применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины
| Классы МПК: | A61K39/135 вирус ящура |
| Автор(ы): | Стариков Вячеслав Алексеевич (RU), Лозовой Дмитрий Анатольевич (RU), Лёзова Татьяна Николаевна (RU), Михалишин Валерий Васильевич (RU), Михалишин Дмитрий Валерьевич (RU) |
| Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
2013-04-09 публикация патента:
27.06.2014 |
Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии. Предложено применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины, где этоний используют в виде 10%-ного водного раствора, который вносят в состав противоящурных вакцин в количестве 750 мкг на 1 см3 препарата. Изобретение расширяет список адъювантов для производства противоящурных вакцин и может быть использовано в биологической промышленности и научно-исследовательской работе при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных. 4 табл., 3 пр.
Формула изобретения
Применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины, где этоний используют в виде 10%-го водного раствора, который вносят в состав противоящурных вакцин в количестве 750 мкг на 1 см3 препарата.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии, расширяет набор адъювантов и может быть использовано в биологической промышленности и научно-исследовательской работе при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных.
Иммуногенность и эффективность вакцин в значительной степени увеличивается с использованием в технологии их изготовления неспецифических стимуляторов иммунитета - адъювантов.
Известно применение в качестве адъювантов при изготовлении различных антигенов гидроокиси алюминия Al(ОН)3, которая является слабым адъювантом в комплексе с антигенами.
Известны масляные адъюванты (типа адъюванта Фрейнда и др.), которые обладают выраженными иммуностимулирующими свойствами, но имеют повышенную реактогенность для животных.
Известны отдельные вещества из группы сапонинов, широко применяемые в настоящее время в качестве адъювантов при производстве различных типов вакцин [1].
В Российской Федерации при изготовлении вакцин чаще всего используют импортный сапонин, изготовленный фирмой «Merck» Германия.
Сапонины являются поверхностно-активными агентами и вызывают гемолиз эритроцитов in vitro. В 1995 году Kensil с коллегами выделил чистую фракцию Quil А сапонина с низкой токсичностью (QS 21) и определил структурные доли, ответственные за адъювантную активность [2].
Было доказано, что QS 21 является адъювантом для выработки цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL), индуцируя цитокины (IL-2 и IFN-y) и антитела Ig G 2а-изотипа [2].
Однако все известные сапонины с адъювантным действием (описанные в литературе и импортируемые из Германии и Англии) изготавливаются из растений, не произрастающих на территории нашей страны. Высокая стоимость импортных препаратов и ежегодное увеличение потребляемого в биопромышленности и научно-исследовательской работе сапонина, увеличивают затраты на его закупку за границей.
В задачу создания настоящего изобретения входил поиск нового адъюванта, обладающего высокими иммуностимулирующими свойствами и способного заменить импортный препарат сапонин при изготовлении различных антигенов, используемых для получения вакцин против инфекционных заболеваний животных и диагностических сывороток. При этом адъювант должен быть свободным от балластных веществ, не иметь в своем составе антигенов, похожих на антигены хозяина, не обладать онкогенными, аллергенными и токсическими свойствами, легко метаболизироваться в организме животных.
Технический результат от применения известного препарата этоний в качестве адъюванта заключается в расширении ассортимента адъювантов для производства эффективных, безопасных и экономически целесообразных сорбированных противоящурных вакцин.
Указанный технический результат достигнут применением препарата этоний в качестве адъюванта при производстве препаратов для активной иммунизации и для диагностики вирусных инфекций животных.
Этоний (Ethonium, Aethonium)
Русское название: Этоний.
Белый кристаллический (аморфный) порошок со специфическим запахом. Легко растворим в воде, растворим в спирте, рН 1% водного раствора 4,5-5,5. Препарат является бисчетвертичным аммониевым основанием, относится к поверхностно-активным соединениям. Активное вещество - этилендецилоксикарбонилметилдиметиламмония дихлорид: 1,2-этилен-бис-(N-диметил-карбдецилоксиметил)-аммония дихлорид. Фарм: C30H62N2O 4Cl2.
Фармакологическое действие: обладает бактериостатическим (препятствующим размножению бактерий) и бактерицидным (уничтожающим бактерии) свойством. Эффективен в отношении стрептококков, стафилококков и других микроорганизмов. Оказывает детоксицирующее действие на стафилококковый токсин. Обладает местно-анестезирующей активностью, стимулирует заживление ран.
Показания к применению: в качестве антимикробного, обезболивающего и ускоряющего заживление средства при трофических гнойных язвах (медленно заживающих гнойных дефектах кожи). Трещинах сосков, прямой кишки, при лучевых поражениях кожи, при зудящих дерматозах (кожных заболеваниях); стоматитах (воспаление слизистой оболочки полости рта), гингивитах (воспаление слизистой оболочки десны); при язвах роговицы, кератитах (воспаление роговицы), отитах (воспалении полости уха) и др.
Применение ЭТОНИЙ геля 1% показано как в фазах альтерации и экссудации, так и на этапе регенерации, что позволяет избежать необходимости применения нескольких препаратов с различными механизмами действия и вместе с тем значительно повысить эффективность лечения [3].
Онищук Ф.Д. с соавторами использовали этоний в составе иммуномоделирующего препарата, который применялся в качестве терапевтического средства для повышения иммунитета [4].
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
В качестве тестобъекта использовали вирус ящура. Инактивированную сорбированную вакцину против ящура готовят из вируса, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением 0,15% гемогидролизата и антибиотиков при рН 7,4÷7.6.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [5].
Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [6].
Авирулентный и очищенный антигенный материал представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура. При этом к производственному штамму предъявляют требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [7, 8].
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см3 не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см3 готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 1132,0 мкг до 2108,0 мкг.
К полученному концентрату добавляют дополнительно 10%-ный водный раствор этония или сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг его содержания в 1 см3 готового препарата.
Готовят 10%-ный раствор этония или сапонина на дистиллированной воде. Раствор автоклавируют при температуре 105°С не более 90 мин. Стерильный раствор хранят при температуре 4-6°С.
Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура представлен в таблице 1.
Допустимо изменять состав вакцины и процентное содержание отдельных ее компонентов, в том числе и этония. Позволительно изменять и пропись самих препаратов.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
После изготовления вакцину подвергают контролю на стерильность, безвредность и иммуногенность, после чего ее выпускают для практического применения. Авирулентность, безвредность и иммуногенность вакцины проверяют на крупном рогатом скоте.
Пример 2
Адъювантные свойства этония определяли на крупном рогатом скоте массой 250÷300 кг. С этой целью было приготовлено 2 препарата.
Препарат № 1 (содержание на одну прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура (КВЯ) типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов;
- этоний в количестве 3 мг. Этоний использовали ФС 42-1599-94, ОТК 6, партия 2 - Шосткинский завод химреактивов.
Препарат № 2 (содержание на одну прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов без этония (контроль).
Препараты в дозе 2 см3 вводили подкожно в область шеи. О напряженности иммунитета судили по титрам вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных с гомологичным вирусом ящура типа Азия-1 Шамир 3/89. При этом считали, что чем выше титры вируснейтрализующих антител, тем сильнее адъювантное действие, обусловленное этонием.
Результаты опыта представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что введение в вирусный препарат этония способствует более раннему образованию вируснейтрализующих антител. Так, препарат № 1 с этонием в прививной дозе в количестве 3 мкг обуславливает образование вируснейтрализующих антител через 5 суток в титре 3,33±0,68 log2, 10 суток - 4,25±0,38 log 2, 17 суток 5,08±0,73 log2, 30 суток - 4,00±0,43 log2. В эти же сроки титр антител у животных, привитых препаратом № 2, не содержащим этония (контроль), был равен: через 5 суток - 1,92±0,08 log2, 10 суток - 4,00±0,14 log2, 17 суток - 4,17±0,22 log2, 30 суток - 3,00±0,14 log2.
Таким образом, результаты таблицы 2 демонстрируют хорошие адъювантные свойства этония при оценке на крупном рогатом скоте.
Пример 3
В следующих опытах на крупном рогатом скоте определяли адъювантные свойства этония в сравнении с импортным сапонином, фирмы «Merck» Германия, в составе сорбированной противоящурной вакцины. Было приготовлено 4 серии вакцины, как описано ранее в примере 1.
Серия № 1 (содержание на прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 5,5 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);
- ГОА в количестве 20 мг;
- этоний в количестве 1,5 мг.
Серия № 2 (содержание на прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 5,5 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);
- ГОА в количестве 20 мг;
- сапонин в количестве1,5 мг.
Серия № 3 (содержание на прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура типа C564 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);
- ГОА в количестве 20 мг;
- этоний в количестве 1,5 мг.
Серия № 4 (содержание на прививную дозу):
- антиген культурального вируса ящура типа C564 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);
- ГОА в количестве 20 мг;
- сапонин в количестве 1,5 мг.
Препараты вводили в дозе 2 см3 крупному рогатому скоту подкожно в область шеи. О напряженности иммунитета судили по титрам вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных с гомологичным вирусом ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 и типа С564. Полученные результаты представлены в таблицах 3, 4.
Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 3, сорбированная противоящурная вакцина типа Азия-1 Шамир 3/89 серии № 1 с этонием 1,5 мг в прививной дозе обуславливает образование вируснейтрализующих антител: через 10 суток в титре 5,80±0,40 log2 и через 21 сутки 5,75±0,24 log2 . Титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых сорбированной вакциной типа Азия-1 Шамир 3/89 серии № 2 с сапонином 1,5 мг в прививной дозе, был равен: через 10 суток 5,70±0,56 log2 и 21 сутки 5,60±0,32 log2. Анализируя титры вируснейтрализующих антител, существенной разницы между адъювантной активностью этония и сапонина практически нет.
В таблице 4 показаны результаты иммуногенной активности сорбированной вакцины типа С564 . Так, титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых вакциной серии 3 с этонием 1,5 мг в прививной дозе, составляет через 10 суток 5,40±0,39 log2 и через 21 сутки 5,90±0,30 log2. Титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых вакциной серии 4 с сапонином 1,5 мг в прививной дозе, был равен: через 10 суток 5,75±0,64 log2 и через 21 сутки 5,81±0,41 log2. Как видно из таблицы 4, существенной разницы между адъювантной активностью этония и сапонина и в этом опыте также нет.
Таким образом, препарат этоний обладает хорошей адъювантной активностью в составе сорбированной противоящурной вакцины и удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к адъювантам.
Источники информации:
1. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адьюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М.: «Медицина», 1969 г., с.18.
2. Kensil C.R. Saponins as vaccine adjuvants // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. - 1996. - V.13. - P.1 - 55.
3. Лечение ран и раневых инфекций - URL: http://www.msmg.ru/php/contents.php?id=828 (дата обращения 28.11.12).
4. Заявка на изобретение № 99116458, А61К 31/41, 10.06.2001.
5. Патент РФ № 594771, А61К 39/12, C12N 7/04, 07.07.1993.
6. Патент РФ № 2054039, C12N 7/02, А61К 39/135, 10.02.1996.
7. Ререр Х. Ящур/Перевод с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971-432 с.
8. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - c.231-250.
| Таблица 1 | |||
| Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура | |||
| Оптимальная рецептура противоящурной инактивированной сорбированной вакцины (мкг в 1 см3 готового препарата) | |||
| Ингредиенты | минимум | средний | максимум |
| Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S и 75S) компонентов вируса ящура | 3,0 | >3,0 | >3,0 |
| ГОА | 1132,0 | 1620, | 2108,0 |
| Этоний/сапонин | 750,0 | 750,0 | 750,0 |
| Поддерживающая среда | до 1000000,0 | до 1000000,0 | до 1000000,0 |
| Таблица 2 | |||||||
| Адъювантные свойства этония в опыте на крупном рогатом скоте | |||||||
| № вакцины | № животного | Титр ВНА в сыворотке крови против КВЯ типа Азия-1 Шамир 3/89, log 2 | Результаты контрольного заражения | ||||
| д/в | 5 СПВ | 10 СПВ | 17 СПВ | 30 СПВ | |||
| 1 Азия-1 Шамир 3/89 - 6 мкг + 3 мг этония в дозе 2 см3 | 1 | н/о | 2,00 | 3,75 | 5,25 | 4,75 | 2/3 |
| 2 | н/о | 3,75 | 4,00 | 3,75 | 3,25 | ||
| 3 | н/о | 4,25 | 5,00 | 6,25 | 4,00 | ||
| M±m | 3,33±0,68 | 4,25±0,38 | 5,08±0,73 | 4,00±0,43 | |||
| p<0,05 | p<0,01 | p<0,025 | p<0,025 | ||||
| 2 Азия-1 Шамир 3/89 - 6 мкг в дозе 2 см3 | 4 | н/о | 1,75 | 3,75 | 3,75 | 2,75 | 0/3 |
| 5 | н/о | 2,00 | 4,00 | 4,50 | 3,00 | ||
| 6 | н/о | 2,00 | 4,25 | 4,25 | 3,25 | ||
| M±m | | 1,92±0,08 | 4,00±0,14 | 4,17±0,22 | 3,00±0,14 | ||
| p<0,005 | p<0,001 | p<0,05 | p<0,001 | ||||
| Контроль 1 | | + | |||||
| Контроль 2 | + | ||||||
| Примечание: числитель - количество защищенных животных; | |||||||
| знаменатель - количество животных в опыте; | |||||||
| н/о - не обнаружено; | |||||||
| д/в - до вакцинации; | |||||||
| СПВ - сутки после вакцинации | |||||||
| Таблица 3 | |||||
| Сравнительное изучение адъювантной активности этония и сапонина в составе сорбированной противоящурной вакцины типа Азия-1 | |||||
| № серии | Характеристика вакцины | № животного | Титр вируснейтрализующих антител у крупного рогатого скота, log2 | ||
| до вакцинации | 10 суток после вакцинации | 21 сутки после вакцинации | |||
| 1 | Антиген-Азия-1 Шамир 3/89 - 5,5 мкг иммуногенных компонентов ГОА-20 мг Этоний-1,5 мг | 5,75 | 5,25 | ||
| 1 | <1 | 4,50 | 5,25 | ||
| 2 | <1 | 5,75 | 6,50 | ||
| 3 | <1 | 6,00 | 5,75 | ||
| 4 | <1 | 7,00 | 6,00 | ||
| 5 | <1 | 5,80±0,40 | 5,75±0,24 | ||
| p<0,001 | p<0,001 | ||||
| 2 | Антиген-Азия-1 Шамир 3/89 - 5,5 мкг иммуногенных компонентов ГОА - 20 мг Сапонин - 1,5 мг (контроль) | 4,75 | 5,00 | ||
| 6 | <1 | 4,00 | 5,25 | ||
| 7 | <1 | 6.75 | 6,25 | ||
| 8 | <1 | 6,75 | 6,50 | ||
| 9 | <1 | 6,25 | 5,00 | ||
| 10 | <1 | 5,75±0,56 | 5,60±0,32 | ||
| p<0,001 | p<0,001 | ||||
| Таблица 4 | |||||
| Сравнительное изучение адъювантной активности этония и сапонина в составе сорбированной противоящурной вакцины типа С | |||||
| № серии | Характеристика вакцины | № животного | Титр вируснейтрализующих антител у крупного рогато скота, log2 | ||
| до вакцинации | 10 суток после вакцинации | 21 сутки после вакцинации | |||
| 5,25 | 6,25 | ||||
| Антиген-С564 - 6 мкг | 1 | <1 | 6,00 | 6,00 | |
| иммуногенных | 2 | <1 | 4,25 | 5,00 | |
| компонентов | 3 | <1 | 5,00 | 6,75 | |
| 3 | ГОА - 20 мг | 4 | <1 | 6,50 | 5,50 |
| Этоний - 1,5 мг | 5 | <1 | 5,40±0,39 | 5,90±0,30 | |
| | p<0,001 | p<0,001 | |||
| Антиген-С564 - 6 мкг | | 7,25 | 7,00 | ||
| иммуногенных | 6 | <1 | 5,25 | 5,75 | |
| 4 | компонентов | 7 | <1 | 4,25 | 5,25 |
| ГОА - 20 мг | 8 | <1 | 6,25 | 5,25 | |
| Сапонин - 1,5 мг | 9 | <1 | 5,75±0,64 | 5,81±0,41 | |
| | (контроль) | | p<0,005 | p<0,001 | |
