флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2

Формула изобретения

1. Флуоресцентный зонд следующей структурной формулы:

1-[3-(2,4-динитрофениламино)пропаноил]-2-[8-(9-антрил)-7Е-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДФА-ФХ).

2. Тест-система для определения активности фосфолипазы А2 группы IIA (секФЛА2(IIA)), включающая зонд по п.1, мицеллярную матрицу, буферный раствор, диглим и фосфолипазу А2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к флуоресцентным зондам, которые могут быть использованы в качестве субстратов для фосфолипаз А1 и А2, а также к тест-системе для определения активности различных представителей фосфолипазы А2(группы IB, IIA, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, X, XIIA), в том числе, в сыворотке крови человека в случае острых патологических процессов.

Основной фосфолипазой А2, присутствующей в крови при воспалении, является фосфолипаза А2 группы IIA (секФЛА2(IIA)). Поэтому определение активности секФЛА2(IIA) является актуальным для поиска новых лекарств при лечении воспаления и заболеваний, в которые вовлечены воспалительные процессы. Повышение активности секФЛА2(IIA) в крови пациентов наблюдается при сердечно-сосудистых [Mol Cell Biochem. 2005; 270(1-2):107-13] и онкологических заболеваниях, ревматоидном артрите [7 Biol Chem. 2011 Jan 28;286(4):2492-503] и др. В настоящее время в клинической практике используют препараты на основе ингибиторов активности секФЛА2(ПА). Контроль за активностью секФЛА2(ПА) необходим также для коррекции лечения заболеваний.

В настоящее время тест-системы для определения активности секФЛА2(IIA) в клинической практике не существует. Присутствующий на рынке набор для определения активности секФЛА2(IIA), производимый фирмой Cayman chemical, не предназначен для клинических исследований. Этот набор основан на колориметрическом методе детектирования активности и рассчитан на определение активности секФЛА2(ПА) в образцах, очищенных от различных примесей и ингибиторов, которые препятствуют интерференции при измерении абсорбции. Таким образом, данный набор не позволяет определять активность секФЛА2(IIA) в биологических жидкостях.

Применение флуоресцентно-меченых фосфатидилхолинов - субстратов секФЛА2(IIA) человека - представляется наиболее рациональным при создании диагностикума для определения активности этого фермента в сыворотке крови человека. Одним из подходов является дизайн синтетических аналогов фосфатидилхолина с модифицированными жирнокислотными цепями, одна из которых несет флуоресцентную группу, а другая - группировку-тушитель флуоресценции. Ввиду близости обеих группировок испускание флуорофора затушено (эффект проявляется на расстояниях менее 5-7 нм). Под действием фосфолипазы А2 одна из жирнокислотных групп отщепляется и, вследствие расхождения флуорофора и тушителя, интенсивность флуоресценции возрастает пропорционально фосфолипазной активности, которую можно получить, считывая испускание образца на флуориметре (или, что проще и дешевле, на флуоресцентном ридере). Такой подход уже применялся для определения активности ряда ферментов из различных природных источников (см., например, Anal. Biochem. 1994, 219, 1-8; Anal. Biochem. 1999, v. 276, 27-35; Science. 2001, 292 (5520), 1385-1388). Так, аналог фосфатидилхолина, меченный BODIPY-алкильным (BODDPY=4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен) остатком с простой эфирной связью в sn-l положении и несущий N-(2,4-динитрофенил)-8-аминооктаноильный остаток в sn-2 положении, оказался хорошим субстратом для сывороточной ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов (чувствительность 6 мкмоль мин(-1) мг(-1)) [Anal. Biochem. 1999, 276, 27-35]. В той же работе показано, что аналоги фосфатидилэтаноламина, несущие в sn-2 положении BODIPY-пентаноильную группу, а по аминогруппе полярной головки - 2,4-динитрофенильную группу-тушитель, являются хорошими субстратами для цитозольной фосфолипазы А2 (ФЛА2) (8 и 15 мкмоль мин(-1) мг(-1)). Минимальные количества детектируемых ферментов были 0.1 нг и 50 нг, соответственно. Один из указанных субстратов был успешно применен для визуализации активности цитозольной ФЛА2 в живых эмбрионах полосатого данио (известного больше как zebrafish) [Science. 2001, 292 (5520), 1385-1388]. Близкий метод был также применен для определения активности гликолипид-переносящего белка [J. Lipid Res. 2007,48,1518-1532].

Аналогами зонда, представленного в настоящем изобретении, являются пирен-содержащие фосфолипиды. Их предложено использовать для непрерывного мониторинга активности липаз и фосфолипаз, в том числе в сыворотке [Patent US 4668623 (А) - 1987-05-26]. В ранних работах [Clin. Chem. 1985, 31, 714-717] были использованы подходы, основанные на возрастании флуоресценции мономера пиренильного флуорофора, высвобождающегося в результате гидролиза исходных фосфолипидов, флуоресценция которых обусловлена, в основном, эксимерами пирена. Эксимеризация связана со склонностью к ассоциации пространственно сближенных остатков пирена. Однако затем было показано, что изменение соотношения интенсивности флуоресценции эксимер/мономер обусловлено посторонними физико-химическими факторами, а не действием фосфолипазы А2. В связи с этим, те же авторы [Anal. Biochem. 1988, 170, 248-255] разработали субстрат, несущий пиренил и группировку-тушитель-1-пальмитоил-2-[6-(пирен-1-ил)гексаноил]-5/1-глицеро-3-фосфо-(М-тринитрофенил)аминоэтанол; под действием панкреатической фосфолипазы А2 зонд расщепляется с высвобождением в водную фазу пиренилгексановой кислоты, что сопровождается разгоранием флуоресценции мономера пиренила. Однако в литературе отсутствуют сведения о применении данного зонда для измерений активности секФЛА2(IIA) в сыворотке, что может быть связано, например, с низким сродством данного субстрата к секФЛА2(IIA) или с присутствием альбумина и других компонентов сыворотки.

Для измерения активности фосфолипазы А2 в присутствии альбумина была разработана тест-система с использованием фосфолипидов, несущих в sn-2-положении 10-пиренилдеканоильный остаток, в том числе- 1-пальмитоил-2-[10-(пирен-1-ил)деканоил]-5и-глицеро-3-монометилфосфатидовой кислоты(PFA) [Anal. Biochem. 1989, 177, 103-109]. В водной среде такие фосфолипиды образуют везикулы с минимальной флуоресценцией мономера (за счет эксимеризации пиренила). Высвобождающаяся в результате ферментативного расщепления 10-пиренилдекановая кислота «растворяется» в реакционной среде только в присутствии альбумина, который связывает жирные кислоты с высоким сродством. При этом наблюдается усиление флуоресценции пиренильного мономера. Тест-система с PFA позволяет измерять пикомолярные количества фосфолипидов, гидролизуемых в минуту под действием фермента из поджелудочной железы или из ядов, и может быть использована для оценки активности секФЛА2(IIA) в необработанных экстрактах с низкой удельной активностью. Фактически это единственный метод определения секФЛА2(IIA) в сыворотке крови, который применяется сегодня (например, [J Am Coll Cardiol. 2005, 46, 1249 - 1257]). Чувствительность детектирования по фосфолипазе А2 из пчелиного яда - 0.0001 Ед/мл.

Недостатком описанной тест-системы [Anal. Biochem. 1989, 177, 103-109] является то, что ключевой зонд PFA не отличается стабильностью. Возможно, это одна из причин, по которой данная тест-система не получила широкого применения: судя по публикациям, она используется одним и тем же коллективом авторов [JAm Coll Cardiol. 2005,46,1249 - 1257; Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2007,27, 1177-1183].

Таким образом, как видно из описания аналогов, ни один из известных флуоресцентных зондов и, соответственно, тест-системы на их основе по разным причинам не могут использоваться в качестве диагностикумов в клинической практике для определения активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека.

Задачей настоящего изобретения являлось синтезирование флуоресцентного зонда, который обладал бы хорошей стабильностью, и создание тест-системы на его основе, обеспечивающей возможность определения активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека в клинических условиях. Для решения этой задачи синтезирован фосфолипидный флуоресцентный зонд следующей структурной формулы: 1-[3-(2,4-динитрофениламино)пропаноил]-2-[8-(9-антрил)-7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДФА-ФХ).

Задача решается также созданием тест-системы для определения активности секФЛА2(IIA), включающей зонд ДФА-ФХ, мицеллярную матрицу, буферный раствор, диглим и фосфолипазу А2 пчелиного яда в качестве стандарта

Предлагаемый в настоящем изобретении зонд ДФА-ФХ обладает хорошей стабильностью. Антрилвинильный флуорофор, входящий в его состав, характеризуется небольшими, по сравнению с пиренилом, размерами, малой полярностью, высокой химической и фотоустойчивостью [Chem. Phys. Lipids. 1990. 3, 185-189]. Значительный стоксов сдвиг - интервал между максимумами возбуждения (350-380 нм) и испускания (410-440 нм) - облегчает применение флуоресцентных ридеров при использовании ДФА-ФХ. Антрилвинил хорошо тушится динитрофенильным хромофором, другой составной частью зонда ДФА-ФХ, не чувствителен к воде.

Синтез зонда ДФА-ФХ показан на Схеме 1. Исходным веществом служил лизофосфатидилхолин (I), полученный ферментолизом фосфолипазой A₂ яичного фосфатидилхолина. Ацилирование лизофосфатидилхолина 8-антрилоктеновой кислотой (получена по известному методу (Биоорган. химия. 1979, 5, 588-594)) привело к 1-ацил-2-[8-(7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолину (II), обработкой которого липазой из Мисог javanicus был получен 2-[8-(7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (III). Ацилирование последнего N-динитрофенил- -аланином дало конечный 1-[3-(2,4-динитрофениламино)пропаноил]-2-[8-(9-антрил)-7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (IV, ДФА-ФХ).

Схема 1. Получение зонда ДФА-ФХ. k=13, 15. 1. 8-(9-Антрил) -7E-октеновая кислота, дициклогексилкарбодиимид, 4-пирролидинопиридин. 2. Липаза из Мисог javanicus. 3. N-Динитрофенил- -аланин, дициклогексилкарбодиимид, 4-пирролидинопиридин. Тест-система с использованием описанного зонда включает мицеллярную матрицу, буферный раствор, диглим и фосфолипазу А2 пчелиного яда в качестве стандарта.

Изобретение иллюстрируется рисунками (Фиг.1, Фиг.2, Фиг.3).

На Фиг.1. приведены средние значения (n=2) изменения интенсивности флуоресценции в системе с зондом ДФА-ФХ в растворе альбумина (конечная концентрация 5 мг/мл) в ходе ферментативной реакции в зависимости от активности фосфолипазы А2 пчелиного яда. Линия 1а - показатели интенсивности флуоресценции без добавления фермента в реакционную смесь, линия 1б - активность фосфолипазы А2 соответствует 0,02 ед/мл, линия 1в - активность соответствует 0,06 ед/мл, линия 1 г -активность соответствует 0,1 ед/мл. По оси ординат приведены показания ридера.

На Фиг.2 приведены средние значения (n=2) изменения интенсивности флуоресценции в системе с зондом ДФА-ФХ в 10%-ной различных образцах сыворотки (линии 2б, 2в, 2 г, 2д соответствуют сыворотке 1, сыворотке 2, сыворотке 3, сыворотке 4) и в растворе альбумина (конечная концентрация 5 мг/мл, линия 2а).

На Фиг.3 приведены средние значения (n=2) изменения интенсивности флуоресценции в системе с зондом ДФА-ФХ в образцах тканевого экстракта сердечной миксомы (линия 3а), 10% сыворотки пациента с острым коронарным синдромом (линия 3б), с добавлением в реакционную смесь фосфолипазы А2 пчелиного яда с активностью 0,02 ед/мл (линия 3в) и в растворе альбумина (конечная концентрация 5 мг/мл, линия 3 г).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

2-[8-(7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (II).

К раствору 50 мг лизофосфатидилхолина и 30 мг 8-антрилоктеновой кислоты в смеси диметилсульфоксид-хлороформ, ~1:1, в атмосфере сухого аргона прибавляли 20 мг 4-пирролидинопиридина и 70 мг дициклогексилкарбодиимида (ДЦК). Перемешивали, упарили в вакууме и лиофилизовали, из остатка колоночной хроматографией на силикагеле в градиенте метанола в хлороформе (10 33%) выделяли 44 мг (57%) 1-ацил-2-[8-(7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолина (II) в виде слабо-желтой аморфной массы, индивидуальной хроматографически и обладающей одинаковой с природным (яичным) фосфатидилхолином подвижностью при ТСХ (пластинки Merck Kieselgel 60) в системах хлороформ-метанол-вода, 65:25:4 (R_f 0.4) и хлороформ-метанол-7 н. NH₄OH, 65:35:7 (R_f 0.6) (обнаружение УФ-облучением и фосфорномолибденовой кислотой с нагреванием). Фосфолипид (II) далее применяли без дополнительной очистки.

Это вещество (20 мг), растворенное в хлористом метилене, обрабатывали раствором липазы (~900 ед.) из Mucor javanicus (Sigma) в буфере 100 мМ Tris·HCl, 5 мМ CaCl₂, рН 7.2, при 37°C и перемешивании, контролируя ход ферментолиза ТСХ в системе хлороформ-метанол-вода, 65:25:4 (см. выше). Через несколько часов к смеси добавляли насыщенный водный NaCl и экстрагировали смесью хлороформ-метанол, 3:1. Экстракт упаривали, из остатка хроматографией на силикагеле в смесях хлороформ-метанол-вода выделяли 10 мг (68%) лизолипида (III) в виде слабо-желтой аморфной массы, индивидуальной хроматографически. C₃₀H ₄₀ NO₇P [М+Н]⁺ 558.256, найдено 558.230 (масс-спектр электрораспыления).

Пример 2

1-[3-(2,4-динитрофениламино)пропаноил]-2-[8-(9-антрил)-7E-октеноил)]-sn-глицеро-3-фосфохолин (IV, ДФА-ФХ). К раствору 101 мг фосфатида (III) и 6 мг N-динитрофенил- -аланина в диметилсульфоксиде в атмосфере сухого аргона прибавляли 4 мг 4-пирролидинопиридина и при перемешивании 20 мг ДЦК; ТСХ-контроль в системе хлороформ-метанол-вода, 65:25:4 (обнаружение УФ-облучением и фосфорномолибденовой кислотой с нагреванием). Через сутки смесь лиофилизовали, из остатка хроматографией на силикагеле в смесях хлороформ-метанол-вода выделяли 5 мг исходного фосфатида (III) и 2 мг (23% в расчете на вступивший в реакцию фосфатид) ДФА-ФХ (IV) в виде оранжево-красного аморфного вещества, индивидуального хроматографически. C₃₉H₄₇ N₄O₁₂P [M+H]⁺ 795.301, найдено 795.300; [M+Na]+817.774. найдено 817.708 (масс-спектр MALDI).

Пример 3

Тест-система для определения активности секФЛА2(IIA) с помощью ДФА-ФХ

Для приготовления тест-системы брали вышеописанный зонд и мицеллярную матрицу, которую готовили из неионого детергента Brij 97 (Sigma, США) при соотношении 1/10 (концентрация зонда в системе 12.6 нМ). В систему добавляли 3% (об.) диглима, буфер -100mM TrisHCl, рН 8.0, 0.15М NaCl. Непосредственно перед измерением прибавляли 5 мкл 80 мМ раствора CaCl₂ (до конечной концентрации 2 мМ).

Пример 4

Измерение активности ФЛА2 из пчелиного яда в растворе альбумина и измерение в сыворотке крови человека, применение фосфолипазы А2 пчелиного яда в качестве стандарта

Измерения проведены в 96-луночном планшете на флуоресцентном ридере (Perkin Elmer Fusion Alpha-FP HT Multimode Microplate Reader), настройки ридера: ex=400 нм, em=460 нм. Конечный объем образца в лунке 200 мкл, 15 измерений каждые 5 мин.

Как видно на Фиг.1, сигнал от системы в альбумине изменяется незначительно. Добавление фосфолипазы А2 пчелиного яда приводит к возрастанию флуоресценции, хотя и небольшому относительно значений в начальный момент времени. Так, при активности фосфолипазы А2 пчелиного яда 0.1 ед/мл возрастание происходит всего на 100-150 RFU. Общее для всех кривых небольшое падение флуоресценции в интервале до 20 мин можно объяснить тем, что ионы Ca²⁺ , необходимые для работы фермента, не сразу становятся доступны (CaCl₂ подается в систему непосредственно перед измерением). Тем не менее, даже если начинать отсчет ферментативной реакции примерно с 20 мин, очевидно, что чувствительность детектирования невысока.

При добавлении системы с зондом к образцам сыворотки (Фиг.2) разница в разгорании флуоресценции с 20-й минуты (показания ридера приведены по оси ординат, время по оси абсцисс) по сравнению с фоновым раствором альбумина очень мала. Более низкие абсолютные значения флуоресценции в образцах сыворотки могут быть связаны с более низким содержанием в них альбумина.

Для оценки активности секреторной секФЛА2(IIA) в образцах сыворотки в некоторые лунки к системе с зондом добавляли 20 мкл раствора ФЛА2 пчелиного яда заданных концентраций в стандартном растворе альбумина (50 мг/мл - концентрация, моделирующая усредненную сывороточную), снимали показания ридера, а затем сопоставляли наклоны полученных кривых возрастания флуоресценции с таковыми для различных активностей фосфолипазы А2 пчелиного яда.

Пример 5

Измерение активности секФЛА2(IIA) в тканевом экстракте и сыворотке крови пациента с острым коронарным синдромом.

Измерения проведены в 96-луночном планшете на флуоресцентном ридере (Perkin Elmer Fusion Alpha-FP HT Multimode Microplate Reader), настройки ридера: ex=400 нм, em=460 нм. Конечный объем образца в лунке 200 мкл.

Для получения кривых возрастания флуоресценции к 180 мкл субстрата в буфере непосредственно перед измерением добавляли 20 мкл раствора альбумина (конечная концентрация 5 мг/мл); 20 мкл раствора фосфолипазы А2 пчелиного яда заданной активности (0,02 ед/мл) в стандартном растворе альбумина (50 мг/мл -концентрация, моделирующая усредненную сывороточную); 20 мкл экстракта ткани опухоли сердца человека (миксомы) в стандартном растворе альбумина; 20 мкл сыворотки пациента с острым коронарным синдромом.

Как видно на Фиг.3, в образцах с сывороткой пациента и экстрактом ткани опухоли сердца человека сигнал от системы значительно возрастает по сравнению с фоновым раствором альбумина, а также отличается от кривой возрастания флуоресценции, полученной для активности фосфолипазы А2 пчелиного яда 0,02 ед/мл. Это свидетельствует о наличии в данных образцах активности секФЛА2(IIA), большей, чем 0,02 ед/мл.

Таким образом, тест-система с зондом ДФА-ФХ может быть использована для определения активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови в случае острых патологических процессов, а также в тканевых и клеточных экстрактах, где активность секФЛА2(IIA) значительна.