иммуносупрессивные свойства МСК в нормальных условиях не выражены, а проявляются вследствие воздействия провоспалительного микроокружения, а именно в присутствии активированных лимфоцитов и секретируемых ими провоспалительных белковых факторов - цитокинов, например IL-1, TNF-alpha, IFN-gamma. В научной литературе достаточно подробно исследовано влияние активированных Т-клеток и продуцируемых ими цитокинов на МСК (Ren G., Zhang L., Zhao X., Xu G., Zhang Y., Roberts A.L, Zhao R.C., Shi Y.. Cell Stem Cell. 2008; 2: 141-150). При этом воздействие различных факторов определяет фенотипические изменения в МСК, уровень их неспецифической иммуносупрессорной активности, способность ингибировать деление и функции отдельных субпопуляций клеток иммунной системы, а также уровень в МСК эффекторных молекул, непосредственно отвечающих за иммуносупрессорное действие на активированные Т-клетки и другие типы иммунных клеток (Kang J.W., Kang K.S., Koo Н.С., Park J.R., Choi E.W., Park Y.H.. Stem Cells Dev. 2008; 17:681-693; Hemeda H., Jakob M., Ludwig A.K., Giebel В., Lang S., Brandau S.. Stem Cells Dev. 2010; 19: 693-706). При этом воздействие только одного из факторов, например рекомбинантного цитокина интерферона гамма, либо фактора некроза опухоли альфа, на МСК приводит только к незначительному проявлению иммуносупрессорной активности, которая задействует отдельные ветви иммуносупрессорной программы. Так, в частности, воздействие IFN-g на МСК приводит к селективному повышению уровня фермента IDO, метаболизирующего триптофан и неспецифически ингибирующего деление активированных Т-клеток. В то же время обработка МСК TNF-a запускает механизм, базирующийся на повышении уровня другого фермента, индуцируемой NO-синтазы, которая синтезирует оксид азота (II), оказывающий токсическое действие на лимфоциты и другие клетки иммунной системы (Chen W.. Nat. Immunol. 2011; 12: 809-811).

Близким аналогом данного изобретения является способ ингибирования Т-клеточного ответа на антиген, включающий культивирование мезенхимальных стволовых клеток в присутствии низких концентраций IFN-g (US6797269). Низкие концентрации этого цитокина значительно увеличивают способность МСК презентировать на своей поверхности антигенные пептиды, но не содержат на своей поверхности достаточного уровня ко-стимулирующих молекул, необходимых для эффективной активации Т-клеток. Инкубация таких антиген-презентирующих МСК с Т-клетками в процессе активации с помощью антигена индуцирует в последних анергическое состояние, то есть неспособность к эффективной активации. Кроме того, модифицированные МСК предлагается использовать в качестве вектора для направленного действия на активированные Т-клетки молекул, негативно влияющих на антиген-специфическую активацию, в частности, белка CTLA-4.

Кроме того, известно, что необработанные МСК могут быть использованы для подавления реакции «трансплантат против хозяина» и других аутоиммунных состояний человека (US 6368636). Следует отметить, что представленный выше аналог использует принципиально другой способ получения иммуносупрессорных МСК, заключающийся в направленном угнетении антиген-зависимой активации именно Т-клеток. Этот способ не позволяет получить клетки, обладающие иммуносупрессорной активностью в отношении широкого спектра иммунных клеток, в том числе и лимфоцитов.

Настоящее изобретение представляет собой новый способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, состоящий в активации МСК путем инкубации в присутствии комбинации сразу двух провоспалительных белков-цитокинов TNF- и IFN- . Преимущество данного способа заключается в значительном увеличении неспецифической иммуносупрессорной активности МСК в отношении различных типов иммунных клеток человека, по сравнению с необработанными МСК и МСК, обработанных только IFN- , либо только TNF- .

Задачей изобретения является разработка нового способа получения МСК из жировой ткани человека, которые обладают повышенными по сравнению с нормальными МСК, иммуносупрессорными свойствами.

Техническим результатом изобретения является получение с помощью разработанного нового способа культур МСК жировой ткани человека, которые обладают повышенной иммуносупрессорной активностью, то есть способностью подавлять функции и деление активированных клеток иммунной системы человека.

Кроме того, обработка не одним, а комбинацией из сразу двух белков-цитокинов IFN-g и TNF-a, позволяет существенно увеличить иммуносупрессорную активность МСК за счет синергетического эффекта и включения сразу нескольких эффекторных механизмов. Такая усиленная неспецифическая ингибирующая активность полученных новым способом иммуносупрессорных МСК может существенно расширить круг их возможного использования по сравнению с аналогами и добиться лучших результатов, используя меньшее число клеток.

Поставленная техническая задача решается тем, что способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, включает культивирование мезенхимальных стромальных клеток человека в присутствии провоспалительных факторов TNF- и IFN- .

Поставленная задача решается также тем, что при осуществлении упомянутого выше способа, культивирование МСК проводят в среде DMEM/F12, содержащей дополнительно антибиотик, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки.

Частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, характеризующийся тем, что в качестве антибиотика среда содержит 100 ед/мл пенициллина или стрептомицина, или их комбинацию в концентрациях 100 ед/мл каждого.

Другим частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, характеризующийся тем, что культивирование проводят в атмосфере, состоящей из 4,5-5,5% CO₂ и 94,5-95,5% воздуха, при температуре 35-38°С в течение 40-50 часов.

Другим частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, характеризующийся тем, что провоспалительные факторы TNF- используют в концентрации 10-40 нг/мл и IFN- используют в концентрации 10-40 нг/мл.

Другим частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, характеризующийся тем, провоспалительные факторы TNF- используют в концентрации 15-25 нг/мл и IFN- в концентрации 25-35 нг/мл.

Изобретение в общем виде может быть реализовано следующим образом: мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека следует культивировать in vitro; культивированные клетки можно проинкубировать в CO ₂ - инкубаторе (5% CO₂; 95% воздуха), в частности, при 37°С в течение 48 часов в присутствии TNF-alpha IFN-gamma; иммуносупрессорные свойства полученных МСК можно оценить путем их сокультивирования с предварительно активированными лейкоцитами крови человека.

Согласно настоящему изобретению провосполительные факторы TNF- и IFN- могут присутствовать в среде для культивирования в различных концентрациях, предпочтительно в концентрации 10-40 нг/мл, наиболее предпочтительно 15-35 и 25-35 нг/мл соответственно.

Согласно настоящему изобретению могут быть использованы любые культуры мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Выделение мезенхимальных стромальных клеток может быть осуществлено стандартными способами, хорошо известными специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение (например, как описано Priya N, Sarcar S, Majumdar AS, Sundarraj S.J Tissue Eng Regen Med. 2012 Vol.27, pp.1-9), и не ограничивается описанными ниже примерами.

Состав среды для культивирования согласно настоящему изобретению не ограничен каким-либо специальным образом, для культивирования может быть использована любая среда, содержащая компоненты, необходимые для роста мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, в частности, может быть использована коммерчески доступная среда DMEM/F12.

Пример конкретного выполнения настоящего изобретения.

1. Выделение и культивирование мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани in vitro

Подкожный жир человека (от 0,5 до 10 мл) собран в ходе хирургической операции в операционных помещениях с соблюдением правил асептики и антисептики. Выделение клеток из полученного в результате операции материала проведено в стерильных условиях ламинарного бокса.

Основные этапы включают:

Измельчение ткани в тканевом дезинтеграторе gentleMACSdissiciator (Myltenyi Biotec) до консистенции суспензии мелких (размером не более 2 кубических миллиметров)кусочков.

Смешивание измельченной жировой ткани с раствором коллагеназы I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед/мл, Sigma, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2.

Инкубирование образца в CO₂-инкубаторе (5% СО₂; 95% воздуха) при 37°С в течение 30-45 мин при постоянном встряхивании.

Добавление по окончании инкубации равного объема среды DMEM/F12, содержащей 100 ед./мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (HyClone), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone).

Центрифугирование полученного образца при 200 g в течение 5 мин.

Удаление с помощью вакуумного насоса белесого поверхностного слоя, состоящего из зрелых адипоцитов и кусочков ферментативно необработанной ткани.

Суспендирование осадка, состоящего из клеток стромы жировой ткани и клеток сосудистой стенки и крови, в стерильной деионизованной воде для лизирования эритроцитов.

Добавление для восстановления осмотического давления в образце 10-кратного объема среды DMEM/F12.

Фильтрование полученной суспензии клеток через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Falcon Cell Strainer, США).

Центрифугирование фильтрата при 200 g 5 мин.

Удаление супернатанта.

Определение концентрации выделенных из подкожной жировой ткани первичных клеток с помощью камеры Гаряева под микроскопом или с помощью автоматического счетчика клеток (Countess, Invitrogen) при температуре воздуха +20 - +25°С и относительной влажности 40-70%.

Ресуспендирование осадка в среде роста DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (HyClone), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) до концентрации 5×10⁴ фрагментов/см³.

Высаживание полученной суспензии на чашки Петри (Coming Costar) и инкубирование при 37°С, 5% СО₂ в CO₂-инкубаторе в течение 2 суток.

Смена среды в чашках Петри для удаления неприкрепившихся клеток. Выход клеток должен составлять 4-7×10 ⁴ прикрепившихся клеток на 1 мл ткани. Смена ростовой среды проводится каждые 2-3 дня до достижения 70-80% плотности монослоя.

Удаление ростовой среды из чашек Петри.

Двукратная промывка монослоя раствором DPBS (HyClone).

Обработка монослоя смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% ЭДТА (1:1) (HyClone).

Инкубирование в течение 15 мин при 37°С, 5% CO₂ в CO₂-инкубаторе.

Суспендирование прикрепившихся клеток с помощью пипетирования.

Определение концентрации суспензии культивируемых мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека с помощью камеры Гаряева под микроскопом или с помощью автоматического счетчика клеток (Countess, Invitrogen) при температуре воздуха +20 - +25°С и относительной влажности 40-70%.

Добавление в полученную суспензию клеток 3-кратного от первоначального объема ростовой среды.

Высаживание суспензии на чашки Петри в соотношении 1:3.

2. Выделение, культивирование и активация иммунных клеток in vitro

С согласия здоровых доноров в стерильные флаконы (Corning Costar), содержащие стерильный раствор ЭДТА в количестве 1,2-2 мг/мл крови, рН 7,2 забирали 10-25 мл периферической крови из локтевой вены.

Основные этапы:

Разведение нативной венозной крови 0,01М стерильным раствором PBS (рН 7,2) в соотношении 1:1.

Внесение в 50-мл конические пробирки (Coming Costar) 20 мл Ficoll Paque® (Pharmacia Biotech) плотностью 1,077.

Наслоение разведенной суспензии клеток крови на Ficoll Paque® в соотношении 1,5:1.

Центрифугирование суспензии клеток крови в градиенте плотности Ficoll Paque® при 400 g 30 мин.

Перенесение клеток, располагающихся в интерфазе, в новую 50-мл пробирку, добавление 50 мл раствора HBSS (HyClone).

Осаждение клеток центрифугированием при 200 g в течение 5 мин.

Удаление супернатанта.

Ресуспендирование осадка в 50 мл раствора HBSS и центрифугирование при 200 g в течение 5 мин.

Ресуспендирование осадка в DPBS (HyClone).

Определение концентрации суспензии культивируемых мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека с помощью камеры Гаряева под микроскопом или с помощью автоматического счетчика клеток (Countess, Invitrogen) при температуре воздуха +20 - +25°С и относительной влажности 40-70%.

Разведение суспензии клеток крови до концентрации 1×10⁷ клеток средой DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (HyClone), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone).

Добавление для активации полученной суспензии клеток фитогемагглютинина (РНА, Sigma) до конечной концентрации 10 мкг/мл.

Инкубирование образца в CO₂-инкубаторе (5% СО₂; 95% воздуха) при 37°С в течение 2 ч.

Осаждение суспензии активированных клеток крови центрифугированием при 200 g в течение 5 мин.

Ресуспендирование осадка в 50 мл раствора HBSS, центрифугирование при 200 g в течение 5 мин.

Ресуспендирование осадка в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (HyClone), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) до концентрации 1×10⁷ клеток и высаживание на чашки Петри с прекокультивированными МСК.

Инкубирование в CO₂ - инкубаторе (5% СО₂; 95% воздуха) при 37°С в течение 48 часов

3. Активация МСК in vitro с помощью провоспалительных цитокинов TNF-alpha, IFN-gamma

Добавление к монослою выделенных и ко-культивированных МСК TNF-alpha в концентрации 20 нг/мл и IFN-gamma в концентрации 30 нг/мл.

Инкубирование в CO₂ - инкубаторе (5% СО₂; 95% воздуха) при 37°С в течение 48 часов.

После инкубации клетки обрабатывают раствором трипсина в растворе Версена (раствор ЭДТА в PBS), что приводит к их откреплению от клеточной поверхности, промывают культуральной средой, содержащей 5-10% сыворотки. Полученные таким образом клетки можно использовать для оценки их иммуносупрессорной активности, в частности способности подавлять деление активированных Т-клеток, и продукции этими клетками цитокинов.