набор реагентов для одновременного или раздельного иммунногистохимического выявления рецепторов эстрогена, прогестерона и her2 при диагностике рака молочной железы

Формула изобретения

Набор реагентов для иммунногистохимического раздельного или одновременного выявления гиперэкспрессии рецепторов HER2 и гормонального статуса относительно рецепторов эстрогена и прогестерона рака молочной железы, включающий раствор для обеспечения биодоступности антигена, блокирующий раствор пероксидазы хрена, белковый блокирующий раствор, промывочный раствор, раствор первичных антител № 1, раствор первичных антител № 2, раствор первичных антител № 3, раствор антивидовых вторичных антител к первичным антителам, раствор стрептавидин-пероксидазы хрена, диаминбензидин, субстратный раствор, отрицательный контрольный образец (К-), положительный контрольный образец № 1, положительный контрольный образец № 2, положительный контрольный образец № 3, отличающийся тем, что в наборе применены одновременно три варианта первичных антител (к рецепторам эстрогена, прогестерона и HER2), смесь вторичных антител, конъюгированных с биотином, и введен унифицированный протокол применения всех трех вариантов первичных антител.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области лабораторной диагностики рака молочной железы и может быть использовано в медицинских лабораториях и научно-исследовательских институтах.

Основным применяемым методом определения уровня экспрессии маркеров HER2, эстрогена и прогестерона в настоящее время является иммунногистохимический анализ (ИГХ) [1, 2, 3]. Исследуется гистологический материал, полученный при биопсии рака молочной железы (РМЖ). Иммунногистохимическое исследование определяет маркеры в клетках опухоли молочной железы с помощью специальной окраски, видимой при светооптическом изучении гистологического среза. Чем больше рецепторов содержится в исследуемом образце рака молочной железы, тем сильнее окрашивание.

Действующим прототипом для иммунногистохимической диагностики гиперэкспрессии рецептора HER2, использующим поликлональные аффинно очищенные антитела к синтетическому фрагменту HER2 рецептора при диагностики РМЖ, является набор реагентов Hercep test TM (product No. К520421 Dako).

Набор реагентов включает в себя:

1. Блокирующий раствор для пероксидазы, включает 3% перекись водорода и азид натрия.

2. Кроличьи антитела против HER2 белка человека, аффинно очищенные, готовые к применению, содержатся в буферном растворе Трис-HCl, включают хлорид натрия, азид натрия, стабилизирующий белок. Иммунногеном является C-терминальный фрагмент (интрацитоплазматическая часть) HER2 рецептора. Белок аффинно очищался на пептиде HER2.

3. Визуализирующий реагент - полимер декстран, конъюгированный с пероксидазой хрена и с аффинно очищенной сывороткой козы против иммуноглобулинов кролика, содержится в буферном растворе Трис-HCl, включает в себя антибактериальный агент и стабилизирующий белок.

4. Отрицательный контрольный реагент - фракция иммуноглобулинов нормальной сыворотки кролика, концентрация белка эквивалентна антителам к HER2 белку, содержится в буферном растворе Трис-HCl, включает хлорид натрия, азид натрия, стабилизирующий белок.

5. Субстрат для ДАБ-хромогена, содержится в буферном растворе, включает менее 0,1% перекиси водорода, стабилизаторы, усилители и антибактериальный агент.

6. ДАБ-хромоген. Раствор 5% 3,3-диаминбензидина тетрагидрохлорида.

7. Раствор увеличения биодоступности эпитопа, 10-кратный концентрат, содержится в цитратном буферном растворе, включает в себя детергент.

8. Промывочный буферный раствор, 10-кратный концентрат, содержится в буферном растворе Трис-HCl, включает в себя детергент и антибактериальный агент.

9. 5 стекол с положительными контрольными образцами. Каждое стекло несет на себе срезы с 3х фиксированных формалином фрагментов РМЖ в парафиновых блоках, представляющих три уровня иммунногистохимической окраски (0), (1+), (3+).

Процедура применения набора включает в себя следующие стадии [1].

Стадия 1. Открытие эпитопов

Наполнить емкости раствором для обеспечения биодоступности эпитопов. Разместить емкости в водяной бане. Нагреть водяную баню и емкости до температуры 95-99°C. Поместить срезы с исследуемыми и контрольными образцами в емкости. Нагреть водяную баню и емкости до температуры 95-99°C. Инкубировать 40 (±1) минут при температуре 95-99°C. Вынуть емкости из бани. Выдержать емкости 20 (±1) минут при комнатной температуре. Промыть срезы разведенным промывочным буферным раствором.

Стадия 2. Блокирование эндогенной пероксидазы

Удалить влагу со срезов. Нанести 3 капли (100 мкл) блокирующего раствора для пероксидазы на образец. Инкубировать 5 (±1) минут. Осторожно промыть дистиллированной или деионизованной водой или промывочным буферным раствором. Разместить в свежем буферном растворе.

Стадия 3. Внесение первичных антител или отрицательного контрольного реагента

Удалить влагу со срезов. Нанести 3 капли (100 мкл) анти-НЕК2 белка или отрицательного контрольного реагента на образец. Инкубировать 30 (±1) минут.

Осторожно промыть промывочным буферным раствором. Разместить в свежем буферном растворе.

Стадия 4. Внесение визуализирующего реагента

Удалить влагу со срезов. Нанести 3 капли (100 мкл) визуализирующего реагента на образец. Инкубировать 30 (±1) минут. Осторожно промыть промывочным буферным раствором. Разместить в свежем буферном растворе.

Стадия 5. Окраска раствором ДАБ

Удалить влагу со срезов. Нанести 3 капли (100 мкл) раствора ДАБ на образец.

Инкубировать 10 (±1) минут. Осторожно промыть дистиллированной или деионизованной водой.

Далее срезы докрасить гематоксилином и заключить под покровное стекло.

Недостатком данного способа является отсутствие возможности определения гормонального статуса опухоли в одной постановке анализа, а также применение системы усиления специфической иммунногистохимической окраски на основе конъюгата декстрана с пероксидазой и вторичными антителами, который обладает более низкой чувствительностью по сравнению с современными конъюгатами вторичных антител с биотином и последующим применением комплекса стрептавидин-пероксидазы.

Известен способ диагностики HER2 рецептора с помощью биотинилированных гуманизированных моноклональных антител, являющихся модифицированным вариантом антител, входящих в состав препарата герцептин. Данный метод также использовался для иммунногистохимического выявления локализации внеклеточных доменов HER2 рецепторов [4].

Недостатком данного способа является отсутствие возможности определения гормонального статуса опухоли в одной постановке анализа, а также отсутствие вторичных антител в протоколе анализа, что может привести к снижение специфичности анализа и появлению ложноположительных результатов.

Действующим прототипом направленным на диагностику эстрогена и прогестерона являются набор реагентов ER/PR pharmDx Kit. (product No. K407111 Dako). Набор реагентов включает в себя:

1. Раствор увеличения биодоступности эпитопа, 10-кратный концентрат, включает в себя антимикробный компонент в нитратном буферном растворе.

2. Блокирующий раствор для пероксидазы, содержащий 0,5% перекись водорода, детергенты, ингибиторы ферментов и консерванты.

3. Смесь первичных антител к рецептору эстрогена. Моноклональные антитела мыши (IgG1 and IgG2a), против человеческого рецептора эстрогена, содержатся в буферном растворе Трис-HCl, включают азид натрия и стабилизирующий белок.

4. Первичные антитела к рецептору прогестерона. Моноклональные антитела мыши, против человеческого рецептора прогестерона, содержатся в буферном растворе Трис-HCl, включают азид натрия и стабилизирующий белок.

5. Отрицательный контрольный реагент. Моноклональные антитела мыши (IgG1 and IgG2a), содержатся в буферном растворе Трис-HCl, включают азид натрия и стабилизирующий белок.

6. Визуализирующий реагент - полимер декстран, конъюгированный с пероксидазой хрена и аффинно очищенной сывороткой козы против иммуноглобулинов мыши, содержится в буферном растворе Трис-HCl, включает в себя антибактериальный агент и стабилизирующий белок.

7. Субстрат для ДАБ-хромогена, содержится в буферном растворе, включает менее 0,1% перекиси водорода, стабилизаторы, усилители и антибактериальный агент.

8. ДАБ-хромоген. Раствор 5% 3,3-диаминбензидинатетрагидрохлорида.

9. Промывочный буферный раствор, 10-кратный концентрат, содержится в буферном растворе Трис-HCl, включает в себя детергент и антибактериальный агент.

10. 20 стекол с контрольными образцами. Каждое стекло несет на себе срезы с 2х фиксированных формалином фрагментов РМЖ в парафиновых блоках, представляющих срез со средним уровнем экспрессии эстрогена или прогестерона, а также срез с отрицательно клеточной линии. Процедура применения данного набора реагентов схожа с набором Hercep test ТМ [5].

Недостатком данного способа является отсутствие возможности определения статуса относительно гиперэкспрессии HER2 рецептора опухоли в одной постановке анализа, а также применение системы усиления специфической иммунногистохимической окраски на основе конъюгата декстрана с пероксидазой и вторичными антителами, который обладает более низкой чувствительностью по сравнению с современными конъюгатами вторичных антител с биотином и последующим применением комплекса стрептавидин-пероксидазы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание набора реагентов для иммунногистохимической диагностики рака молочной железы, обладающего следующими преимуществами перед прототипами:

1. Набор реагентов позволяет одновременно или раздельно выявлять как рецепторы эстрогена и прогестерона, так и HER2- рецепторы.

2. Набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью.

Указанный технический результат достигается:

По п.1. - применением 3х вариантов первичных антител к целевым рецепторам, титры которых подобраны так, что все процедуры унифицированы.

По п.2 - применением смеси вторичных антител, конъюгированных с биотином, и внедрение стрептавилин-пероксидазного комплекса для усиления окраски специфической реакции.

В состав предлагаемого набора реагентов входят следующие компоненты:

1. Раствор для обеспечения биодоступности антигена (РОБ), содержащий в своем составе реагенты (прежде всего детергенты и денатуранты), уменьшающие количество неспецифических взаимодействий, используя механизм воспрепятствования их образованию или разрушая уже образованные неспецифические взаимодействия перед началом основных стадий анализа.

2. Блокирующий раствор пероксидазы хрена (ключевого фермента окрашивания при протекании реакции) (БРП). Этот компонент необходим для максимального редуцирования количества активной пероксидазы в срезах исследуемой ткани и снижения неспецифического сигнала, возникающего под воздействием тканевого фермента.

3. Белковый блокирующий раствор (ББР). Компонент, содержащий в себе белковые соединения в буферном растворе, которые, связываясь с полипептидами, уменьшают количество неспецифических взаимодействий.

4. Промывочный раствор (ПР), является буферным раствором и предназначен для промывания стекол с контрольными и исследуемыми образцами между стадиями.

5. Раствор первичных антител № 1 (АТП-1) к рецептору HER2 в стабилизаторе, предназначенном для длительного хранения антител. При первом этапе ИГХ реакции содержащиеся в растворе антитела образуют комплекс «рецептор HER2 - первичное антитело». Раствор готов к применению.

6. Раствор первичных антител № 2 (АТП-2) к рецептору эстрогена в стабилизаторе, предназначенном для длительного хранения антител. При первом этапе ИГХ реакции содержащиеся в растворе антитела образуют комплекс «рецептор эстрогена - первичное антитело». Раствор готов к применению.

7. Раствор первичных антител № 3 (АТП-3) к рецептору прогестерона в стабилизаторе, предназначенном для длительного хранения антител. При первом этапе ИГХ реакции содержащиеся в растворе антитела образуют комплекс «рецептор прогестерона - первичное антитело». Раствор готов к применению.

8. Раствор антивидовых вторичных антител к первичным антителам (АТВ) конъюгированных с биотином в стабилизаторе, предназначенном для длительного хранения антител. При втором этапе ИГХ реакции содержащиеся в растворе антитела образуют комплекс «рецептор -первичное антитело - вторичное антитело - биотин». Раствор готов к применению.

9. Раствор стрептавидин-пероксидазы хрена (СПХ) в стабилизаторе, предназначенный для выявления биотина, содержащегося в приведенных выше комплексах.

10. Диаминбензидин (ДАБ), концентрат, предназначенный для приготовления рабочего раствора диаминбензидина, обеспечивающий под воздействием фермента цветное окрашивание.

11. Субстратный раствор (СР), используемый для приготовления рабочего раствора диаминбензидина.

12. Отрицательный контрольный образец (К-), представляющий собой неиммунногенную сыворотку, вносимую параллельно с первичными антителами и предназначенную для контроля неспецифического окрашивания.

13. Положительный контрольный образец № 1 (К+1), представляющий собой предметное стекло со смонтированным на нем срезами с парафиновых блоков содержащие ткань РМЖ. Положительные контрольные образцы ставятся в той же постановке анализа, что и исследуемые образцы, и служат для проверки адекватности выполнения процедур анализа и сравнения результатов. Служит для проверки адекватности выполнения процедур и сравнения окраски при детекции рецептора HER2.

14. Положительный контрольный образец № 2 (К+2), аналогичен предыдущему. Служит для проверки адекватности выполнения процедур и сравнения окраски при детекции рецептора эстрогена.

15. Положительный контрольный образец № 3 (К+3), аналогичен предыдущему. Служит для проверки адекватности выполнения процедур и сравнения окраски при детекции рецептора прогестерона.

Ниже приведены варианты объема растворов во флаконе и количество компонентов в наборе при варианте комплекта, предназначенного для выполнения исследования до 100 исследуемых и контрольных образцов в десяти независимых анализах.

Раствор для обеспечения биодоступности антигена содержит гуанидин гидрохлорид, мочевину и Твин 20 в стандартном фосфатно-солевом буфере. (Стандартный фосфатно-солевой буфер, необходимый для приготовления некоторых нижеприведенных растворов содержит натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, натрий хлористый, воду очищенную по ФС 42-2619-97.) После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор является 10-кратным концентратом и перед применением готовится. Раствор разливается во флаконы объемом 250 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Блокирующий раствор для пероксидазы хрена содержит 3% раствора перекиси водорода и азид натрия в воде очищенной по ФС 42-2619-97. После приготовления раствора pH не доводится. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 20 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Белковый блокирующий раствор содержит раствор бычьего сывороточного альбумина и Твин 20 в стандартном фосфатно-солевом буфере. После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 20 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор для промывки стекол с образцами содержит Твин 20 в стандартном фосфатно-солевом буфере. После приготовления раствора pH не доводится. Раствор является 10-кратным концентратом и перед применением готовится. Раствор разливается во флаконы объемом 250 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор первичных антител № 1 содержит моноклональные антитела к С-erB-2 онкопротеину (внутренний домен) в титре 1:5000 в стабилизаторе. Состав стабилизатора: бычий сывороточный альбумин, Тритон Х-100 и ProClin 300 в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе. После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор первичных антител № 2 содержит моноклональные мышиные антитела (изотип IgG1) к человеческому эстрогеновому рецептору а в титре 1:8000 в стабилизаторе. Состав стабилизатора: бычий сывороточный альбумин, Тритон Х-100 и ProClin 300 в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе. После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор первичных антител № 3 содержит моноклональные мышиные антитела (изотип IgG1 каппа) к человеческому прогестероновому рецептору (как А-форме, так и В-форме) в титре 1:150 в стабилизаторе. Состав стабилизатора: бычий сывороточный альбумин, Тритон Х-100 и ProClin 300 в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе. После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор вторичных антител содержит смесь антител против мышиных IgG, мышиных IgM, и кроличьих IgG конъюгированных с биотином в титре 1:10000 в стабилизаторе. Состав стабилизатора: бычий сывороточный альбумин, Тритон Х-100 и ProClin 300 в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе. После приготовления раствора pH доводится до 7,2-7,4. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Раствор стрептавидин-пероксидазы хрена содержит стрептавидин-пероксидазу хрена в титре 1:5000. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Диаминбензидин, концентрат содержит 3,3'-диаменбензидин-тетрохлорид в воде очищенной по ФС 42-2619-97. После приготовления раствора pH не доводится. Раствор предназначен для приготовления рабочего раствора ДАБ путем смешивания с субстратным раствором для последующего применения. Раствор разливается во флаконы объемом 1,5 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Субстратный раствор. Раствор предназначен для смешивания с диаминбензидином для последующего применения в качестве рабочего раствора ДАБ. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 2 флакона.

Отрицательный контрольный образец представляет собой неиммунногенную фильтрованную через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 5 мкм сыворотку, содержащую ProClin 300. После приготовления раствора pH не доводится. Раствор готов к применению. Раствор разливается во флаконы объемом 10 мл. В наборе содержится 1 флакон.

Положительный контрольный образец № 1 представляет собой предметное стекло размером 76×26×1 со смонтированными на нем срезами с парафиновых блоков содержащие ткань РМЖ. На каждом стекле смонтированы два среза (0 и 3+ по отношению к рецептору HER2 рака молочной железы). В наборе содержится 10 стекол с положительными контрольными образцами № 1.

Положительный контрольный образец № 2 представляет собой предметное стекло размером 76×26×1 мм со смонтированными на нем срезами с парафиновых блоков содержащие ткань РМЖ. На каждом стекле смонтированы три среза (0, 1+ и 3+ относительно окрашивания рецепторов эстрогена рака молочной железы). В наборе содержится 10 стекол с положительными контрольными образцами № 2.

Положительный контрольный образец № 3 представляет собой предметное стекло размером 76×26×1 мм со смонтированными на нем срезами с парафиновых блоков содержащие ткань РМЖ. На каждом стекле смонтированы два среза (0 и 3+ относительно окрашивания рецепторов прогестерона рака молочной железы). В наборе содержится 10 стекол с положительными контрольными образцами № 3.

Применение набора реагентов

Предварительное приготовление растворов

Раствор для обеспечения биодоступности антигена разводится в соотношении 1:10 дистиллированной или деионизованной водой в количестве, необходимом для постановки анализа (40 мл на исследуемое стекло). Раствор готовится перед постановкой анализа. Приготовленный раствор хранится в течении 2 недель при температуре 2-8°C.

Раствор для промывки стекол с образцами разводится в соотношении 1:10 дистиллированной или деионизованной водой в количестве, необходимом для постановки анализа (40 мл на исследуемое стекло). Раствор готовится перед постановкой анализа. Приготовленный раствор хранится в течении 2 недель при температуре 2-8°C.

Рабочий раствор диаминбензидина готовится следующим образом. 1 мл субстратного раствора переносится в чистую емкость. В эту емкость добавляется 1 капля (23-30 мкл) концентрата ДАБ. Тщательно перемешать раствор. Рабочий раствор ДАБ готовится в количестве, необходимом для постановки анализа (0,2 мл на исследуемое стекло). Раствор готовится непосредственно перед постановкой анализа. Приготовленный раствор хранится в течении 3 дней при температуре 2-8°C. Перед применением хранимый раствор необходимо перемешать.

Постановка анализа

При постановке анализа параллельно с исследуемыми образцами ставиться контрольные(-ый) положительный(-ые) образец (образцы) из расчета одно стекло на одну постановку в зависимости от определяемых целевых маркеров.

На первой стадии постановки анализа на образцы вылить 20-30 капель (500-750 мкл) РОБ, накрыть чистой емкостью и поместить в микроволновую печь на 8-10 минут при мощности 120 ватт. Не допускать полного высушивания срезов при нагревании. После этого РОБ слить с поверхности стекла в емкость с дезинфицирующей жидкостью, остатки влаги удалить осторожным прикосновением фильтровальной бумаги к краю жидкости, не касаясь при этом самих срезов. Далее на стекла с образцами налить по 20-30 капель (500-750 мкл) холодного РОБ и выдержать в течение 10 минут.

По завершении первой стадии образцы промыть. Протокол промывания стекол с образцами единообразен для любой процедуре промывания при постановке анализа и выполняется по следующей схеме. Находящуюся на стеклах жидкость слить с поверхности стекла в емкость с дезинфицирующей жидкостью, сверху на срезы налить по 20-30 капель (500-750 мкл) раствора для промывания стекол, выдержать 2-3 минуты и повторить процедуру промывки еще один раз. ПР слить и выполнить следующую стадию.

На второй стадии на каждое из исследуемых или контрольных стекол нанести по 2-3 капли (50-75 мкл) на срез блокирующего раствора для пероксидазы хрена. БРП выдержать в течение 15 минут при температуре 18-25°C во влажной камере (допустимо вместо влажной камеры использовать закрывающуюся емкость с кусками мокрой фильтровальной бумаги, расположенной под стеклами, но не касающиеся их) и стекла промыть по приведенной выше схеме.

Третья стадия заключается в наливании на срезы по 2-3 капли (50-75 мкл) белкового блокирующего раствора и выдерживании его в течение 15 минут при температуре 18-25°C во влажной камере. После выполнений этой стадии ББР сливается со стекол, но стекла не промывать.

На четвертой стадии на стекла добавить по 2-3 капли (50-75 мкл) раствора первичных антител, их выбор обусловлен целью постановки анализа (определение рецепторов к HER2, эстрогену или прогестерону). Допустимо определять в одной постановке различные рецепторы без изменения протокола постановки. Дополнительно на одно или несколько стекол, содержащих срезы с тех же тканей, что и исследуемые образцы (допустимо использовать одно из положительных контрольных стекол), вместо раствора первичных антител внести отрицательный контрольный образец в том же объеме. Срезы инкубировать при температуре 18-25°C во влажной камере в течении 30 минут и промыть по описанной выше процедуре.

Пятая стадия заключается в том, что на каждый из исследуемых или контрольных срезов наносится по 2-3 капли (50-75 мкл) раствора вторичных антител, срезы выдерживаются в течение 20 минут температуре 18-25°C во влажной камере. После этого образцы промываются по приведенной выше процедуре.

При выполнении шестой стадии на каждый из срезов наносится по 2-3 капли (50-75 мкл) раствора СПХ. Образцы инкубируются в течение 20 минут температуре 18-25°C во влажной камере. После этого образцы промываются по описанной выше схеме.

На седьмой стадии наносится рабочий раствор ДАБ по 2-3 капли (50-75 мкл) на стекло. Раствор выдерживается в течение 20 минут температуре 18-25°C во влажной камере. Срезы промываются по приведенной выше схеме дистиллированной или деионизованной водой, докрашиваются гемотоксилином и заключаются под покровное стекло в полистирол.

Анализ результатов

В разрабатываемом наборе реагентов иммунногистохимическую реакцию на все три варианта рецепторов предполагается оценивать по общепринятой бальной системе, одобренной FDA [6, 7]. Выраженность окраски оценивается по шкале от 0 до 3+.

0 - полное отсутствие ИГХ окрашивания или при выявлении его на мембранах менее чем 10% клеток инвазивного рака:

- при определении гиперэкспрессии HER2 - отрицательный рак молочной железы, лечение герцептином не показано;

- при определении гормонального статуса относительно рецепторов эстрогена и прогестерона - отрицательный рак молочной железы;

1+ - слабое окрашивание мембран более чем 10% клеток инвазивного рака:

- при определении гиперэкспрессии HER2 - отрицательный рак молочной железы, возможно проведение дополнительного исследования для перепроверки HER2 статуса;

- при определении гормонального статуса относительно рецепторов эстрогена и прогестерона - отрицательный рак молочной железы, возможно проведение дополнительного исследования для перепроверки гормонального статуса;

2+ - умеренное окрашивание мембран более чем 10% клеток инвазивного рака:

- при определении гиперэкспрессии HER2 - пограничное значение, неясный случай, обязательна перепроверка HER2 статуса с помощью дополнительного исследования;

- при определении гормонального статуса относительно рецепторов эстрогена и прогестерона - пограничное значение, неясный случай, обязательна перепроверка гормонального статуса с помощью дополнительного исследования;

3+ - яркое окрашивание всей мембраны клетки большинства клеток инвазивного рака:

- при определении гиперэкспрессии HER2 - положительный рак молочной железы, показано лечение герцептином;

- при определении гормонального статуса относительно рецепторов эстрогена и прогестерона - положительный рак молочной железы, показана гормональная терапия.

При светооптическом изучении срезов результаты анализа следует учитывать, только если срезы с внесенным отрицательным контрольным образцом содержат окрашивание на уровне 0 по бальной шкале степени иммунногистохимического окрашивания рецепторов эстрогенов рака молочной железы, а стекло с положительным контрольными образцами имеет окрашивание на уровне 0, 1+ и 3+ в зависимости от контрольного среза.

Использование разработанного нами набора реагентов можно проиллюстрировать следующими примерами.

Пример 1. Исследовалась «Рабочая панель НЕК2-позитивных и HER2-негативных образцов рака молочной железы» (РП (+/-) HER2 РМЖ), состоящая из следующих образцов:

Образцы № 1-6 имели оценку по бальной системе 0 (-). Образцы № 7-10 имели оценку 1+(+). Образцы № 11-14 имели оценку 2+(++). Образцы № 15-20 имели оценку 3+(+++).

Результаты проверки трех серий тест-системы «Набор реагентов для одновременного или раздельного иммунногистохимического выявления рецепторов эстрогена, прогестерона и HER2» на рабочей панели образцов РП (+/-) HER2 РМЖ представлены в таблице 1:

Таблица 1
Результаты проверки C1, C2 и C3 на панели РП (+/-) HER2 РМЖ
Номер образца	Содержание рецепторов к HER2	C1	C2	C3
№ 1	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 2	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 3	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 4	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 5	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 6	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 7	1+(+)	2+(++)	2+(++)	1+(+)
№ 8	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)
№ 9	1+(+)	1+(+)	2+(++)	1+(+)
№ 10	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)
№ 11	2+(++)	1+(+)	2+(++)	2+(++)
№ 12	2+(++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)
№ 13	2+(++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)
№ 14	2+(++)	2+(++)	1+(+)	1+(+)
№ 15	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)
№ 16	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)
№ 17	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)
№ 18	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)
№ 19	3+(+++)	3+(+++)	2+(++)	3+(+++)
№ 20	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)

По результатам анализа видно, что по критериям чувствительность и специфичность (по определению 0 и 3+ образцов) экспериментальные серии полностью соответствуют контрольным данным рабочей панели. По образцам, требующим дополнительной проверки (1+и 2+), результаты, полученные на экспериментальных сериях, очень близки к таковым контрольным.

Пример 2. Исследовалась общая панель образцов «Рабочая панель эстроген- и прогестерон-позитивных и эстроген- и прогестерон-негативных образцов рака молочной железы» (РП (+/-) ER/PR РМЖ). Характеристики образцов приведены в таблице 2.

Таблица 2
Характеристика образцов панели РП (+/-) ER/PR РМЖ
Номер образца	Содержание рецепторов к эстрогену	Содержание рецепторов к прогестерону
№ 1	0(-)	0(-)
№ 2	0(-)	0(-)
№ 3	0(-)	0(-)
№ 4	0(-)	0(-)
№ 5	1+(+)	0(-)
№ 6	3+(+++)	0(-)
№ 7	0(-)	1+(+)
№ 8	0(-)	2+(++)
№ 9	0(-)	3+(+++)
№ 10	1+(+)	1+(+)
№ 11	1+(+)	2+(++)
№ 12	1+(+)	3+(+++)
№ 13	2+(++)	1+(+)
№ 14	2+(++)	2+(++)
№ 15	3+(+++)	1+(+)
№ 16	3+(+++)	2+(++)
№ 17	3+(+++)	3+(+++)

Результаты проверки трех серий тест-системы «Набор реагентов для одновременного или раздельного иммунногистохимического выявления рецепторов эстрогена, прогестерона и HER2» (РП (+/-) ER/PR РМЖ) представлены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты проверки C1, C2 и C3 на панели РП (+/-) ER/PR РМЖ
Номер образца	определение рецепторов к эстрогену				определение рецепторов к прогестерону
	Контрольные значения	C1	C2	C3	Контрольные значения	C1	C2	C3
№ 1	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 2	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 3	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 4	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 5	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 6	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)
№ 7	0(-)	0(-)	1+(+)	(-)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)
№ 8	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	2+(++)	3+(+++)	2+(++)	2+(++)
№ 9	0(-)	0(-)	0(-)	0(-)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)
№ 10	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	2+(++)
№ 11	1+(+)	1+(+)	2+(++)	1+(+)	2+(++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)
№ 12	1+(+)	2+(++)	1+(+)	1+(+)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	2+(++)
№ 13	2+(++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)
№ 14	2+(++)	2+(++)	2+(++)	3+(+++)	2+(++)	2+(++)	3+(+++)	2+(++)
№ 15	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	1+(+)	1+(+)	1+(+)	1+(+)
№ 16	3+(+++)	2+(++)	3+(+++)	3+(+++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)	2+(++)
№ 17	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)	3+(+++)

По результатам анализа видно, что по критериям чувствительность и специфичность (по определению 0 и 3+ образцов) экспериментальные серии тест-систем для определения гормонального статуса практически полностью соответствуют контрольным данным рабочей панели. По образцам, требующим дополнительной проверки (1+ и 2+), результаты, полученные на экспериментальных сериях, очень близки к таковым контрольным.

Пример 3. Для проверки экспериментальных наборов реагентов на случайной выборке из клинического материала был сформирован массив образцов тканей опухоли молочной железы, собранный из операционного материала и образцов после биопсии (171 образец). Для каждого из образцов был доступен клинический диагноз относительно гормонального статуса опухоли и наличия в них маркеров HER2.

Для экспериментального набора провели скрининговый анализ массива случайной выборки материала РМЖ на определение маркеров HER2, эстрогена и прогестерона. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Результаты проверки тест системы на массиве образцов тканей РМЖ
Клинический диагноз и количество образцов по отношению к HER2	Данные, полученные при использовании экспериментальной тест-системы на определение HER2	Клинический диагноз и количество образцов по отношению к рецепторам эстрогена	Данные, полученные при использовании экспериментальной тест-системы на определение рецепторов эстрогена	Клинический диагноз и количество по отношению к рецепторам прогестерон	Данные, полученные при использовании экспериментальной тест-системы на определение рецепторов прогестерона
3+(26 образцов)	3+(20 образцов)	3+(88 образцов)	3+(76 образцов)	3+(78 образцов)	3+(70 образцов)
	2+(4 образца)		2+(2 образца)		2+(8 образца)
	1+(-)		1+(5 образца)		1+(-)
	0(2 образца)		0(5 образцов)		0(-)
2+(12 образцов)	3+(1 образец)	2+(27 образцов)	3+(4 образца)	2+(18 образцов)	3+(3 образца)
образцов)	2+(6 образцов)		2+(22 образца)		2+(13 образцов)
	1+(3 образца)		1+(1 образец)		1+(1 образец)
	0(2 образца)		0(-)		0(1 образец)
1+(24 образца)	3+(5 образцов)	1+(6 образцов)	3+(4 образца)	1+(14 образцов	3+(1 образец)
	2+(2 образца)		2+(-)		2+(1 образец)
	1+(11 образцов)		1+(2 образца)		1+(9 образца)
	0(6 образцов)		0(-)		0(3 образца)
0(80 образцов)	3+(-)	0(31 образцов)	3+(1 образец)	0(37 образцов)	3+(2 образца)
	2+(4 образца)		2+(3 образца)		2+(3 образца)
	1+(4 образца)		1+(2 образца)		1+(3 образца)
	0(72 образца)		0(25 образцов)		0(29 образцов)
Статус не определен	3+(5 образцов)	Статус не определен	3+(14 образцов)	Статус не определен	3+(12 образцов)
(29 образцов)	2+(2 образца)	19 (образцов)	2+(-)	(24 образца)	2+(2 образца)
	1+(1 образец)		1+(2 образца)		1+(5 образцов)
	0(21 образец)		0(3 образца)		0(5 образцов)
	Итог		итог		итог
	3+(31 образец)		3+(99 образцов)		3+(88 образец)
	2+(18 образцов)		2+(27 образцов)		2+(27 образцов)
	1+(19 образцов)		1+(12 образцов)		1+(18 образцов)
	0(103 образца)		0(33 образца)		0(38 образца)

В результате анализа данных видно, что при тестировании тест-системы «Набор реагентов для одновременного или раздельного иммунногистохимического выявления рецепторов эстрогена, прогестерона и HER2» полученные при ее использовании результаты анализа достаточно адекватно соответствуют клиническим данным и процентное распределение образцов по бальной системе соотносится с результатами статистических исследование произвольных массивов образцов [6, 7].

Список используемой литературы

1. Hercept test TM, 16 Edition, Manual.

2. Walker RA, Harris AL, Balslev E. Immunohistochemistry and Breast Cancer. Diagnosis, Therapy and Prognosis. Corporate Headquartes Denmark. 2004, 23p.

3. Zafrani B, Aubriot MH, Mouret E et al. High sensitivity and specificity of immunohistochemistry for the detection of hormone receptors in breast carcinoma: comparison with biochemical determination in a prospective study of 793 cases. Histopathology 2000; 37(6): 536-545.

4. European Patent Application EP1357132.

5. Dako ER/PR pharmDx Kit For the Dako Autostainer English Code K4071 Edition 10/11

6. O'Malley F.P, Parkers R, Latta E et al. Am J ClinPathol 2001; 115 (4): 504-11.

7. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Морфологическое тестирование HER2-статуса. Методика и атлас. М.: Mediamedica, 2006.