способ получения инъекционного заменителя синовиальной жидкости

Формула изобретения

Способ получения инъекционного заменителя синовиальной жидкости, включающий измельчение, экстракцию, протеолиз и осаждение шкуры сельскохозяйственных животных, отличающийся тем, что сначала готовят лиофилизат комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов и белков, для этого очищенную шкуру от сала и жира замораживают и измельчают до стружки, после этого замораживают повторно и осуществляют экстракцию нагретым до 80°С раствором 0,9% хлорида натрия, экстракт фильтруют, добавляют папаин из расчета 1 мг на 1 л экстракта, термостатируя экстракт при температуре 40°С 24 часа, затем осаждают гликозаминогликаны из протеолизата с добавлением равного объема 4% калия ацетата в этаноле, осадок отделяют декантацией и вновь растворяют в дистиллированной воде, после чего полученный раствор подвергают вакуумной сушке в течение 48 часов с достижением остаточной влажности 5%, далее готовят лиофилизат коллагена, для этого отмытую от остатков жира костную ткань подвергают декальцинации 0,5 М хлороводородной кислоты, из полученного костного матрикса экстрагируют неколлагеновые белки 8 М мочевиной с добавлением 1% 2-меркаптоэтанола, к 500 г диссоциативно экстрагированного костного матрикса добавляют 1 л 0,01 М раствора соляной кислоты, в котором растворяют 2 г пепсина, смесь периодически перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 48 часов, после чего из смеси декантированием и фильтрацией отделяют коллоидный раствор солюбилизированного костного коллагена, а нерастворившийся матрикс вновь заливают раствором пепсина в 0,01 М соляной кислоты, процедуру протеолиза повторяют до полного растворения матрикса, далее растворы коллагена на каждом этапе объединяют, полученный раствор освобождают от нерастворившихся частиц центрифугированием, высаливают хлоридом натрия, диализуют, лиофильно высушивают и определяют концентрацию коллагена, на завершающем этапе готовят 2% раствор комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов и белков в дистиллированной воде и смешивают его с лиофилизатом коллагена до получения вязкости 8,0-8,2 относительно дистиллированной воды, полученный препарат упаковывают во флаконы и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к артрологии, и может быть использовано для лечения дегенеративно-дистрофических процессов в суставах путем периартикулярного введения искусственной синовиальной жидкости.

Известна технология синовиального протезирования препаратами экзогенного гиалуроната натрия высокой степени очистки с очень хорошими вязкоупругими свойствами (Сущук Е.А., 2007). Введение синовиальных протезов уменьшает болевой синдром, улучшает подвижность суставов, позволяет пациентам сократить употребление нестероидных противовоспалительных препаратов, а также отсрочить проведение ортопедической операции протезирования сустава.

В качестве прототипа является средство «Ферматрон» (FERMATHRON) - вязкоэластичный препарат на основе гиалуроната натрия, применяемый для инъекций в синовиальное пространство коленного сустава пациентов, страдающих слабой или умеренной степенью остеоартроза. Введение «Ферматрона» в полость сустава вызывает улучшение вязко-эластичных и защитных свойств синовиальной жидкости. Препарат представляет собой 1% раствор гиалуронана (гиалуронат натрия, натриевая соль гиалуроновой кислоты) и синтезируется путем ферментации Streptococcus equi и тщательно очищается.

Однако данный препарат рекомендуется на ранних стадиях болезни, когда обнаруживаются лишь слабовыраженные признаки разрушения хряща. Кроме того, гиалуроновую кислоту - действующее вещество ферматрона получают бактериальным синтезом, что обусловливает его высокую стоимость.

Задачей настоящего изобретения является разработка и создание препарата, оказывающего стимулирующее хондрогенез, лубрикационное и обезболивающее влияние на суставной хрящ при различных стадиях остеоартроза и способ его получения на основе гиалуроновой кислоты в комплексе с сульфатированными гликозаминогликанами и белками из шкур и коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных.

Указанная задача решается тем, что очищенную шкуру от сала и жира замораживают и измельчают до стружки, после этого замораживают повторно и осуществляют экстракцию нагретым до 80°С раствором 0,9% хлорида натрия, экстракт фильтруют, добавляют папаин из расчета 1 мг на 1 л экстракта, термостатируя экстракт при температуре 40°С 24 часа, затем осаждают гликозаминогликаны из протеолизата с добавлением равного объема 4% калия ацетата в этаноле, осадок отделяют декантацией и вновь растворяют в дистиллированной воде, после чего полученный раствор подвергают вакуумной сушке в течение 48 часов с достижением остаточной влажности 5%, далее готовят лиофилизат коллагена, для этого отмытую от остатков жира костную ткань подвергают декальцинации 0,5 М хлороводородной кислоты, из полученного костного матрикса экстрагируют неколлагеновые белки 8 М мочевиной с добавлением 1% 2-меркаптоэтанола, к 500 г диссоциативно экстрагированного костного матрикса добавляют 1 л 0,01 М раствора соляной кислоты, в котором растворяют 2 г пепсина, смесь периодически перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 48 часов, после чего из смеси декантированием и фильтрацией отделяют коллоидный раствор солюбилизированного костного коллагена, а нерастворившийся матрикс вновь заливают раствором пепсина в 0,01 М соляной кислоты, процедуру протеолиза повторяют до полного растворения матрикса, далее растворы коллагена на каждом этапе объединяют, полученный раствор освобождают от нерасворившихся частиц центрифугированием, высаливают хлоридом натрия, диализуют и лиофильно высушивают, определяют концентрацию коллагена, на завершающем этапе готовят 2% раствор комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов и белков в дистиллированной воде и смешивают его с лиофилизатом коллагена до получения вязкости 8,0-8,2 относительно дистиллированной воды, полученный препарат упаковывают во флаконы и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр.

Настоящее изобретение поясняют подробным примером его осуществления и схемой, на которой иллюстрированы основные этапы осуществления способа.

Инъекционный заменитель синовиальной жидкости получают следующим способом.

На первом этапе готовят лиофилизат комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов и белков. Для этого после предварительной механической очистки шкур свиней от сала и жира шкуры замораживают и измельчают до стружки. Полученную стружку вновь замораживают, после чего прибавляют нагретый до 80°С раствор 0,9%-го хлорида натрия в тройном объеме от количества стружки. Полученный экстракт фильтруют на складчатом фильтре. После чего помещают в емкость и добавляют папаин из расчета 100 мг на 1 л экстракта. Емкость помещают в термостат при температуре 40°С на 24 часа. Осаждение комплекса гликозаминогликанов и гликопротеинов из протеолизата осуществляют добавлением равного объема 4%-го калия ацетата в этаноле. Осадок отделяют декантацией и вновь растворяют в дистиллированной воде. После этого полученный раствор комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов, белков подвергают вакуумной сушке в течение 48 часов с достижением остаточной влажности 5%.

Вторым этапом из минерализованной соединительной ткани готовят лиофилизат коллагена. Кортикальную костную ткань очищают от остатков мягких тканей, надкостницы и костного мозга. Очищенную ткань отмывают от остатков жира смесью спирт-диэтиловый эфир в соотношении 1:1, при этом количество обезжиривающей смеси должно быть втрое больше костной ткани по объему. Подготовленную таким образом костную ткань высушивают в токе воздуха в течение суток. Далее костную ткань измельчают, полученная фракция размером менее 0,5 см. Затем навеску очищенной, отмытой, измельченной костной ткани заливают пятикратным объемом раствора 0,5 М хлороводородной кислоты. Из полученного костного матрикса экстрагируют неколлагеновые белки 8 М мочевиной с добавлением 1% 2 - меркаптоэтанола. К 500 г диссоциативно экстрагированного костного матрикса добавляют 1 л 0,01 М раствора соляной кислоты, в котором растворяют 2 г пепсина, смесь при периодическом перемешивании выдерживают при комнатной температуре 48 ч, после чего из смеси декантированием и фильтрацией через марлю отделяют коллоидный раствор солюбилизированного костного коллагена, а нерастворившийся матрикс вновь заливают раствором пепсина в 0,01 М соляной кислоты. Процедуру протеолиза повторяют до полного растворения матрикса.

Растворы коллагена на каждом этапе объединяют, полученный раствор освобождают от нерасворившихся частиц центрифугированием, высаливают хлоридом натрия (при его концентрации, составляющей 25-30% от таковой в насыщенном растворе) и диализуют против дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Аликвоту коллагенового золя прецизионно взвешивают, лиофильно высушивают и определяют концентрацию коллагена в полученном лиофилизате повторным взвешиванием.

Завершающим этапом готовят 2% раствор комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов, белков в дистиллированной воде и смешивают его с лиофилизатом коллагена до получения вязкости 8,0-8,2 относительно дистиллированной воды, равную таковой у нормальной синовиальной жидкости.

Затем препарат упаковывают во флаконы и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр на ускорителе ЛУЭ-8-5 М, У003 MB. Этапы осуществления способа отражены на схеме.

Полученный препарат содержит (мг/100 мг):

Кальций - 0,330×10 ^-3

Фосфор - 0,150×10^-3

Общий белок - 56,0

Сиаловые кислоты - 0,350

Уроновые кислоты - 0,9

Коллаген - 27,94

Гиалуроновая кислота - 2,4

Предлагаемый способ изготовления инъекционного заменителя из неминерализованной соединительной ткани показал, что его применение в клинической практике позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов. Кроме того, предложенный целевой продукт является многокомпонентым, оказывая действие на различные звенья патогенеза дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов.