способ определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения in vitro

Формула изобретения

Способ определения антиоксидантной активности эфирного масла пихты сибирской (Abies Sibirica) in vitro, заключающийся в использовании в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы и каталазы для определения антиоксидантной активности по соотношению скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества, которое должно быть больше 1, отличающийся тем, что предварительно перед добавлением в инкубационную среду образцы эфирного масла пихты сибирской разводят диметилсульфоксидом в соотношении 1:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии.

Совершенствование и создание новых методов экспериментальной оценки фармакологических веществ, а также новые источники получения потенциальных лекарственных средств, значительно расширяют принципиальные возможности фармакотерапии основных заболеваний человека.

Эфирные масла - это вещества сложного химического состава, широко использующиеся в производстве косметических товаров, средств гигиены и медицинских препаратов, что обусловлено наличием в них биологически активных компонентов. Например, противокашлевое действие эфирного масла багульника болотного связано с содержанием в эфирном масле сесквитерпенового спирта ледола.

Компонентный состав является важнейшей характеристикой эфирного масла и определяет все его полезные свойства антифунгальные, гипотензивные, цитотоксические, противовоспалительные, противомикробные, рострегулирующие, инсектицидные.

В литературе редко встречается совместное описание состава эфирного масла и его биологического действия, упоминается эфирное масло как таковое и идет речь о его биологических свойствах, при этом полностью отсутствуют данные о химическом составе того образца, с которым проводились те или иные испытания [Белоусова Н.И. Химический состав эфирного масла багульников / Белоусова Н.И., Хан В.А., Ткачев А.В. // Химия растительного сырья. - 1999. - № 3. - С.5-38]. Между тем выявление биологической активности эфирных масел, в том числе, выделенного из древесной зелени пихты (Abies Sibirica), осуществимо лишь при условии детального изучения химического состава и его влияния на фармакологическую активность на этапе экспериментальных исследований.

Пихта сибирская является одним из самых распространенных эфироносов в России, при переработке хвои которой можно получить высококачественное эфирное масло, способное влиять на концентрации легких отрицательных ионов, благоприятно действующих на человека, и выполняющее функцию по "обеспечению" атмосферного воздуха биологически активным кислородом.

В настоящее время имеются способы исследования определения биологических свойств эфирных масел, в том числе с использованием микроорганизмов.

Известен стандартный микробиологический метод хемолюминесценции, позволяющий выявлять вещества, обладающие антиоксидантной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используют перитонеальные макрофаги [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Минздрав РФ, 2000 г.].

Известен способ определения антиоксидантной активности (пат. РФ № 2144674) супероксиддисмутазы и химических соединений путем оценки их способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде, которую оценивали спектрофотометрически по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в отсутствии и присутствии исследуемых препаратов. Антиоксидантную активность определяют по накоплению продукта аутоокисления адреналина, поглощающего при длине волны 347 нм (волновое число 28,8). Добавляют адреналин, используя готовую аптечную форму 0,1% раствора адреналин гидрохлорида pH среды, в которой проводят реакцию, составляет не менее 10,65 ед. Реакцию проводят при любой комнатной температуре, но не ниже 15°C. Опытным путем было установлено, что коммерческий препарат СОД, гемолизат эритроцитов, известные антиоксиданты (аскорбат, цистеин) способны ингибировать процесс накопления этого соединения, что позволяет использовать этот способ измерения как тест-систему для экспресс оценки антиоксидантных свойств различных препаратов и химических соединений. Существенным преимуществом предлагаемого подхода является возможность использования легкодоступных, недорогих химических реактивов: 0,1% аптечного раствора гидрохлорид адреналина и 0,2 М карбонатного буфера, pH 10,65.

Исследование биологической активности БАВ из экстрактов растительного сырья описано в пат. РФ № 2115425. Так, например, исследования по изучению антиоксидантной активности БАВ проводилось на нейтрофилах крови. Индуцировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом. Препараты, ингибирующие индуцированный кислородный взрыв, по литературным данным, обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Исследование проводилось на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл растворов люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови). В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминесценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат в конечной концентрации 0,5% и замерялось изменение люминесценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат. В результате было установлено, что БАВ достоверно ингибирует в клетках крови активные формы кислорода, участвующие в воспалительных реакциях в организме. Фоновая люминесценция сыворотки крови и препарата ничтожно мала и не влияет на полученный результат. Так как растительный экстракт БАВ достоверно ингибирует индуцированный зимозаном кислородный взрыв, его можно отнести к группе препаратов, обладающих антиоксидантной, противовоспалительной активностью, и он может быть использован в качестве профилактического средства при воздействии повышенных температур.

Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является большая трудоемкость и необходимость постоянного контроля за сохранностью и чистотой стандартных тест-объектов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.

Наиболее близким способом к заявляемому относится известный способ выявления веществ (пат. РФ № 2181892), обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов. В качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу (ГР) и один из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП) и каталаза (КАТ), определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.

Так как эфирные масла - это вещества сложного химического состава, то недостатком прототипа является невозможность определения биологической активности эфирного масла пихты сибирской, в том числе антиоксидантной активности.

Выявление биологической активности эфирных масел должно сопровождаться детальным исследованием химического состава, изучением биологической активности отдельных фракций эфирного масла.

Использование высокочувствительных ферментных тест-систем in vitro позволяет определять не только антиоксидантную активность эфирного масла в целом, но и фракций, отобранных в процессе отгонки, что позволяет контролировать наличие биологической активности в многокомпонентных эфирных маслах растительного происхождения, в том числе их фракций, т.к. не всегда известно сочетанное действие компонентов и направленность их биологического действия.

Целью данного изобретения является повышение точности определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения с помощью тест-объектов, таких как ГР и КАТ.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения in vitro, заключающийся в использовании в качестве тест-объектов ферментов ГР и КАТ для определения антиоксидантной активности по соотношению скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества, которое должно быть больше 1, при этом предварительно перед добавлением в инкубационную среду образцы эфирного масла разводят диметилсульфоксидом в соотношении 1:1.

Предлагаемый способ позволяет определить биологическую активность таких химически сложных смесей, как эфирные масла растительного происхождения in vitro.

В доступных источниках научно-технической и патентной информации не выявлены сведения об определении биологической активности эфирного масла растительного происхождения с помощью тест систем in vitro. Поэтому предлагаемое техническое решение способа обладает новизной и соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень".

Способ определения биологической активности эфирного масла растительного происхождения в соответствии с изобретением осуществляется на примере эфирного масла пихты сибирской следующим образом.

Эфирное масло получали известным способом из древесной зелени пихты сибирской (Abies Sibirica) методом исчерпывающей гидропародистилляции в течение 20 часов с использованием цельнометаллической установки с насадкой Клевенджера. Разовая загрузка воздушно сухого исходного сырья составляла не менее 1,00 кг. Фракции эфирного масла отбирали в процессе получения эфирного масла следующим образом: первую фракцию получали в течение 30 минут от начала выделения масла; вторую - после двух часов; третью - через четыре часа; четвертую - после 5 часов; пятую - через восемь часов.

Состав эфирного масла в его отдельных фракциях определяли методом хроматомасс-спектрометрии на приборе Agilent Technologies 6890.

Биологическую активность исследуемого эфирного масла определяли с помощью молекулярных тест-систем in vitro, в которых в качестве тест-объектов использовали ферменты системы антиоксидантной защиты: ГР и КАТ [пат. РФ № 2181892].

Использованы молекулярные тест-системы in vitro прототипа, в которых в качестве тест-объектов применяли ферменты системы антиоксидантной защиты: ГР и КАТ. Эти ферменты играют ключевую роль в обеспечении регуляции свободно радикального окисления клетки и могут служить мишенью для лекарственных средств. Ингибирование ферментов антиоксидантной защиты способствует накоплению радикалов в патогенной клетке, что вызывает пероксидацию белков и нуклеиновых кислот и приводит к остановке роста и гибели клетки, поэтому способность активировать КАТ и ГР связано с наличием антиоксидантных свойств изучаемого эфирного масла, в том числе и пихты сибирской.

Каталитическую активность каталазы определяли по скорости разложения субстрата - перекиси водорода (H₂O₂). В состав реакционной смеси входил фосфатный буфер (pH 7,8), H₂O₂ в концентрации - 0,03%, концентрация фермента составляла 0,2 мкг/мл. Продолжительность реакции разложения субстрата (H₂O₂) ферментом 5-10 мин. Реакцию останавливали добавлением в реакционную смесь аммонния молибденовокислого ((NH₄)₆Mo ₇O₂₄·4H₂O). Оставшуюся перекись водорода измеряли в виде комплекса с (NH₄)₆ Mo₇O₂₄·4H₂O на спектрофотометре Shimadzu MPS-2000 при =410 нм.

Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР) определяли в кварцевых кюветах при спектрофотометрической регистрации убыли НАДФН при =340 нм. Инкубационная среда состояла из буфера 0,05М трис-(оксиметил)-аминометан - HCl, содержащего 0,25 mM ЭДТА -Na, pH - 7,4 и 0,033М глутатиона окисленного (Г-SS-Г). Реакцию запускали добавлением 2 mM НАДФН. Продолжительность записи реакции - 1-1,5 мин.

Для эффективного определения биологической активности эфирного масла необходимо провести пробоподготовку. Для улучшения смешиваемости эфирного масла с компонентами инкубационной пробы, эфирное масло разводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) перед добавлением в инкубационную среду. Как выяснилось в результате эксперимента, ДМСО в наименьшей степени оказывает влияние на указанные ферменты, что позволяет более точно проводить анализ. Количество ДМСО при разведении эфирного масла, позволяющего в полной мере выявлять биологическую активность эфирного масла определено в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл. Также были проведены опыты с использованием спирта и ПАВа в качестве разбавителя тест-объектов. Но при этом выбранные разбавители оказывали влияние на указанные ферменты, что не позволяло объективно определить их биологическую активность.

Сопоставляя полученные данные отобранных фракций эфирного масла и изменения антиоксидантной активности, характеризующиеся скоростями реакции ферментов КАТ, ГР, можно определить влияние химического состава на фармакологическое действие эфирного масла не только пихты сибирской, но и других эфирных масел.

В работе использовали лиофилизированные препараты ферментов - ГР, КАТ.

Ниже приведены примеры с использованием эфирного масла пихты сибирской.

Пример 1. Каталитическая активность каталазы (КАТ)

Каталитическую активность каталазы определяли по скорости разложения субстрата - перекиси водорода (H₂O₂) ферментом КАТ в реакционной смеси. Реакционная смесь состояла из фермента, растворенного в фосфатном буфере (pH 7,8), концентрация которого составляла 0,2 мкл/мл., субстрата (H₂O₂ ) в концентрации - 0,03% и исследуемого эфирного масла - 10 мкл/мл. При этом для улучшения смешиваемости эфирного масла с компонентами инкубационной пробы, эфирное масло разводили растворителем перед добавлением в инкубационную среду. В качестве растворителя использовали ДМСО (диметилсульфоксид), который в наименьшей степени оказывает влияние на фермент, что позволяет более точно проводить анализ. Количество ДМСО при разведении эфирного масла, позволяющего в полной мере выявлять биологическую активность, определено в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл. Продолжительность реакции разложения субстрата ферментом (H₂O₂ ) 5-10 мин.

Реакцию останавливали путем добавления в реакционную смесь аммонния молибденовокислого ((NH₄ )₆Mo₇O₂₄·4H₂ O). Оставшуюся после реакции разложения ферментом КАТ перекись водорода измеряли в виде комплекса с (NH₄)₆ Mo₇O₂₄·4H₂O путем определения оптической плотности на спектрофотометре при =410 нм (опыт). Расчет скорости каталазной реакции (КАТ) осуществлялся по следующей формуле:

КАТ= AD(холостая-опыт)/( *10 мин*b)/4, где холостая - оптическая плотность пробы без добавления фермента; опыт - оптическая плотность оставшейся перекиси водорода после реакции разложения; - коэффициент поглощения перекиси водорода; b - концентрация фермента в реакционной смеси (мкг).

Пример 2. Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР)

Скорость глутатионредуктазной реакции (ГР) определяли в кварцевых кюветах при спектрофотометрической регистрации убыли НАДФН при =340 нм на двулучевом спектрофотометре Shimadzu MPS-2000. Инкубационная среда состояла из буфера 0,05М трис-(оксиметил)-аминометан - HCl, содержащего 0,25 mM ЭДТА - Na, pH-7,4 и 0,033М глутатиона окисленного (Г-SS-Г). Реакцию запускали добавлением 2 mM ИАДФН и включали запись. Продолжительность записи - 1-1,5 мин. ГР реакцию записывали без добавления испытуемого вещества (контроль) и в присутствии разбавленного эфирного масла в концентрации 10 мкл/мл (опытная проба). Скорость ГР реакции рассчитывали по формуле

v=( D)/( *t* ), где v - скорость реакции, мкмоль/мин.мг белка; D - измеренная убыль оптической плотности за период измерения; - коэффициент миллимолярной экстинкции, равный 6,22 mM; - количество фермента в пробе, мкг/мл.

В качестве растворителя также использовали ДМСО (диметилсульфоксид) в соотношении 1:1, что в пробе соответствует количеству - 10 мкл/мл.

Скорость ферментативных реакций в % для всех анализируемых ферментов рассчитывали по соотношению скорости реакции в опытной пробе и скорости реакции в контроле.

При добавлении в инкубационную среду первых трех фракций эфирного масла пихты сибирской активность ферментов является наивысшей, постепенно снижаясь в 4-й и 5-й фракции. Максимально высокая скорость ферментативных реакций КАТ и ГР составляет соответственно 165,70 и 908,02% и по мере процесса отгонки эфирного масла снижается не значительно, в то время как последние отобранные фракции резко снижают активацию ферментов до 111,41% (КАТ) и 191,44% (ГР) (см. табл.1).

Аналогичные примеры были проведены на эфирном масле багульника болотного, сосны обыкновенной, тысячелистника. Предварительное разбавление тест-объекта в ДМСО позволило определить антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел.

Корреляция изменения химического состава и активности ферментов в процессе выделения эфирного масла, определяемая с помощью тест-систем in vitro, позволяет в дальнейшем при наличии значительной базы данных оптимизировать и упростить технологический процесс получения целевой биологической активности, определяя компонентный состав фракций эфирного масла и используя только дешевые и высокоэффективные ферментные тест-системы in vitro.

Таким образом, специфические ферментные биотест-системы in vitro могут быть использованы при оценке антиоксидантной активности различных эфирных масел и их отдельных фракций. Причем биотест-системы позволяют проводить сравнительную оценку биологической активности вместе с предварительным определением химического состава изучаемого объекта, что особенно важно при тестировании веществ сложного химического состава.

Выводы

1. Состав эфирного масла пихты сибирской изменяется в зависимости от времени выделения масла.

2. Показана возможность применения тест-систем in vitro для анализа биологической активности цельного эфирного масла и фракций с измененным количественным составом компонентов эфирного масла пихты сибирской.

3. Данный способ оценки биологически активных веществ позволяет находить новые источники получения потенциальных лекарственных средств и значительно расширять принципиальные возможности фармакотерапии основных заболеваний человека.

Таблица 1
Влияние эфирного масла пихты сибирской на скорость ферментативных реакций
Эфирное масло пихты сибирской	ГР			КАТ
	нмоль мин мг	% отн	Отношение скорости ферментативной реакции	нмоль мин мг	% отн	Отношение скорости ферментативной реакции
Контроль без эфирного масла	7,3±0,22	100,0	-	3,6±0,01	100,0	-
1-ая фракция	66,3±1,65	908,0±27,2	9.08	5,9±0,018	165,7±6,1	1,65
2-ая фракция	63,1±1,70	864,4±25,9	8.64	5,7±0,015	167,8±7,0	1.67
3-ая фракция	22,7±0,70	310,2±9,3	3.10	5,9±0,019	164,8±7,9	1.64
4-ая фракция	22,4±0,56	306,1±9,2	3.06	4,06±0,101	113,5±3,4	1.13
5-ая фракция	14,0±0,40	191,4±5,7	1.91	3,98±0,103	111,4±3,3	1.11
Цельное эфирное масло	63,8±1,60	873,9±31,1	8.73	8,27±0,03	231,6±7,2	2.31