способ специфичной детекции малопредставленных фракций рнк в в биологическом образце

Формула изобретения

1. Способ детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, включающий стадии:

(a) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ), стадию (a) осуществляют в условиях "горячего старта";

(b) инактивации ОТ обработкой хаотропным средством и

(с) детекции представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР),

где биологический образец содержит большое фоновое количество клеточных компонентов и большое фоновое количество суммарной РНК, и где ОТ представляет собой рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol).

2. Способ по п.1, дополнительно включающий, после стадии (а), стадию амплификации представляющей интерес кДНК с использованием ОТ из стадии (а).

3. Способ по п.1, дополнительно включающий, после стадии (b), стадию удаления хаотропного средства из реакционной смеси.

4. Способ по п.1, где хаотропное средство выбрано из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния.

5. Способ по п.4, где хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.

6. Способ по п.1, где полимеразная цепная реакция (ПЦР) на стадии (c) представляет собой ПЦР в реальном времени.

7. Способ по п.1, где представляющая интерес РНК происходит из микоплазмы.

8. Способ по п.7, где микоплазму выбирают из группы, состоящей из Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans , Mycoplasma synoviae и Mycoplasma orale.

9. Способ по п.7, где представляющая интерес РНК представляет собой рибосомальную РНК 16S.

10. Способ детектирования микоплазменного загрязнения в биологическом образце, где способ включает стадии:

(a) выделения суммарной РНК из биологического образца;

(b) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ), где ОТ представляет собой рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol);

(с) амплификации кДНК, полученной на основе рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (b);

(d) инактивации ОТ посредством добавления хаотропного средства;

(e) удаления хаотропного средства из реакционной смеси; и

(f) детекции кДНК, полученной на основе рРНК 16S микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

11. Способ по п.10, где стадию (b) осуществляют в условиях горячего старта .

12. Способ по п.10, где хаотропное средство выбрано из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния.

13. Способ по п.12, где хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.

14. Способ по п.10, где полимеразная цепная реакция (ПЦР) из стадии (f) представляет собой ПЦР в реальном времени.

15. Набор для детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, содержащий, по меньшей мере, рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol), подходящие праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S микоплазмы, подходящие праймеры для амплификации кДНК, полученной из рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы, хаотропное средство для инактивации rTth-pol, средства для удаления хаотропного средства из реакционной смеси и праймеры для детекции кДНК, полученной из рРНК 16S микоплазмы посредством ПЦР в реальном времени.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу и набору для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце и к способу и набору для определения наличия микоплазменного загрязнения в биологическом образце.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К числу наиболее широко распространенных и результативных способов детекции и анализа молекул РНК относится так называемый ОТ/ПЦР (обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция). В этом способе, РНК молекулы транскрибируют в молекулы кДНК посредством обратной транскриптазы (ОТ) и затем определяют и/или анализируют способами на основе ПЦР.

В более ранних исследованиях в этой области для обратной транскрипции использовали или ОТ вируса миелобластоза птиц или ОТ вируса лейкоза Молони мышей. Однако значительную проблему при использовании РНК в качестве матрицы для синтеза кДНК представляла неспособность этих мезофильных вирусных ОТ синтезировать кДНК в области стабильных вторичных структур РНК. Для разрешения этой проблемы обратную транскрипцию можно выполнять при повышенных температурах, что позволяет разрушать вторичные структуры РНК и дополнительно увеличивать специфичность при удлинении праймера. Это требует применения термостабильных ферментов для обратной транскрипции, таких как ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth pol), активность которой является оптимальной при температуре 70°C.

Однако применение термостабильных ферментов для обратной транскрипции также создает ряд новых проблем. В частности, при попытке определить и/или анализировать малопредставленные фракции РНК в биологическом образце, термостабильный фермент для обратной транскрипции во время последовательных стадий ОТ/ПЦР может катализировать образование неспецифичных продуктов реакции. Это особенно относится к образцам, которые содержат большое фоновое количество суммарной РНК, что приводит к последовательному повышению нижнего предела детекции представляющей интерес РНК до уровней, намного выше, чем может быть необходимо, например, при контроле качества биофармацевтических препаратов. Для разрешения этой проблемы, все манипуляции и стадии ОТ/ПЦР, следующие за обратной транскрипцией, надлежит осуществлять при повышенных температурах и в условиях горячего старта . Это, однако, часто является практически нецелесообразным и невыгодным, особенно при работе в производственном масштабе.

Применение, где чувствительность детекции малопредставленных фракций РНК, часто при наличии большого фонового количества суммарной РНК, является особенно важной, представляет собой детекцию микоплазменного загрязнения в биологическом образце.

Микоплазмы представляют собой бактериальные микроорганизмы с наименьшими размерами геномов, способных к саморепликации. Хотя большинство микоплазм представляют собой природные безопасные симбионты, некоторые из них способны инфицировать своих природных хозяев и вызывать заболевания различной степени тяжести. Микоплазмы, особенно виды семейства Mycoplasma и Acholeplasma , также представляют собой частую причину загрязнения первичных и стабильных клеточных линий и являются серьезной проблемой для исследовательских и производственных лабораторий, включенных в разработку и получение биологических и фармацевтических препаратов, полученных на основе клеток. Таким образом, несмотря на все профилактические меры, которые, как правило, применяются на всем протяжении культивирования клеточных линий и работы с ними, микоплазменное загрязнение остается часто встречающейся проблемой.

Аналитические протоколы, рекомендованные для тестирования клеточных линий и биологических продуктов, полученных на основе клеток, на наличие микоплазм, включают использование культуры бульон/агар и тестирование индикаторных клеточных линий. Способ на основе культуры бульон/агар предназначен для детекции хорошо культивируемых микоплазменных видов, в то время как индикаторную клеточную линию используют для детекции микоплазменных видов, трудно поддающихся культивированию. Хотя комбинация двух этих способов способствует эффективной детекции наличия микоплазм, в целом способы тестирования являются дорогостоящими, трудоемкими и требуют большого количества времени (минимум 28 суток). Кроме того, существует ряд не поддающихся культивированию видов микоплазм, которые не подлежат детекции данным способом.

Недавно разработаны новые способы тестирования на наличие микоплазм, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, в частности рибосомальных РНК микоплазменного происхождения. Эти способы имеют некоторые преимущества в отношении денежных затрат, аналитической чувствительности, простоты исполнения и временных затрат. Однако величина уровня нижнего предела детекции у существующих способов все еще выше, чем это необходимо при контроле качества биофармацевтических препаратов, особенно при работе с образцами, в которых представлено большое фоновое количество суммарной РНК или других макромолекул.

Таким образом, в данной области существует необходимость в усовершенствовании существующих способов ОТ/ПЦР, что позволит расширить пределы детекции малопредставленных фракций РНК в биологических образцах.

Решение проблемы, указанной выше, осуществляют посредством вариантов осуществления, представленных в пунктах формулы изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей по настоящему изобретению является создание усовершенствованного способа детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце. В частности, настоящее изобретение относится к указанному способу и набору для детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце. Дополнительно, другой задачей по настоящему изобретению является создание усовершенствованного способа и набора для определения микоплазменного загрязнения в образце.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, где способ включает стадии:

(а) обратная транскрипция РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);

(b) инактивация ОТ и

(с) детекция представляющей интерес кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Как применяют в настоящем документе, термин биологический образец относится к любому образцу, который содержит или предполагают, что он содержит, биологически значимые макромолекулы, такому как, например, образцы, полученные на различных стадиях процесса получения биофармацевтических препаратов, например, вакцин или рекомбинантных белков, образцы супернатантов клеточной культуры, лизатов клеток, экстрактов клеток, проб продуктов питания или окружающей среды, образцы, взятые из организма человека или животного, такие как образцы цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, ликвора или мазки, к любым другим образцам биологического происхождения и любой другой композиции, которая содержит или ожидают, что она содержит РНК.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец содержит большое фоновое количество клеточных компонентов.

Как применяют в настоящем документе, термин клеточные компоненты относится к клеточным органеллам, белкам, пептидам, мембранам, липидам, нуклеиновым кислотам, в частности, к фракциям РНК, не являющимся целью исследования по настоящему изобретению, и их комбинациям или фрагментам.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец содержит большое фоновое количество суммарной РНК.

Как применяют в настоящем документе, термин большое фоновое количество суммарной РНК относится к ситуации, когда количество молекул представляющей интерес РНК представлено менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 10⁴, предпочтительно менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 10⁶, более предпочтительно менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК, равном 10⁸ , и наиболее предпочтительно как менее чем одной молекулой в количестве суммарных молекул РНК равном 10¹⁰.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК представлена в количестве менее чем 10000 копий на мл образца, предпочтительно менее чем 1000 копий на мл образца, более предпочтительно менее чем 100 копий на мл образца, и наиболее предпочтительно менее чем 10 копий на мл образца.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием ОТ осуществляют, согласно способу по настоящему изобретению, в условиях горячего старта .

Как применяют в настоящем документе, термин условия горячего старта относится к любым условиям, при которых реакционную смесь, перед добавлением фермента, осуществляющего удлинение праймера, нагревают до температуры плавления или выше температуры плавления комплекса праймер/нуклеиновая кислота, или если фермент, который осуществляет удлинение праймера, неактивен при температуре окружающей среды и активируется стадией активации при высокой температуре, которую проводят при температуре плавления или выше температуры плавления комплекса праймер/нуклеиновая кислота.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способ по настоящему изобретению дополнительно содержит, после стадии обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием ОТ, стадию амплификации представляющей интерес кДНК с использованием той же ОТ. Эту дополнительную стадию называют первичная ПЦР и предпочтительно осуществляют в течение 5-15 циклов в условиях горячего старта , более предпочтительно в течение 5-11 циклов в условиях горячего старта , и наиболее предпочтительно в течение пяти или в течение десяти циклов в условиях горячего старта .

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции малопредставленных фракций РНК в биологическом образце, где способ включает стадии:

(a) обратной транскрипции РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);

(b) амплификации кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (a);

(c) инактивацию ОТ и

(d) детекции представляющей интерес кДНК посредством ПЦР.

Ферменты, которые обладают активностью как ОТ (т.е. РНК-зависимая ДНК-полимераза), так и ДНК-полимеразы (т.е. ДНК-зависимая ДНК-полимераза), хорошо известны в данной области и включают, например, ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). Условия, при которых конкретный фермент демонстрирует конкретную активность, также являются хорошо известными в данной области. В случае Tth pol, его активность в качестве обратной транскриптазы обеспечивается ионами Mn²⁺, а активность в качестве ДНК-полимеразы обеспечивается ионами Mg²⁺.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ОТ, используемая в способе по настоящему изобретению, представляет собой ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления Tth pol получена рекомбинантным способом (rTth-pol).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в способе по настоящему изобретению ОТ инактивируют, предпочтительно способом, выбранным из группы, состоящей из термической обработки, обработки фенолом, обработки протеиназой K и обработки хаотропным средством.

Термическая обработка по настоящему изобретению включает нагревание реакционной смеси, содержащей ОТ, до 80-100°C, предпочтительно до 90-100°C, более предпочтительно до 95°C. Продолжительность термической обработки составляет от 15 до 90 минут, предпочтительно от 30 до 75 минут, более предпочтительно 60 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления, термическая обработка включает нагревание реакционной смеси, содержащей ОТ, до 95°C в течение 60 минут.

По настоящему изобретению обработка протеиназой К включает добавление от 1 до 10 единиц протеиназы К в реакционную смесь, более предпочтительно от 2 до 5 единиц протеиназы K или наиболее предпочтительно 5 единиц протеиназы K. Продолжительность обработки протеиназой К составляет от 30 до 90 минут, предпочтительно от 45 до 75 минут или наиболее предпочтительно 60 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления, обработка протеиназой К включает добавление 5 единиц протеиназы К и продолжительность обработки составляет 60 минут.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в способе по настоящему изобретению ОТ инактивируют обработкой хаотропным средством. Обработка хаотропным средством по настоящему изобретению включает добавление хаотропного средства в реакционную смесь, содержащую ОТ, в количестве и в течение времени, достаточном для инактивации ОТ. Добавляемое количество и время обработки хорошо известны в данной области для конкретного хаотропного средства. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, хаотропное средство выбирают из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, способ по настоящему изобретению дополнительно содержит, после инактивации ОТ с использованием хаотропного средства, стадию удаления хаотропного средства из реакционной смеси. Способы удаления хаотропного средства из реакционной смеси хорошо известны в данной области и включают, например, очистку нуклеиновых кислот, содержащихся в реакционной смеси, с использованием связывающих ДНК центрифужных колонок.

Детекция представляющей интерес кДНК посредством ПЦР также называют буст ПЦР . В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в способе по настоящему изобретению представляет собой ПЦР в реальном времени.

Как применяют в настоящем документе, термин ПЦР в реальном времени относится к любому способу, основанному на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и который позволяет амплифицировать и одновременно определять количество представляющей интерес ДНК молекулы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК получена из микоплазмы. Как применяют в настоящем документе, термин микоплазма относится к любому семейству класса молликутов, которое включает вид Mycoplasma, Ureaplasma, Mesoplasma , Entomoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma , Asteroleplasma и Thermoplasma. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, микоплазму выбирают из группы, состоящей из Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma synoviae и Mycoplasma orale.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющая интерес РНК представляет собой рибосомальную РНК 16S (рРНК 16S).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, где способ включает стадии:

(a) выделение суммарной РНК из образца;

(b) обратная транскрипция РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ);

(с) амплификация кДНК, полученной на основе рибосомальной РНК 16S (рРНК 16S) микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ОТ из стадии (b);

(d) инактивация ОТ посредством добавления хаотропного средства;

(e) удаление хаотропного средства из реакционной смеси и

(f) детекция кДНК, полученной на основе рРНК 16S из микоплазмы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Способы выделения суммарной РНК из образца хорошо известны в данной области и включают выделение с фенолом/хлороформом и осаждение изопропанолом.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, микоплазменное загрязнение, подлежащее детекции, представляет собой загрязнение, составляющее не более чем приблизительно 10 КОЕ/мл микоплазм в образце.

Хорошо известны в данной области праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S из микоплазмы, а также праймеры для амплификации посредством ПЦР кДНК, полученной на основе рРНК 16S из микоплазмы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием ОТ из способа детекции микоплазменного загрязнения в образце выполняют в условиях горячего старта .

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ОТ, которую используют в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце, представляет собой ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth pol). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления Tth pol получена рекомбинантным способом (rTth-pol).

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, хаотропное средство, которое используют в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце, выбирают из группы, состоящей из мочевины, перхлората лития и соли гуанидиния. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, хаотропное средство представляет собой соль гуанидиния.

В одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ПЦР в способе детекции микоплазменного загрязнения в образце представляет собой ПЦР в реальном времени.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для детекции малопредставленных представляющих интерес фракций РНК в биологическом образце, содержащем, по меньшей мере, ОТ и средства для инактивации ОТ. Средства для инактивации ОТ могут представлять собой протеиназу К или хаотропное средство. Набор может дополнительно содержать, например, праймеры для обратной транскрипции, праймеры для детекции специфических кДНК, РНК-носитель, калибровочную РНК, калибровочную ДНК, подходящие ферменты, буферы, реагенты, емкости для реакции и расходные материалы.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к набору для детекции микоплазменного загрязнения в биологическом образце, содержащем, по меньшей мере, рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol), подходящие праймеры для обратной транскрипции рРНК 16S микоплазмы, подходящие праймеры для амплификации кДНК, полученной из рРНК 16S микоплазмы, хаотропное средство для инактивации rTth-pol, средства для удаления хаотропного средства из реакционной смеси и праймеры для детекции кДНК, полученной на основе рРНК 16S микоплазмы посредством ПЦР, например, ПЦР в реальном времени. Средства для удаления хаотропного средства могут представлять собой связывающие ДНК центрифужные колонки. Набор может дополнительно содержать, например, средства для выделения суммарной РНК из образца, РНК-носитель, калибровочную РНК, калибровочную ДНК, подходящие ферменты, буферы, реагенты, емкости для реакции и/или расходные материалы. Средства для выделения суммарной РНК могут представлять собой фенол, хлороформ и изопропанол или буферы, содержащие т.п.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые не являются ограничивающими.

ПРИМЕРЫ

Общий способ:

Выполнение способа начинают с центрифугирования представляющего интерес биологического образца, с последующим выделением суммарной РНК из осадка в образце. РНК затем подвергают обратной транскрипции в кДНК, используя рекомбинантную ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (rTth-pol) в присутствии Mn²⁺ в условиях горячего старта . После хелатирования Mn²⁺ и добавления Mg ²⁺, rTth-pol осуществляет амплификацию посредством ПЦР в течение 5 циклов или в течение 10 циклов в условиях горячего старта (первичная ПЦР). Реакционную смесь ПЦР затем переносят в буфер, содержащей гуанидин, для инактивации rTth-pol. Очистка посредством набора, основанного на использовании центрифужной колонки, дает в результате очищенные ПЦР-продукты первичной ПЦР, которые затем амплифицируют совместно со стандартной ДНК (калибровочная ДНК) в дуплексной ПЦР в реальном времени ( буст ПЦР). Альтернативно, РНК-стандарт (калибровочную РНК) можно добавлять на начальных стадиях процесса выделения РНК для нормирования и контроля процесса на начальных стадиях.

Экспериментальные способы:

Выделение РНК . Все стадии проводили в реакционных пробирках объемом 2 мл. 2 мл образца центрифугировали при 4°C в течение 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл РНК-Bee (Tel-Test Inc., TX), добавляли 5 мкл 1 мг/мл дрожжевой тРНК и образец инкубировали в течение 20 мин в центрифуге при 70°C и 1000 об/мин. Затем, добавляли 110 мкл хлороформа и проводили разделение фаз посредством центрифугирования в течение 5 мин при 13000 об/мин. Проводили осаждение РНК посредством добавления 500 мкл изопропанола к полученной в результате верхней фазе и образцы в течение 5 мин оставляли на сухом льду. Осадок РНК собирали посредством центрифугирования в течение 15 мин при 13000 об/мин, промывали 500 мкл 70% EtOH и образец центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин, супернатант удаляли и осадок РНК растворяли в 250 мкл дважды дистиллированной H₂O (bdH₂ O).

Обратная транскрипция. 6 мкл смеси для ОТ (1 мкл 10-кратного буфера для обратной транскрипции (Applied Biosystems, Austria), 1 мкл 10 мМ MnCl₂, 0,5 мкл 10 мкМ обратного праймера, 0,8 мкл 2,5 мМ dNTP каждого, 2,2 мкл (5,5 Ед) rTth-pol и 0,5 мкл bdH₂O) добавляли к 4 мкл выделенной РНК. Обратную транскрипцию проводили в течение 2 мин при 80°C, 5 мин при 62°C, 10 мин при 70°C и 2 мин при 80°C.

Первичная ПЦР. 40 мкл смеси для ПЦР (4 мкл 10-кратного хелатирующего буфера (Applied Biosystems, Austria), 5 мкл 25 мМ MgCl₂, 2,5 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера и 26,5 мкл bdH₂O), которую предварительно прогревали до 85°C±5°C, добавляли к реакционной смеси, полученной на этапе обратной транскрипции. ПЦР проводили по следующему протоколу: 2 мин при 80°C, 2 мин при 95°C, 5x(10 с при 95°C, 30 с при 62°C, 30 с при 72°C).

Инактивация ОТ. После первичной ПЦР, 50 мкл все еще горячей реакционной смеси добавляли к 253 мкл буфера для инактивации (3 мкл РНК-носителя (1 мкг/мкл дрожжевой тРНК), 250 мкл буфера PBI (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Germany)) и перемешивали. Образцы помещали в центрифужные колонки Qiaquick mini (Qiagen, Germany) в 2 мл пробирку для сбора образцов и центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Пробирку для сбора образцов удаляли, центрифужную колонку помещали в новую пробирку для сбора образцов, добавляли 750 мкл буфера PE (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Germany) и образец центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Пробирку для сбора образцов вновь удаляли и центрифужную колонку центрифугировали в новой пробирке для сбора образца в течение 1 мин при 13000 об/мин. Центрифужную колонку затем помещали в новую реакционную пробирку объемом 1,5 мл, 50 мкл 10 мМ Tris (pH 8,0) добавляли и проводили элюцию ДНК посредством центрифугирования в течение 1 мин при 13000 об/мин.

Буст ПЦР. 10 мкл элюированной ДНК помещали в оптическую пробирку и добавляли 5 мкл калибровочной ДНК в качестве контроля и 35 мкл смеси TMPCR (1xTaqMan Буфер A (Applied Biosystems, Austria), 5 мМ MgCl₂, 200 нМ каждого праймера, 100 нМ каждой пробы, 200 мкМ каждого dNTP, 9% глицерина (масс./об.), 0,05% желатин (масс./об.), 0,01% Tween 20 (масс./об.), 2,5 Ед полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Austria)). ПЦР в реальном времени проводили по следующему протоколу: 10 мин при 95°C, 40x(15 с при 95°C, 1 мин при 62°C).

Пример 1: Детекция Mycoplasma synoviae в образцах, полученных в процессе производства вакцины

В образцы, полученные в процессе производства вакцины, вносили различные количества Mycoplasma synoviae и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Для того чтобы продемонстрировать положительное воздействие инактивации ОТ (образцы 1-6), включали контрольные образцы, в которых ОТ не инактивировали (образцы 7-12) или в которые совсем не добавляли ОТ (образцы 13-18). После выделения РНК, обратной транскрипции, первичной ПЦР и инактивации ОТ, образцы анализировали на наличие кДНК посредством ПЦР в реальном времени. Перед этой буст ПЦР, заданное количество калибровочной ДНК добавляли к реакционной смеси. Данную калибровочную ДНК амплифицировали вместе с представляющими интерес нуклеиновыми кислотами с использованием различных наборов праймеров. Сигналы от калибровочной и представляющей интерес ДНК дифференцировали, используя различные меченые зонды. Праймеры для первичной и буст ПЦР являлись специфичными для рРНК 16S микоплазмы. Результаты, просуммированные в таблице 1, демонстрируют значения Ct, полученные при ПЦР в реальном времени, т.е. количество циклов, необходимое для детекции специфического продукта ПЦР. Низкие значения Ct подразумевают более быструю детекцию, в то время как значения Ct, равное 40, показывают, что на протяжении всего времени проведения ПЦР в реальном времени продукта обнаружено не было.

Таблица 1 Детекция Mycoplasma synoviae в образцах, полученных в процессе производства вакцины
Образец №	M.synoviae КОЕ/мл	ОТ присут-ствует	ОТ инакти-вирована	Ct (калибро-вочная)	Ct (представ-ляющая интерес)
1	100	+	+	29,88	30,82
2	100	+	+	29,67	30,71
3	10	+	+	29,68	33,16
4	10	+	+	29,71	35,42
5	-	+	+	29,85	40,00
6	-	+	+	29,95	40,00
7	100	+	-	39,30	40,00
8	100	+	-	34,41	40,00
9	10	+	-	34,64	40,00
10	10	+	-	35,12	40,00
11	-	+	-	34,42	40,00
12	-	+	-	36,11	40,00
13	100	-	-	29,56	40,00
14	100	-	-	29,43	40,00
15	10	-	-	29,39	40,00
16	10	-	-	29,40	40,00
17	-	-	-	29,31	40,00
18	-	-	-	29,37	40,00

Результаты, представленные в таблице 1, убедительно показывают, что наличие активной ОТ (образцы 7-12) не позволяет определить даже 100 КОЕ/мл Mycoplasma synoviae, а инактивация ОТ позволяет определить даже всего 10 КОЕ/мл. Увеличение определяемых значений Ct для калибровочной ДНК в образцах, в которых не инактивировали ОТ, показывает, что без инактивации ОТ является способной катализировать реакции, приводящие к образованию неспецифических продуктов реакции, которые препятствуют образованию специфических продуктов калибровочной и представляющей интерес ДНК в течение проведения буст ПЦР. Объяснение основано на факте того, что в образцах, к которым совсем не добавили ОТ (образцы 13-18), значения Ct для калибровочной ДНК представлены на том же уровне, что и в образцах, в которых ОТ инактивирована (образцы 1-6).

Пример 2: Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства вакцины

В образцы, аналогичные образцам в примере 1, вносили различные количества Mycoplasma fermentans и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Для того чтобы показать положительное воздействие инактивации ОТ (образцы 1-6), включали контрольные образцы, в которых не инактивировали ОТ (образцы 7-12). После выделения РНК, обратной транскрипции, первичной ПЦР и инактивации ОТ, образцы анализировали на наличие кДНК посредством ПЦР в реальном времени. Перед буст ПЦР, заданное количество калибровочной ДНК добавляли в реакционную смесь. Праймеры для первичной и буст ПЦР и в этом примере представляли собой праймеры, специфичные к рРНК 16S микоплазмы. Результаты, просуммированные в таблице 2, демонстрируют значения Ct, полученные в результате ПЦР в реальном времени.

Таблица 2 Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства вакцины
Образец №	M.synoviae КОЕ/мл	ОТ присут-ствует	ОТ инакти-вирована	Ct (калибро-вочная)	Ct (представ-ляющая интерес)
1	100	+	+	29,31	29,57
2	100	+	+	29,46	30,44
3	10	+	+	29,30	33,46
4	10	+	+	29,47	34,72
5	-	+	+	29,67	40,00
6	-	+	+	29,27	40,00
7	100	+	-	40,00	40,00
8	100	+	-	40,00	40,00
9	10	+	-	40,00	40,00
10	10	+	-	40,00	40,00
11	-	+	-	40,00	40,00
12	-	+	-	40,00	40,00

Результаты в таблице 2 подтверждают, что в то время как наличие активной ОТ (образцы 7-12) не позволяет определять даже 100 КОЕ/мл Mycoplasma fermentans , инактивация ОТ позволяет определить даже всего 10 КОЕ/мл. Увеличение определяемых значений Ct для калибровочной ДНК в образцах, в которых не инактивировали ОТ, показывает, что без инактивации ОТ является способной катализировать реакции, приводящие к образованию неспецифических продуктов реакции, которые препятствуют образованию специфических продуктов калибровочной и представляющей интерес ДНК в течение проведения буст ПЦР.

Пример 3: Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства рекомбинантного белка

В образцы, полученные в процессе производства рекомбинантного белка, вносили различное количество Mycoplasma fermentans и анализировали согласно описанным выше экспериментальным способам. Положительное воздействие инактивации ОТ представлено в таблице 3, образцы 1-6. Что касается образцов, полученных при производственном получении вакцины, способ также позволяет детекцию всего 10 КОЕ/мл Mycoplasma fermentans, внесенных в суспензию клеток, используемых для получения рекомбинантного белка.

Таблица 3 Детекция Mycoplasma fermentans в образцах, полученных в процессе производства рекомбинантного белка
Образец №	M.synoviae КОЕ/мл	ОТ присут-ствует	ОТ инакти-вирована	Ct (калибро-вочная)	Ct (представ-ляющая интерес)
1	100	+	+	28,33	27,34
2	100	+	+	28,56	27,15
3	10	+	+	28,57	30,12
4	10	+	+	28,50	30,72
5	-	+	+	28,66	40,00
6	-	+	+	28,38	40,00