способ детекции ботулинических токсинов

Формула изобретения

1. Способ детекции ботулинических токсинов, включающий визуальное определение наличия ботулинических токсинов, отличающийся тем, что твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в раствор инертного белка на 30 мин, после чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч, после этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой, после чего определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке в местах нанесения исследуемого материала формируются серые пятна, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора инертного белка используют 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов.

Ботулизм - тяжелая токсикоинфекция с высокой летальностью (35-85%). Люди чрезвычайно чувствительны к ботулотоксинам. Смертельная доза токсина для человека составляет 1 нг/кг массы тела. Ботулинические токсины в обычных условиях внешней среды сохраняются до года, в консервированных продуктах - годами. Присутствие ботулотоксинов в пищевых продуктах не изменяет органолептических свойств последних.

Ботулинические токсины - яды биологического происхождения II группы патогенности, с наибольшей вероятностью могут быть использованы в качестве поражающих агентов биотерроризма.

Детекцию ботулотоксинов традиционно проводят двумя методами: постановкой реакций пассивной гемагглютинации (РПГА) и биологической нейтрализации токсина на белых мышах (РБНТ) с использованием диагностических противоботулинических поли- и моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F. Ориентировочный ответ в РБНТ выдается лишь через 2 суток, окончательный - через 4-8 сут. К сожалению, не всегда имеется возможность проведения работ с лабораторными животными, да и сроки получения результатов в РБНТ длительны. В связи с ограниченной разрешающей способностью агглютинационных методов диагностики, в РПГА не всегда удается обнаружить небольшое количество токсина в клиническом материале, положительном в РБНТ.

Поэтому разработка новых и усовершенствование существующих способов детекции ботулинических токсинов остаются актуальной задачей.

Один из способов обнаружения ботулотоксинов - постановка РПГА. Перед постановкой реакции исследуемый на ботулотоксины материал прогревают при 56°C 20 мин, адсорбируют 50% взвесью формалинизированных эритроцитов барана в течение 15 мин и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. РПГА с надосадочной жидкостью ставят в 96-луночном полистироловом планшете с четырьмя или пятью типами ботулинических иммуноглобулиновых антитоксических эритроцитарных диагностикумов. В лунки верхнего ряда микропланшета (за исключением предпоследней лунки) автоматическим дозатором вносят 50 мкл забуференного физиологического раствора pH 7.2 (ЗФР), содержащего 1% нормальной кроличьей сыворотки (разводящая жидкость). Затем в первую лунку вносят 50 мкл исследуемого материала и титруют, перемешивая содержимое лунок и перенося по 50 мкл из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 10 лунки включительно, из которой 50 мкл раститрованного исследуемого материала удаляют в дезинфицирующий раствор. Предпоследняя лунка содержит 50 мкл заведомо положительного образца (положительный контроль). Последняя лунка - контроль эритроцитарного диагностикума. После серии двукратного разбавления исследуемого материала в каждую лунку вносят по 1 капле ботулинического иммуноглобулинового антитоксического эритроцитарного диагностикума (из моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F). Планшет оставляют на 2-2.5 ч при комнатной температуре. После этого учитывают результаты: в лунках, которые содержат материал в котором присутствуют ботулотоксины, формируются «зонтики», в отсутствие ботулотоксинов в лунке формируются «пуговки». (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52.).

Однако данный способ недостаточно чувствителен. Он не всегда позволяет обнаруживать небольшое количество ботулотоксинов в образцах, положительных в реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах.

Наиболее близким к предлагаемому является практически 100% достоверный способ детекции ботулотоксинов - РБНТ, включающий введение внутрибрюшинно двум белым мышам по 0.5 мл исследуемого материала. Для контроля специфичности определения токсина четырем белым мышам вводят внутрибрюшинно по 1 мл смеси, состоящей из 0.5 мл материала, содержащего ботулотоксин, и 0.5 мл смеси из моновалентных концентрированных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E, F производства НПО «Аллерген» г. Ставрополь.

Смесь исследуемого материала выдерживают с противоботулиническими сыворотками при комнатной температуре в течение 15-30 мин с целью нейтрализации неизвестного ботулинического токсина соответствующими ему антитоксинами и после этого вводят смесь контрольным белым мышам. За мышами, которым ввели только материал, содержащий токсин, наблюдают 44-48 ч с целью выявления у них признаков отравления. Поражение белых мышей ботулиническим токсином проявляется в виде общей слабости, парезов задних конечностей и паралича диафрагмы. Это обусловливает характерные признаки отравления: лежачее положение животных, втянутые бока («осиная талия»), дыхание редкое и глубокое. Сроки проявления указанных признаков и сроки гибели животных зависят от дозы токсина, его активности и типа.

При наличии больших концентраций токсина гибель животных обычно наступает в течение первых суток. При малых концентрациях токсина в исследуемой пробе гибель мышей (или появление признаков отравления) может наблюдаться в более поздние сроки (3-8 сут). У животных (4 контрольные белые мыши), которым ввели смесь материала, содержащего ботулотоксины, с противоботулинической поливалентной сывороткой признаки отравления токсинами должны отсутствовать. Если опытные белые мыши погибают, а контрольные остаются живыми, выдают заключение о наличии ботулинических токсинов в исследуемом материале. Если и опытные, и контрольные мыши живы, то определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52).

Цель изобретения - сокращение времени обнаружения ботулотоксинов, упрощение способа, повышение доступности.

Поставленная цель достигается тем, что твердую пористую подложку перед нанесением исследуемого образца погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической диагностической сыворотки. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят на нее исследуемый материал (образцы клинического материала от больных или образцы пищевых продуктов) в объеме 1-2 мкл, через 15 мин после полного впитывания материала и подсыхания подложки ее промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2 (ФБР), содержащим 0.05% твина 20 (ФБР-твин), и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР). После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку на 1 ч помещают в поливалентную противоботулиническую сыворотку, меченную частицами коллоидного серебра. Далее подложку трехкратно промывают ФБР-твином, двукратно - дистиллированной водой и затем погружают в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра на 3-5 мин, после чего подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Результаты реакции учитывают визуально. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный белый цвет - определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку подсушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем погружают в раствор инертного белка и выдерживают в течение 30 мин при температуре 18-26°C, после чего подложку двукратно промывают ФБР-твином. Затем подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, при комнатной температуре на 1 ч, после этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале - если на подложке сформировались темно-серые пятна в местах нанесения образцов, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если подложка не окрасилась - материал не содержит ботулинических токсинов.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается как от прототипа, так и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ детекции ботулотоксинов, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках (нитроцеллюлозных мембранах) с применением в качестве диагностикума поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром. Предлагаемые режимы способа позволяют достичь поставленной цели - ускорить получение результатов анализа и отказаться от использования лабораторных животных, тем самым повысить доступность способа обнаружения ботулинических токсинов. При этом предлагаемый способ специфичен, характеризуется отсутствием положительного реагирования с материалом от больных острыми кишечными инфекциями, а также не контаминированными ботулотоксинами пищевыми продуктами и позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием.

Данный способ детекции ботулотоксинов может быть использован в клинических, санитарно-гигиенических и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся исследованиями на ботулизм.

Таким образом, предлагаемый способ детекции ботулотоксинов соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Предлагаемый способ детекции ботулотоксинов осуществляется следующим образом: твердую пористую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, либо фильтры «Synpor», Чехия) погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической против типов A, B, C, E, F сыворотки (производства НПО «Аллерген», г. Ставрополь), разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания и подсыхания на подложке образца ее помещают в чашку Петри, промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР), блокируя оставшиеся свободные участки на подложке в течение 30 мин при комнатной температуре. После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. Результаты реакции учитываются визуально после погружения подложки на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и последующего промывания проточной водой. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, то определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный (белый) цвет определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.

Параллельно ставят положительный контроль (материал заведомо содержит ботулотоксины, т.е. данный материал дал положительный результат в РБНТ) и отрицательный контроль (разводящая жидкость). В местах нанесения материала содержащего ботулотоксины формируются серые пятна, в местах нанесения разводящей жидкости серые пятна не формируются, подложка сохраняет первоначальный белый цвет.

Процедура мечения поливалентной противоботулинической сыворотки частицами коллоидного серебра, включает 2 этапа: приготовление раствора коллоидного серебра и мечения им специфических противоботулинических антител. Золь серебра получают восстановлением азотнокислого серебра боргидридом натрия. Для этого к 5 мл 0.05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливают равный объем 0.02% водного раствора азотнокислого серебра. Интенсивно встряхивают на шуттеле при комнатной температуре в течение 15 мин. Цельную поливалентную противоботулиническую сыворотку предварительно диализуют в течение 5-6 ч против дистиллированной воды, осветляют центрифугированием (12000g, 2 мин) и в объеме 62.5 мкл вносят в стакан, куда одномоментно быстро выливают 10 мл золя серебра. Смесь перемешивают на магнитной мешалке 20 мин при комнатной температуре, затем в течение последующих 20 мин стабилизируют внесением равного объема 0.01 M фосфатного буфера pH 7.2, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, 2 мл предварительно отцентрифугированной нормальной кроличьей сыворотки (12000g, 15 мин) и 2.0 мл 0.5%-ного водного раствора полиэтиленгликоля - 20000. Далее в полученный комплекс добавляют 0.15 M хлористого натрия и 0.1% боргидрида натрия, и дополнительно легко перемешивают 5-10 мин.

Пример 1. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (рвотные массы), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем подложку погружали в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рвотных масс) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (рвотные массы), содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 37 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 2. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (промывные воды кишечника), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (промывные воды кишечника) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке также сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (промывные воды кишечника) содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце (промывные воды кишечника) по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 46 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 3. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: исследуемый образец (рыба холодного копчения), предварительно подготовленная к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рыба холодного копчения) на подложке сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) также сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) пятен нет, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (рыба горячего копчения) содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 34 часа, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 4. Детекцию ботулинических токсинов проводили, как описано выше: исследуемый образец (рыба горячего копчения) предварительно подготовленный к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца подложка осталась белой (пятен нет). В местах нанесения на подложку положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) окрашенные пятна не формируются, подложка остается белой.

Таким образом, в исследуемом образце не обнаружены ботулотоксины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные и контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец не содержит ботулинические токсины.

Указанный способ детекции ботулотоксинов использован при анализе 57 проб клинического материала и пищевых продуктов, поступивших на исследование в лабораторию.

Исследование материала на наличие ботулотоксинов параллельно проводили по способу-прототипу (в РБНТ) и по способу-аналогу (в РПГА). Отмечено полное совпадение результатов, полученных при детекции ботулотоксинов в исследуемых образцах, по способу-прототипу и по предлагаемому способу.

По сравнению со способом-аналогом предлагаемый способ более чувствителен: при использовании предлагаемого способа ботулотоксины были определены в 39 пробах (из 57), что полностью совпало с результатами, полученными по способу-прототипу. По способу-аналогу ботулотоксины были определены только в 23 пробах (из 57).

Однако по сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ обнаружения ботулинических токсинов доступнее, быстрее, проще, не требует использования лабораторных животных, может осуществляться в полевых условиях.