пептиды эпитопа wdrpuh и вакцины, содержащие их

Формула изобретения

1. Изолированный пептид, выбранный из группы, состоящей из (i) и (ii), указанной ниже, где упомянутый пептид обладает способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL):

(i) изолированный пептид из менее чем 15 аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, 2, 1, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61; и

(ii) изолированный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, 2, 1, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, у которой 1 или 2 аминокислоты замещены, и/или добавлены.

2. Изолированный пептид по п.1, который представляет собой нонапептид или декапептид.

3. Пептид по п.1, где пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 1, 3, 4, 16 или 17 представляет собой или изменена на аминокислоту, выбранную из группы фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана; и

(b) С-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 1, 3, 4, 16 или 17 представляет собой или изменена на аминокислоту, выбранную из группы фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.

4. Пептид по п.1, где пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(а) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 30, 31, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 или 61 представляет собой или изменена на аминокислоту, выбранную из группы лейцина и метионина; и

(b) С-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, 30, 31, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 или 61 представляет собой или изменена на аминокислоту, выбранную из группы валина и лейцина.

5. Изолированный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-4.

6. Средство для индукции CTL, где средство содержит один или несколько пептид(ов) по любому из пп.1-4 или один или несколько полинуклеотид(ов) по п.5.

7. Фармацевтическое средство для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований и/или предотвращения их послеоперационного рецидива, где средство содержит в качестве активного компонента один или несколько пептид(ов) по любому из пп.1-4 или один или несколько полинуклеотид(ов) по п.5 в подходящем количестве.

8. Фармацевтическое средство по п.7, приготовленное для введения индивиду, HLA-антиген которого представляет собой HLA-А24 или HLA-A2.

9. Способ индукции антигенпрезентирующей клетки (АРС) индуцирующей способностью CTL, где способ включает стадию, выбранную из

(a) контактирования АРС с пептидом по любому из пп.1-4 in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.1-4, в АРС.

10. Способ индукции CTL, включающий стадию, выбранную из

(a) совместного культивирования CD8-положительной Т-клетки с АРС, которые представляют на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.1-4;

(b) совместного культивирования CD8-положительной Т-клетки с экзосомой, которую представляют на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.1-4; и

(c) введения полинуклеотида, кодирующего субъединичный полипептид Т-клеточного рецептора (TCR), связывающийся с пептидом по любому из пп.1-4, в Т-клетку.

11. Изолированная АРС, которая представляет на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.1-4.

12. АРС по п.11, которая индуцируется способом по п.9.

13. Изолированный CTL, который индуцируется способом по п.10.

14. Способ индукции иммунного ответа против злокачественного новообразования у индивида, включающий стадии введения индивиду средства, содержащего пептид по любому из пп.1-4 или полинуклеотид, кодирующий пептид.

Описание изобретения к патенту

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/200962, поданной 5 декабря 2008 г., и № 61/209704, поданной 9 марта 2009 г., полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, конкретнее к области лечения рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые высоко эффективны в качестве противораковых вакцин, и к лекарственным средствам для лечения и профилактики опухолей.

Предшествующий уровень техники

Было продемонстрировано, что CD8-положительные цитотоксические T лимфоциты (CTL) распознают пептиды эпитопов, происходящие из связанных с опухолями антигенов (TAA), обнаруживаемых на молекулах I класса главного комплекса гистосовместимости (MHC), и затем уничтожают опухолевые клетки. Со времени обнаружения семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA было обнаружено много других TAA, в первую очередь посредством иммунологических подходов (Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время подвергаются клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Идентификация новых TAA, способных вызывать мощные и специфические противоопухолевые иммунные ответы, гарантируют дальнейшую разработку и клиническое применение стратегий пептидных вакцинаций по поводу различных типов злокачественных новообразований (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). К настоящему времени было несколько сообщений о клинических испытаниях использования этих пептидов, происходящих из связанного с опухолью антигена. К сожалению, пока в указанных испытаниях противораковых вакцин наблюдалась лишь низкая объективная частота реакции (Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

В качестве мишени для иммунотерапии подходят TAA, незаменимые для пролиферации и выживания раковых клеток, потому что применение таких TAA может минимизировать достаточно описанный риск иммунного избегания раковых клеток, которое можно отнести на счет делеции, мутации или подавляющей регуляции TAA как последствия терапевтически запускаемого иммунного отбора.

WDRPUH был идентифицирован в качестве нового белка повтора WD, который стимулируется при печеночно-клеточной карциноме, посредством профиля генной экспрессии с использованием микрочипа кДНК шириной генома, содержащего 23040 генов (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, WO 2003/104276). Сообщалось, что белки, содержащие повтор WD, играют ключевые роли в широком диапазоне физиологических функций, включая передачу сигналов, процессинг РНК (Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709.), перестройку цитоскелета (Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36), регуляцию везикулярного трафика (Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75), и клеточное деление (Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30). Анализ с использованием норзерн-блоттинга продемонстрировал, что WDRPUH избыточно экспрессирован на значительно высоком уровне в подавляющем большинстве печеночно-клеточных карцином, не был экспрессирован в нормальных органах, за исключением семенников. Кроме того, было показано, что подавление экспрессии WDRPUH под действием siРНК (малых интерферирующих РНК) значительно ингибировало рост линий клеток печеночно-клеточной карциномы человека (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, WO 2003/104276).

Список ссылок

Патентная литература

WO 2003/104276

Не патентная литература

1. Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

2. Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

3. Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20) 1442-55

4. Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13), 3134-42

5. Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

6. van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

7. Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

8. Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

9. Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

10. Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

11. Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

12. Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

13. Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

14. Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55

15. Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709

16. Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36)

17. Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75

18. Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении подходящих мишеней для иммунотерапии. Ввиду того, что иммунная система в целом воспринимает TAA как «себя», то они поэтому часто не обладают врожденной иммуногенностью, и обнаружение соответствующих мишеней имеет очень большое значение. Как отмечено выше, поскольку была идентифицирована стимуляция WDRPUH (SEQ ID NO: 64, кодируемая геном, депонированным в Генном Банке под номером доступа NM_145054 (SEQ ID NO: 63)) в опухолевой ткани печеночно-клеточной карциномы, то WDRPUH является перспективной мишенью для иммунотерапии.

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на идентификации специфических пептидов эпитопов генных продуктов WDRPUH, которые обладают способностью индуцировать CTL (цитотоксические Т-лимфоциты), специфичные для WDRPUH. Как детально обсуждается ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные у здорового донора, стимулировались с использованием связывающих HLA-A*2402 или HLA-A*0201 перспективных пептидов, полученных из WDRPUH. Затем получали устоявшиеся линии CTL со специфической цитотоксичностью против HLA-A24- или HLA-A2-положительных клеток-мишеней, подвергнутых пульсирующему воздействию каждого из перспективных пептидов. Результаты продемонстрировали, что указанные пептиды представляют собой ограниченные HLA-A24 или HLA-A2 пептиды эпитопов, которые могут вызывать мощные и специфические иммунные реакции против клеток, экспрессирующих WDRPUH, на поверхности. Кроме того, это указало на то, что WDRPUH является сильно иммуногенным, и его эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии опухолей.

Соответственно, целью настоящего изобретения является получение изолированных пептидов, которые связываются с HLA-антигеном, причем пептиды состоят из WDRPUH (SEQ ID NO: 64) или фрагмент WDRPUH. Ожидается, что такие пептиды обладают способностью индуцировать CTL и могут применяться для индукции CTL in ex vivo или для введения индивиду для индукции иммунных реакций против злокачественных новообразований, таких как печеночно-клеточная карцинома. Пептиды могут представлять собой нонапептиды или декапептиды, предпочтительно, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, которые проявляют способность индуцировать CTL.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает модифицированные пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, где одна, две или более аминокислот замещены, вставлены, делетированы или добавлены, пока модифицированные пептиды сохраняют первоначальную способность индуцировать CTL.

Еще одной целью изобретения является получение изолированных полинуклеотидов, кодирующих любой из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды могут применяться для индукции экспрессирующих антиген клеток (APC), имеющие способность индуцировать CTL, или для введения индивиду с целью вызова иммунных реакций против пептидов по настоящему изобретению и, таким образом, в конечном счете, против злокачественных новообразований.

При введении индивиду, пептиды по настоящему изобретению представляются на поверхности APC (антигенпрезентирующих клеток) и затем индуцируют CTL, нацеливающие соответствующие пептиды. Поэтому целью настоящего изобретения является получение агентов, содержащих любые из пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению, для индукции CTL. Эти агенты, содержащие любые из пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению, могут применяться для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, таких как печеночно-клеточная карцинома, и/или предотвращения их послеоперационного рецидива. Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является получение фармацевтических средств для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований и/или предотвращения их послеоперационного рецидива, которые содержат любые из пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению. Агенты или фармацевтические средства по настоящему изобретению могут также содержать в качестве активных ингредиентов APC или экзосомы, которые представляют любые из присутствующих пептидов вместо или в дополнение к пептидам или полинуклеотидам по настоящему изобретению.

Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению способны индуцировать APC, присутствующим на их поверхности комплексом HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. Например, индукция может быть достигнута контактом APC, полученным у индивида, с пептидом по настоящему изобретению или введением полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению в APC. Такие APC имеют высокую способность индуцировать CTL против пептидов-мишеней и могут применяться для иммунотерапии злокачественных новообразований. Поэтому еще одной целью настоящего изобретения является разработка способов индукции APC, обладающих способностью индуцировать CTL, и получение APC указанными способами.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способов индукции CTL, причем способы включают стадию совместного культивирования CD8-положительных клеток с APC или экзосомами, представляющими пептид по настоящему изобретению на их поверхности, или стадию введения полинуклеотида в T-клетку, причем полинуклеотид кодирует полипептид субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), связывающийся с пептидом по настоящему изобретению. CTL, полученные указанными способами, могут применяться для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, таких как печеночно-клеточная карцинома. Поэтому еще одной целью настоящего изобретения является получение CTL любым из способов по настоящему изобретению.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов индукции иммунной реакции против злокачественных новообразований, причем способы включают стадию введения средства, содержащего любой из полипептидов WDRPUH, полинуклеотидов, кодирующих полипептиды WDRPUH, экзосом или APC, представляющих полипептиды WDRPUH по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение может найти применение при любых заболеваниях, связанных с избыточной экспрессией WDRPUH, включая без ограничения злокачественное новообразование, в частности печеночно-клеточную карциному.

Следует понимать, что и предшествующее краткое описание сущности изобретения, и следующее детальное описание относятся к иллюстрируемым вариантам осуществления, а не являются ограничивающими изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и способы применения настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области после рассмотрения краткого описания чертежей и детального описания настоящего изобретения и следующего описания его предпочтительных вариантов осуществления.

Фиг. 1 включает серию фотографий, изображающих результаты ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа) анализа IFN-гамма (интерферона-гамма) на CTL, которые были индуцированы пептидами, происходящими из WDRPUH. CTL в лунках № № 3 и 6, стимулированные WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), № 8 - WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), № № 2 и 6 - WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), № 1, № 2 и № 5 - WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), № 2, № 3, № 4, № 6, № 7 и № 8 -WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e) и № 5, № 6 и № 8 - WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f) проявили активную продукцию IFN-гамма, по сравнению с контролем, соответственно. Клетки в лунках, обозначенные прямоугольной рамкой, размножали для получения установившихся линий CTL. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию соответствующих пептидов, а «-» указывает на то, что клетки не подвергались пульсирующему воздействию никакими пептидами.

Фиг. 2 включает серию линейных графиков, изображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e) и WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f) с ELISA (иммуноферментным) анализом IFN-гамма. Линии CTL, установившиеся стимуляцией каждым из пептидов, проявили активную продукцию IFN-гамма, по сравнению с контролем. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию соответствующих пептидов, а «-» указывает на то, что клетки не подвергались пульсирующему воздействию никакими пептидами.

Фиг. 3 составлена из линейного графика, изображающего специфическую активность CTL против клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют WDRPUH и HLA-A*2402. Клетки COS7, трансфецированные только HLA-A*2402, или только геном WDRPUH полной длины, были получены в качестве контроля. Линия CTL, установившаяся WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2), проявила специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфецированных и WDRPUH, и HLA-A*2402 (черный ромб). Напротив, не была выявлена специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих или HLA-A*2402 (треугольник), или WDRPUH (кружок).

Фиг. 4a-h включает серию фотографий, изображающих результаты ELISPOT-анализа IFN-гамма на CTL, которые были индуцированы пептидами, происходящими из WDRPUH. CTL в лунках № № 2 и 7, стимулированные WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30) (a), № 2 - WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31) (b), № 3 - WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34) (c), № 6 - WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36) (d), № 4 - WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37) (e), № 4 - WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40) (f), № 2 и № 8 - WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41) (g), № 5 - WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45) (h) проявили активную продукцию IFN-гамма соответственно, по сравнению с контролем. Клетки в лунках, обозначенные прямоугольной рамкой, размножали для получения установившихся линий CTL. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию соответствующих пептидов, а «-» указывает на то, что клетки не подвергались пульсирующему воздействию никакими пептидами.

Фиг. 4i-l включает серию фотографий, изображающих результаты ELISPOT-анализа IFN-гамма на CTL, которые были индуцированы пептидами, происходящими из WDRPUH. CTL в лунке № 2, стимулированные WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49) (i), № 6 - WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55) (j), № 7 - WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57) (k) и № 6 - WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61) (l) проявили активную продукцию IFN-гамма соответственно, по сравнению с контролем. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию соответствующих пептидов, а «-» указывает на то, что клетки не подвергались пульсирующему воздействию никакими пептидами.

Фиг. 5a и b состоят из графиков, изображающих продукцию IFN-гамма линий CTL, стимулированных SEQ ID NO: 30 (a) и SEQ ID NO: 34 (b), выявленную ELISA анализом IFN-гамма. Линии CTL, установившиеся стимуляцией каждым пептидом, проявили активную продукцию IFN-гамма, по сравнению с контролем. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию соответствующих пептидов, а «-» указывает на то, что клетки не подвергались пульсирующему воздействию никакими пептидами. Фиг. 5c и 5d изображают продукцию IFN-гамма клонами CTL, установившимися ограничивающим разведением из линий CTL, стимулированных SEQ ID NO: 30 (c) и SEQ ID NO: 34 (d). Результаты, изображенные на данном рисунке, демонстрируют, что клоны CTL, установившиеся стимуляцией SEQ ID NO: 30 (c) и SEQ ID NO: 34 (d), проявили активную продукцию IFN-гамма, по сравнению с контролем. На рисунке «+» указывает, что клетки в лунках подвергались пульсирующему воздействию SEQ ID NO: 30 (c) и SEQ ID NO: 34 (d) и «-» указывает, что клетки не контактировали ни с каким пептидом. Фиг. 5e состоит из линейного графика, изображающего специфическую активность CTL против клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют WDRPUH и HLA-A*0201. Клетки COS7, трансфецированные только HLA-A*0201 или только геном WDRPUH полной длины, получали в качестве контроля. Клон CTL, установившийся с использованием WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34), проявил специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфецированных и WDRPUH, и HLA-A*0201 (черный ромб). Напротив, не была выявлена значимая специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих или HLA-A*0201 (треугольник), или WDRPUH (кружок).

Описание вариантов осуществления

Хотя любые способы и материалы, аналогичные тем, которые описаны в настоящей заявке, могут использоваться при реализации или тестировании настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные способы, устройства и материалы. Однако перед описанием материалов и способов по настоящему изобретению, следует также понимать, что настоящее изобретение не ограничивается определенными величинами, формами, размерами, материалами, методологиями, последовательностями операций и т.д., описанными в настоящей заявке, поскольку они могут варьироваться в соответствии с обычным экспериментированием и оптимизацией. Следует также понимать, что терминология, используемая в описаниях, применяется с целью описания конкретных вариантов или вариантов осуществления, а не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

Описание каждой публикации, патента или патентной заявки, указанных в описании, специально полностью включено в настоящее описание путем ссылки. Однако ничто в настоящем описании не должно рассматриваться как допущение, что изобретение не имеет право на предвосхищение такого описания в силу предшествующего изобретения.

В случае противоречия, регулирующую роль выполняет настоящее описание, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, а не предназначены для ограничения.

I. Определения

Пока нет иных определенных указаний, используемые в настоящем описании существительные с неопределенными и определенными артиклями означают «по меньшей мере, один (одна)».

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимера или аминокислотных остатков. Эти термины относятся к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков представляет собой модифицированный остаток или не встречающийся в естественных условиях остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей естественно встречающейся аминокислоты, а также к полимерам естественно встречающихся аминокислот.

Используемый в настоящем описании термин «аминокислота» относится к естественно встречающимся и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично естественно встречающимся аминокислотам. Естественно встречающиеся аминокислоты представляют собой те, которые кодируются генетическим кодом, и также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза «аминокислотный аналог» относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппой, аминогруппой и группой R) с естественно встречающейся аминокислотой, но имеют модифицированную группу R или модифицированные остовы (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метил-метионин-сульфоний). Фраза «аминокислотный миметик» относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но функции, аналогичные общим аминокислотам.

В настоящем описании аминокислоты могут именоваться их общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендуемыми Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (Международного союза по теоретической и прикладной химии-Международного биохимического союза).

Пока нет специальных указаний, в настоящем описании термины «полинуклеотиды», «гены», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты» используются взаимозаменяемо.

Пока нет других определений, термин «злокачественное новообразование» относится к злокачественным новообразованиям, которые избыточно экспрессируют ген WDRPUH, примеры которых включают без ограничения печеночно-клеточную карциному.

Пока нет других определений, термины «цитотоксический T лимфоцит», «цитотоксическая T-клетка» и «CTL» используются в настоящем описании взаимозаменяемо и, пока нет иных конкретных указаний, относятся к подгруппе T лимфоцитов, которые способны распознавать не аутоклетки (например, опухолевые клетки, клетки, инфицированные вирусом) и индуцировать гибель таких клеток.

Пока нет иных определений, термин «HLA-A2» содержит такие подтипы как HLA-A0201 или HLA-A0206.

Пока нет иных определений, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в данной области, для которого предназначено настоящее изобретение.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, происходящие из WDRPUH, функционируют в качестве антигена, распознаваемого CTL, пептиды, происходящие из WDRPUH (SEQ ID NO: 64), анализировали для определения того, являются ли они эпитопами антигена, ограниченными HLA-A24, которые представляют собой обычно встречающиеся HLA аллели (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Перспективные связывающие HLA-A24 пептиды, происходящие из WDRPUH, были идентифицированы на основании величин их сродства связывания с HLA-A24. Следующие пептиды представляют собой перспективные пептиды:

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16), и

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17).

Перспективные связывающие HLA-A02 пептиды, происходящие из WDRPUH, были идентифицированы на основании величин сродства их связывания с HLA-A02. Следующие пептиды представляют собой перспективные пептиды:

WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57) и

WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61).

Указанные установившиеся CTL проявляют мощную специфическую активность CTL против клеток-мишеней, подвергнутых пульсирующему воздействию соответствующими пептидами. Представленные в настоящем описании результаты демонстрируют, что WDRPUH представляет собой антиген, распознаваемый CTL, и что пептиды могут представлять собой пептиды эпитопов WDRPUH, ограниченных HLA-A24 или HLA-A2.

Поскольку ген WDRPUH избыточно экспрессирован в раковых клетках, таких как печеночно-клеточная карцинома, то он представляет собой хорошую мишень для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из 9 аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из 10 аминокислотных остатков), соответствующим распознаваемым CTL эпитопам WDRPUH. Особенно предпочтительны примеры пептидов по настоящему изобретению включают те пептиды, которые состоят из аминокислотной последовательности, выбранной среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61.

В целом, программные обеспечения, доступные в интернете, такие как программные обеспечения, описанные в публикации Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, могут использоваться для расчета величин сродства связывания между различными пептидами и HLA-антигенами в компьютерном моделировании. Сродство связывания с HLA-антигенами можно измерить, как описано, например, в ссылке на публикацию Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Способ определения сродства связывания описаны, например, в публикациях: Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Поэтому можно выбрать фрагменты WDRPUH, которые имеют высокое сродство связывания с HLA-антигенами, с использованием программных обеспечений. Таким образом, настоящее изобретение включает пептиды, состоящие из любых фрагментов, происходящих из WDRPUH, которые связываются с HLA-антигенами, идентифицированными с использованием таких известных программ. Кроме того, пептид по настоящему изобретению может также состоять из полной длины WDRPUH.

Пептид по настоящему изобретению может фланкироваться с дополнительными аминокислотными остатками, пока полученный в результате пептид сохраняет свою способность индуцировать CTL. Конкретные аминокислотные остатки, фланкирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть составлены из любого вида аминокислот, пока они не нарушают способность индуцировать CTL первоначального пептида. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, обладающим способностью связывания с HLA-антигенами и содержащим аминокислотные последовательности, происходящие из WDRPUH. Такие пептиды обычно имеют длину менее чем примерно 40 аминокислот, часто менее чем примерно 20 аминокислот, обычно меньше чем примерно 15 аминокислот.

В целом, модификация одной, двух или более аминокислот в пептиде не влияет на функцию пептида, а в некоторых случаях даже усиливает желательную функцию исходного белка. Действительно, было известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, составленные из аминокислотной последовательности, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков были модифицированы (т.е. замещены, делетированы, добавлены или вставлены, по сравнению с первоначальной эталонной последовательностью), сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом в одном варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению могут обладать и способностью индуцировать CTL, и аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, где одна, две или даже более аминокислот добавлены, вставлены, делетированы и/или замещены.

Специалистам в данной области понятно, что отдельные замещения в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшую процентную долю аминокислот, имеют тенденцию приводить к сохранению свойств боковой цепи исходной аминокислоты. В сущности, они часто именуются «консервативными замещениями» или «консервативными модификациями», где изменение белка приводит к получению модифицированного белка, выполняющего функцию, аналогичную исходному белку. Таблицы консервативного замещения, обеспечивающего получение функционально аналогичных аминокислот, хорошо известны в данной области. Примеры характеристик боковых цепей аминокислот, сохранение которых желательно, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, имеющие следующие общие функциональные группы или характеристики: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H); и боковая цепь, содержащая ароматическую группу (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые приняты в данной области в качестве консервативных замещений друг на друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Маетионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также считаются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются ими и могут включать не консервативные замещения, пока модифицированный пептид сохраняет способность индуцировать CTL исходного пептида. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать индуцируемые CTL пептиды полиморфных вариантов, межвидовые гомологи и аллели WDRPUH.

Для сохранения требуемой способности индуцировать CTL можно модифицировать (вставить, делетировать, добавить и/или заместить) небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшую процентную долю аминокислот. В настоящем описании термин «несколько» означает 5 или меньше аминокислот, например, 4, 3 или менее. Процентная доля подлежащих модификации аминокислот составляет предпочтительно 20% или менее, предпочтительнее, 15% или менее, еще предпочтительнее, 10% или менее, или от 1 до 5%.

Кроме того, аминокислотные остатки могут быть замещены, вставлены, делетированы и/или добавлены в пептиды для получения модифицированного пептида, имеющего улучшенное сродство связывания. При использовании в контексте иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению должны быть представлены на поверхности клетки или экзосоме, предпочтительно, в виде комплекса с HLA-антигеном. В дополнение к пептидам, которые естественно представлены, поскольку закономерность последовательностей пептидов, проявляемая связыванием с HLA-антигенами уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), модификации, основанные на такой закономерности, могут быть введены в иммуногенные пептиды по изобретению. Например, может быть желательно замещение второй аминокислоты от N-конца, замещенной фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или аминокислоты на C-конце фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином для увеличения связывания HLA-A24. Таким образом пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16 и 17, где вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности указанных SEQ ID NO замещена фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или пептиды, где C-конец аминокислотной последовательности указанных SEQ ID NO замещен фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, включены в настоящее изобретение. С другой стороны, пептиды, обладающие высоким сродством связывания HLA-A2, имеют замещение своей второй аминокислоты от N-конца лейцином или метионином, а аминокислота на C-конце замещена валином или лейцином. Таким образом, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, где вторая аминокислота от N-конца замещена лейцином или метионином, и/или где C-конец замещен валином или лейцином, охватываются настоящим изобретением. Замещения могут быть введены не только в концевые аминокислоты, но также в положение потенциального распознавания пептидов в T-клеточном рецепторе (TCR). Несколько исследований продемонстрировали, что пептид с аминокислотными замещениями может быть таким же или лучше, чем исходный, например, CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu _(369-377) или gp100 _(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

Настоящее изобретение также предусматривает добавление одной, двух или нескольких аминокислот к N- и/или C-концу описанных пептидов. Такие модифицированные пептиды, имеющие высокое сродство связывания HLA-антигена, и сохраняющие способность индукции CTL, также включены в настоящее изобретение.

Однако когда пептидная последовательность идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего другую функцию, могут быть вызваны побочные эффекты, такие как аутоиммунные расстройства и/или аллергические симптомы против определенных веществ. Поэтому, предпочтительно сначала выполнение поисков гомологии с использованием доступных бах данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда в результате поисков гомологии становится ясным, что существует даже не пептид с 1 или 2 аминокислотными различиями, по сравнению с целевым пептидом, то целевой пептид может быть модифицирован для увеличения сродства связывания с HLA-антигенами, и/или увеличения способности индуцировать CTL без любой опасности таких побочных эффектов.

Хотя ожидается, что пептиды, имеющие высокое сродство связывания с HLA-антигенами, как описано выше, являются высокоэффективными, то перспективные пептиды, которые выбраны в соответствии с наличием высокого сродства связывания в качестве индикатора, далее исследуются для выявления наличия способности индуцировать CTL. В настоящем описании фраза «способность индуцировать CTL» указывает на способность пептида индуцировать CTL при представлении на антигенпрезентирующих клетках (APCs). Кроме того, «индуцируемость CTL» включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис клеток-мишеней под действием CTL и увеличивать с помощью CTL продукции IFN-гамма.

Подтверждение способности индуцировать CTL осуществляется индукцией APC, несущих антигены MHC (главного комплекса гистосовместимости) человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или конкретнее, DC, происходящие из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, и после стимуляции пептидами, смешиванием с CD8-положительными клетками, и затем измерением количества IFN-гамма, продуцируемого и высвобождаемого CTL, против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут использоваться трансгенные животные, которые были получены для экспрессии человеческого HLA-антигена (например, трансгенные животные, описанные в публикациях BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть мечены радиоактивным изотопом ⁵¹Cr и тому подобными, и цитотоксическая активность может быть рассчитана по радиоактивности, высвобождаемой из клеток-мишеней. Альтернативно, способность индуцировать CTL можно оценить измерением количества IFN-гамма, продуцируемого и высвобождаемого CTL, в присутствии APC, которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализацией зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против IFN-гамма.

В результате исследования способности индуцировать CTL описанными выше пептидами, было обнаружено, что нонапептиды или декапептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, проявляют особенно высокую способность индуцировать CTL, а также высокое сродство связывания с HLA-антигеном. Таким образом, указанные пептиды иллюстрируются в качестве предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, анализ гомологии показал, что указанные пептиды не имеют значимой гомологии с пептидами, происходящими из любых других известных человеческих генных продуктов. Это значит, что возможность неизвестных или нежелательных иммунных реакций, возникающих вследствие использования пептидов по настоящему изобретению при иммунотерапии, является низкой. Поэтому, также вследствие данного аспекта, эти пептиды предпочтительны для вызова иммунитета у пациентов со злокачественными новообразованиями против WDRPUH. Таким образом, особенно предпочтительные пептиды по настоящему изобретению включают те, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61.

В дополнение к описанным выше модификациям, пептиды по настоящему изобретению могут быть также связаны с другими пептидами, пока полученный пептид сохраняет требуемую способность индуцировать CTL искодного пептида. Примеры подходящих пептидов включают без ограничения: пептиды по настоящему изобретению или индуцируемые CTL пептиды, происходящие из других TAA (опухолеассоциированных антигенов). Линкеры, подлежащие помещению между пептидами, хорошо известны в данной области и включают без ограничения, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) и K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).

Кроме того, пептиды по настоящему изобретению могут быть также связаны с другими веществами, пока полученный в результате пептид сохраняет требуемую способность индуцировать CTL исходного пептида. Примеры подходящих веществ включают без ограничения: пептиды, липиды, сахар и сахарные цепи, ацетильные группы, натуральные и синтетические полимеры, и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологической активности исходного пептида. Указанные виды модификаций могут выполняться для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации полипептида. Например, в данной области известно, что для увеличения устойчивости полипептида in vivo, вводятся D-аминокислоты, аминокислотные миметики или ненатуральные аминокислоты; данная концепция может быть также адаптирована к полипептидам по настоящему изобретению. Устойчивость полипептида можно анализировать рядом путей. Например, для тестирования устойчивости могут использоваться пептидазы и различные биологические среды, такие как человеческая плазма и сыворотка (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Как отмечено выше, можно провести скрининг или отбор пептидов, которые модифицированы замещением, вставкой, делецией и/или добавлением одного, двух или нескольких аминокислотных остатков, но все же имеют такую же или более высокую активность, по сравнению с исходным пептидом. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу скрининга или отбора модифицированного пептида, имеющего такую же или более высокую активность, по сравнению с исходным пептидом. Например, такой способ может состоять из следующих стадий:

a: модификация, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в пептиде по настоящему изобретению замещением, делецией, вставкой и/или добавлением;

b: определение активности модифицированного пептида; и

c: выбор пептида, который по определению имеет такую же или более высокую активность, по сравнению с исходным пептидом.

В настоящем описании активность, подлежащая определению на стадии b, может представлять собой активность связывания MHC, способность индуцировать APC или CTL и/или цитотоксическую активность.

В настоящем описании пептиды по настоящему изобретению могут быть также описаны как «пептид(ы) WDRPUH» или «полипептид(ы) WDRPUH».

III. Получение пептидов WDRPUH

Пептиды по изобретению могут быть получены с использованием хорошо известных методик. Например, пептиды могут быть получены синтетически с использованием технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза. Пептиды по изобретению могут быть синтезированы отдельно или в виде более длинных полипептидов, составленных из двух или более пептидов. Затем пептиды могут быть выделены, т.е. очищены или изолированы с тем, чтобы быть, по существу, свободными от других естественно встречающихся белков клеток-хозяев и их фрагментов или от любых других химических веществ.

Пептид по настоящему изобретению может быть получен посредством химического синтеза на основании выбранной аминокислотной последовательности. Примеры обычных способов пептидного синтеза, которые могут быть адаптированы для синтеза, включают без ограничения:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению могут быть получены, адаптируя любые способы генной инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой пептид в экспрессируемой форме (например, ниже по ходу транскрипции регуляторной последовательности, соответствующей промотерной последовательности) и трансформируют в подходящую клетку-хозяин. Затем клетка-хозяин культивируется для получения представляющего интерес пептида. Пептид может быть также получен in vitro путем адаптации системы трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который кодирует любой из указанных выше пептидов по настоящему изобретению. Они включают полинуклеотиды, происходящие из естественно встречающегося гена WDRPUH (номер доступа в Генном Банке NM_145697 (SEQ ID NO: 34)), а также полинуклеотиды, имеющие их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. В настоящем описании, фраза «консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность» относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или, по существу, идентичные аминокислотные последовательности. Ввиду вырожденности генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется кодоном, кодон может быть изменен в любой из соответствующих описанных кодонов, без изменения кодированного полипептида. Такие изменения нуклеиновых кислот представляют собой «молчащие изменения», которые представляют собой один вид консервативно модифицированных изменений. В настоящем описании каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, также описывает любое возможное молчащее изменение нуклеиновой кислоты. Среднему специалисту в данной области понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и TGG, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждое молчащее изменение нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, безоговорочно описано в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть составлен из ДНК, РНК и их производных. ДНК может быть составлена из оснований, таких как A, T, C и G, и T замещено U в РНК.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множественные пептиды по настоящему изобретению с находящимися между ними аминокислотными последовательностями. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечить сайт расщепления (например, распознаваемую ферментом последовательность) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать любые дополнительные последовательности к кодирующей последовательности, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который включает регуляторные последовательности, требуемые для экспрессии пептида, или может представлять собой вектор экспрессии (плазмиду) с маркерными генами и тому подобными. В целом, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть получены манипуляцией полинуклеотидами посредством обычных рекомбинантных методик с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.

И рекомбинантные методики, и методики химического синтеза могут использоваться для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть получен вставкой в соответствующий вектор, который может быть экспрессирован при трансфекции в компетентную клетку. Альтернативно, полинуклеотид может быть амплифицирован с использованием методик PCR (полимеразной цепной реакции) или экспрессией у подходящих хозяев (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид может быть синтезирован с использованием твердофазных методик, как описано в публикациях Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение, кроме того, относится к внутриклеточным пузырькам, называемым экзосомами, которые представляют комплексы, образованные между пептидами по настоящему изобретению и HLA-антигенами на их поверхности. Экзосомы могут быть получены, например, использованием способов, детально описанным в заявках на патенты Японии № № Hei 11-510507 и WO99/03499, и могут быть получены с использованием APC, полученных от пациентов, которые подлежат лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению могут инокулироваться в виде вакцин, путем, аналогичным пептидам по настоящему изобретению.

Тип HLA-антигенов, содержащихся в комплексах, должен соответствовать такому индивиду, требующему лечения и/или профилактики. Например, у населения Японии преобладают HLA-A24 и HLA-A2, в частности HLA-A2402 и HLA-A0201 или HLA-A0206 и поэтому они были бы целесообразными для лечения японских пациентов. Применение типа A24 или типа A2, которые имеют высокую экспрессию среди японцев и европеоидов, благоприятно для получения эффективных результатов, и такие подтипы как A2402, A0201 или A0206 также находят применение. Обычно, в клинике тип HLA-антигена по настоящему изобретению исследуется заранее, что обеспечивает возможность соответствующего выбора пептидов, имеющих высокие уровни сродства связывания с определенным антигеном или обладающих способностью индуцировать CTL представлением антигена. Кроме того, для получения пептидов, имеющих и высокое сродство связывания, и способность индуцировать CTL, замещение, вставку, делецию и/или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот можно выполнять на основании аминокислотной последовательности естественно встречающегося частичного пептида WDRPUH.

При использовании HLA-антигена типа A24 для экзосомы по настоящему изобретению находят применение пептиды, имеющие последовательности, выбранные среди SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16 и 17. Альтернативно, при использовании HLA-антигена типа A2 для экзосомы по настоящему изобретению находят применение пептиды, имеющие последовательности любой из SEQ ID NO: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61.

VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Настоящее изобретение также относится к изолированным APC, которые представляют комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению на их поверхности. APC могут быть получены у пациентов, которые подлежат лечению и/или профилактике, и могут вводиться в виде вакцин отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептиды по настоящему изобретению, или CTL.

APC не ограничиваются конкретным видом клеток и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, представляют белковые антигены на их клеточной поверхности с тем, чтобы распознаваться лимфоцитами. Поскольку DC является репрезентативной APC, оказывающей самое сильное действие, индуцирующее CTL, среди APC, DC, находят применение в качестве APC по настоящему изобретению.

Например, APC по настоящему изобретению может быть получена индукцией DC из моноцитов периферической крови и затем обеспечением контакта (стимуляцией) их с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Фраза «индукция APC» включает обеспечение контакта (стимуляцию) клетки с пептидами по настоящему изобретению, или нуклеотидами, кодирующими пептиды по настоящему изобретению для представления комплексов, образованных между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению на поверхности клетки. Когда пептиды по настоящему изобретению вводятся индивиду, APC, которые представляют пептиды по настоящему изобретению, индуцируются в организме индивида. Поэтому APC по настоящему изобретению могут быть получены взятием APC у индивида после введения пептида по настоящему изобретению индивиду. Альтернативно, APC по настоящему изобретению могут быть получены обеспечением контакта APC, взятых у индивида, с пептидом по настоящему изобретению.

APC по настоящему изобретению могут вводиться индивиду для индукции иммунной реакции против злокачественного новообразования у индивида отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать стадии:

a: взятия APC у первого индивида;

b: обеспечения контакта APC стадии a с пептидом; и

c: введения нагруженных пептидом APC стадии b второму индивиду.

Первый индивид и второй индивид могут представлять собой одного и того же индивида или они могут быть разными индивидами. APC, полученные на стадии b, могут вводиться в виде вакцины для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования, включая печеночно-клеточную карциному. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу получения фармацевтической композиции, индуцирующей антигенпрезентирующие клетки, где способ содержит стадии смешивания или включения в состав пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, APC имеют высокий уровень способности индуцировать CTL. В термине «высокий уровень способности индуцировать CTL» высокий уровень имеется в виду, относительно уровня такой способности, достигаемого APC, контактирующими без пептида или с пептидами, которые не могут индуцировать CTL. Такие APC, имеющие высокий уровень способности индуцировать CTL, могут быть получены способом, который включает стадию переноса генов, содержащих полинуклеотиды по настоящему изобретению, в APC in vitro, а также способом, указанным выше. Введенные гены могут быть представлены в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения включают без конкретных ограничений различные способы, обычно выполняемые в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с использованием фосфата кальция. Конкретнее, оно может выполняться, как описано в публикациях Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Опубликованный перевод на японский язык международной патентной публикации No. 2000-509281. Путем переноса гена в APC, ген подвергается транскрипции, трансляции и тому подобным преобразованиям в клетке, и затем полученный белок перерабатывается и представляется MHC Класса I или Класса II по пути представления.

VII. Цитотоксические T лимфоциты (CTL)

CTL, индуцированные против любых из пептидов по настоящему изобретению, усиливают нацеливание иммунного ответа на раковые клетки in vivo и таким образом они могут использоваться в качестве вакцин аналогично самим пептидам. Таким образом, настоящее изобретение также относится к изолированным CTL, которые специфически индуцированы или активированы любым из пептидов по настоящему изобретению.

Такие CTL могут быть получены (1) введением пептидов по настоящему изобретению индивиду, взятием CTL у индивида; (2) обеспечением контакта (стимуляцией) полученных у индивида APC и CD8-положительных клеток, или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с пептидами по настоящему изобретению и затем изоляцией CTL; (3) обеспечением контакта CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с APC или экзосомами, представляющими комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению на их поверхности и затем изоляцией CTL; или (4) введением T-клетки, гена, кодирующего субъединичный полипептид T-клеточного рецептора (TCR), который связывается с пептидом по настоящему изобретению. APC или экзосомы могут быть получены способами, описанными выше, и способ по пункту (4) детально описан ниже в разделе «VIII. T-клеточный рецептор (TCR)».

CTL по настоящему изобретению, которые были индуцированы стимуляцией APC, представляющими пептид по настоящему изобретению, могут быть получены у пациентов, которые подлежат лечению и/или профилактике, и могут вводиться отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, включая пептиды по настоящему изобретению или экзосомы, с целью регуляторных воздействий. Полученные CTL действуют специфически против клеток-мишеней, представляющих пептиды по настоящему изобретению, например такие же пептиды, которые используются для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экспрессируют WDRPUH, например, клетки печеночно-клеточной карциномы, или клетки, которые трансфецированы геном WDRPUH; и клетки, которые представляют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности вследствие стимуляции пептидом, могут также служить в качестве мишеней атаки активированных CTL.

VIII. T-клеточный рецептор (TCR)

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые способны образовывать субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), и к способам ее применения. Субъединицы TCR способны образовывать TCR, которые придают специфичность T-клеткам против опухолевых клеток, представляющих специфический пептид по настоящему изобретению. Путем использования способов, известных в данной области, могут быть идентифицированы нуклеиновые кислоты альфа- и бета-цепей в качестве субъединиц CTL, индуцированных одним или более пептидами по настоящему изобретению (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Например, способ PCR предпочтителен для анализа TCR. Праймеры PCR для анализа могут представлять собой, например,

праймеры 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') в качестве праймеров стороны 5' (SEQ ID NO: 65) и

праймеры 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'), специфичные для области C альфа цепи TCR (SEQ ID NO: 66),

праймеры 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'), специфичные для области C1 бета цепи TCR (SEQ ID NO: 67) или

праймеры 3-TRbeta-C2 (5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3'), специфичные для области C2 бета цепи TCR (SEQ ID NO: 68) в качестве праймеров стороны 3',

но не ограничиваются ими. Дериватизированные TCR могут с высокой авидностью связывать клетки-мишени, проявляющие пептид WDRPUH, и, возможно, опосредовать эффективный цитолиз клеток-мишеней, представляющих пептид WDRPUH in vivo и in vitro.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть включены в подходящие векторы, например ретровирусные векторы. Данные векторы хорошо известны в данной области. Нуклеиновые кислоты или векторы, содержащие их, могут с пользой переноситься в T-клетку, например, T-клетку от пациента. Преимущественно, изобретение относится к отпускаемой без рецепта композиции, обеспечивающей возможность быстрой модификации собственных T-клеток пациента (или T-клеток другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения модифицированных T-клеток, имеющих превосходные свойства лизиса раковых клеток.

Специфический TCR представляет собой рецептор, способный специфически распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулой HLA, придавая T-клетке специфическую активность против клетки-мишени, когда TCR находится на поверхности T-клетки. Специфическое распознавание указанного выше комплекса может быть подтверждено любыми известными способами, и предпочтительные способы включают, например, тетрамерный анализ с использованием молекулы HLA и пептида по изобретению и ELISPOT анализа. Путем выполнения ELISPOT анализа, можно подтвердить, что T-клетки, экспрессирующие TCR на клеточной поверхности, распознают клетку по TCR, и что сигнал передается внутриклеточно. Подтверждение того, что указанный выше комплекс может придать T-клетке цитотоксическую активность, когда комплекс существует на поверхности T клетки, может также проводиться известным способом. Предпочтительный способ включает, например, определение цитотоксической активности против HLA-положительной клетки-мишени, такой как анализ высвобождения хрома. Также, настоящее изобретение относится к CTL, которые получаются трансдукцией нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды субъединиц TCR, которые связываются с пептидом WDRPUH, например SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16 и 17, в контексте HLA-A2, а также пептидами SEQ ID NO: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61 в контексте HLA-A24. Трансдуцированные CTL способны осуществлять хоминг к раковым клеткам in vivo и могут размножаться хорошо известными способами культивирования in vitro (e.g., Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL, по изобретению, могут использоваться для образования иммуногенной композиции, используемой при лечении или профилактике злокачественных новообразований у пациента, нуждающегося в их лечении или защите от их развития (WO2006/031221).

Предотвращение и профилактика включают любую активность, которая уменьшает груз смертности или заболеваемости патологическими состояниями. Предотвращение и профилактика могут происходить «на первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения». Хотя первичное предотвращение и профилактика избегают развития заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения и профилактики охватывают виды деятельности, нацеленные на предотвращение и профилактику прогрессирования заболевания, и возникновение симптомов, а также снижения отрицательного воздействия уже установившегося заболевания путем восстановления функции и уменьшения связанных с заболеванием осложнений. Альтернативно, предотвращение и профилактика включают широкий диапазон профилактических видов лечения, направленных на облегчение тяжести конкретного расстройства, например снижение пролиферации и метастазирования опухолей, уменьшение ангиогенеза.

Лечение и/или профилактика злокачественных заболеваний и/или предотвращение послеоперационного их рецидива включает любую из следующих стадий, таких как хирургическое удаление раковых клеток, ингибирование роста канкрозных клеток, обратное развитие или регрессия опухоли, индукция ремиссии и подавление возникновения злокачественного заболевания, регрессия опухоли и уменьшение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика снижает смертность от злокачественных заболеваний и улучшает прогноз у индивидов, страдающих злокачественными новообразованиями, снижает уровни опухолевых маркеров в крови и облегчает выявляемые симптомы, сопровождающие злокачественные заболевания. Например, уменьшение или облегчение симптомов составляет эффективное лечение и/или профилактику, и такое уменьшение или облегчение симптомов включает снижение на 10%, 20%, 30% или более, или поддержание стабильного состояния больного пациента.

IX. Фармацевтические средства или композиции

Поскольку экспрессия WDRPUH специфически повышена (стимулирована) при печеночно-клеточной карциноме, по сравнению с нормальной тканью (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55), пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению могут применяться для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования или опухоли, и/или предотвращения их послеоперационного рецидива. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическому средству или композиции для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования или опухоли, и/или предотвращения их послеоперационного рецидива, которая включает один или более пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы на поверхности любой из указанных выше экзосом или клеток, таких как APC, для применения в качестве фармацевтических средств или композиций. Кроме того, указанные выше CTL, которые нацеливают любые пептиды по изобретению, могут также применяться в качестве активного ингредиента фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение также относится к применению активного ингредиента, выбранного из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящей заявке, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению, на ее поверхности; и

(d) CTL по настоящему изобретению

при получении фармацевтической композиции или средства для лечения или предотвращения злокачественного новообразования или опухоли.

Альтернативно, настоящее изобретение, кроме того, относится к активному ингредиенту, выбранному из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящей заявке, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению, на ее поверхности; и

(d) CTL по настоящему изобретению

для применения при лечении или предотвращении злокачественного новообразования или опухоли.

Альтернативно, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения фармацевтической композиции или средства для лечения или предотвращения злокачественного новообразования или опухоли, где способ или процесс включает стадию составления фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящей заявке, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению, на ее поверхности; и

(d) CTL по настоящему изобретению

в качестве активных ингредиентов.

В другом варианте осуществления, альтернативно, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения фармацевтической композиции или средства для лечения или предотвращения злокачественного новообразования или опухоли, где способ или процесс включает стадию смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:

(a) пептида по настоящему изобретению;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описано в настоящей заявке, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, представляющей пептид по настоящему изобретению, на ее поверхности; и

(d) CTL по настоящему изобретению.

Альтернативно, фармацевтическая композиция или средство по настоящему изобретению может применяться или для каждой или для обеих из профилактики злокачественного новообразования или опухоли и предотвращения их послеоперационного рецидива.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению находят применение в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения, фраза «вакцина» (также именуемая иммуногенной композицией) относится к веществу, которое имеет функцию индукции противоопухолевого иммунитета после инокуляции животным.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут применяться для лечения и/или предотвращения злокачественных новообразований или опухолей, и/или предотвращения их послеоперационного рецидива у индивидов или пациентов, включая людей и любого другого млекопитающего, включая без ограничения мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, корову, лошадь, обезьяну, бабуина и шимпанзе, в частности у коммерчески значимого животного или одомашненного животного.

В соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61 представляют собой соответственно пептиды эпитопов или кандидаты на их роль, ограниченные HLA-A24 или HLA-A2, которые могут вызвать мощный и специфический иммунный ответ. Поэтому фармацевтические средства по настоящему изобретению, которые включают любые из указанных пептидов, имеющих аминокислотные последовательности из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 и 61, особенно подходят для введения индивидам, чей HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2. В частности, средства, содержащие пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 16 и 17, подходят для введения индивидам типа HLA-A24, а те, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 and 61, подходят для введения индивидам типа HLA-A2. То же относится к фармацевтическим средствам и композициям, которые включают полинуклеотиды, кодирующие любой из указанных пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению).

Злокачественные новообразования или опухоли, подлежащие лечению фармацевтическими средствами или композициями по настоящему изобретению, не ограничиваются и включают все виды злокачественных новообразований или опухолей, при которых задействован WDRPUH, например, печеночно-клеточную карциному.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут содержать, в дополнение к указанным выше активным ингредиентам, другие пептиды, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые представляют другие пептиды, или им подобные. В настоящем описании другие пептиды, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, иллюстрируются специфическими для злокачественных новообразований антигенами (например, идентифицированными TAAs), но не ограничиваются ими.

При необходимости, возможно включение в фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению других терапевтических веществ в качестве активного ингредиента, пока вещество не ингибирует противоопухолевой эффект активного ингредиента, например любого из пептидов по настоящему изобретению. Например, препаративные формы могут включать противовоспалительные средства, анальгетики, химиотерапевтические средства и тому подобные. В дополнение к включению других терапевтических веществ в самое лекарственное средство, лекарственные средства по настоящему изобретению могут также вводиться последовательно или одновременно с одним или более других фармакологических средств. Количества лекарственного средства и фармакологического агента зависят, например, от того, какой тип фармакологического агента (агентов) применяется, подлежащего лечению заболевания и схемы и путей введения.

Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, конкретно указанным в настоящем описании, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать другие средства, обычно используемые в данной области, имеющие отношение к типу рассматриваемой препаративной формы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут быть включены в изделия и наборы, содержащие материалы, используемые для лечения патологических состояний подлежащего лечению заболевания, например злокачественного новообразования. Изделие может включать контейнер, содержащий любое из фармацевтических средств по настоящему изобретению с этикеткой. Подходящие контейнеры включают флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать, какое средство или композиция применяется для лечения или предотвращения одного или более патологических состояний. Этикетка должна также указывать инструкции по введению и т.д.

В дополнение к описанному выше контейнеру, в набор, включающий фармацевтическое средство или композицию по настоящему изобретению, возможно, кроме того, включение второго контейнера, содержащего фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может, кроме того, включать другие материалы, желательные с точки зрения производителя и пользователя, включая другие буферы, разбавители, наполнители, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями по применению.

При желании, фармацевтические средства или композиции могут присутствовать в упаковке или раздаточном устройстве, которое может содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или раздаточное устройство могут сопровождаться инструкциями по введению.

(1) Фармацевтические средства или композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента

Пептиды по настоящему изобретению могут вводиться непосредственно в виде фармацевтического средства или композиции или, при необходимости, которая была составлена обычными способами составления препаративных форм. В последнем случае, в дополнение к пептидам по настоящему изобретению, носители, эксципиенты и ингредиенты, которые обычно используются для лекарственных средств, могут быть при целесообразности включены без конкретных ограничений. Примерами таких носителей являются стерилизованная вода, физиологический солевой раствор, фосфатный буфер, культуральная жидкость и тому подобное. Кроме того, фармацевтические средства или композиции могут при необходимости содержать стабилизаторы, суспензии, консерванты, ПАВ и тому подобные. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут применяться в целях лечения и профилактики злокачественных новообразований.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде комбинации, составленной из двух или более пептидов по настоящему изобретению, для включения CTL in vivo. Комбинация пептидов может принимать форму смеси или может конъюгироваться друг с другом с использованием стандартных методик. Например, пептиды могут быть химически связаны или экспрессированы в виде одной последовательности слитых полипептидов. Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или различными. Путем введения пептидов по настоящему изобретению, пептиды представляются в высокой плотности HLA-антигенами на APC, затем индуцируются CTL, которые специфически реагируют в отношении комплекса, образованного между проявляемым пептидом и HLA-антигеном. Альтернативно, APC, которые представляют любой из пептидов по настоящему изобретению на их клеточной поверхности, которые могут быть получены стимуляцией APC (например, DC), полученные у индивида пептидами по настоящему изобретению, могут вводиться индивиду, и в результате у индивида индуцируются CTL и может быть увеличена агрессивность в отношении злокачественных клеток.

Фармацевтические средства или композиция для лечения и/или предотвращения злокачественного образования или опухоли, которые включают пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, могут также включать адъювант, который, как известно, эффективно устанавливает клеточный иммунитет. Альтернативно, фармацевтические средства или композиции могут вводиться с другими активными ингредиентами или вводиться включением в гранулы. Адъювант относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ против протеина при введении вместе (или последовательно) с протеином, имеющим иммунологическую активность. Адъюванты, предусмотренные настоящим изобретением, включают те, которые описаны в литературе (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Примеры подходящих адъювантов включают фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, сальмонеллезный токсин и тому подобные, но не ограничиваются ими.

Кроме того, возможно удобное применение липосомных препаративных форм, гранулярных препаративных форм, в которых пептид связан гранулами диаметром несколько микрометров, и препаративные формы, в которых липид связан с пептидом.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут, кроме того, включать компонент, который примирует CTL. Липиды были идентифицированы в качестве агентов, способных примировать CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут быть присоединены к эпсилон- и альфа-аминогруппам лизинового остатка и затем связываться с пептидом по настоящему изобретению. Затем липидированный пептид может вводиться или непосредственно в мицелле или частице, включенной в липосому, или эмульгированной в адъюванте. В качестве другого примера примирования липидами реакций CTL, липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинил-серил-серин (P3CSS), могут использоваться для примирования CTL при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (см., например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Способ введения может представлять собой пероралное введение, интрадермальную, подкожную, внутривенную инъекцию, или тому подобную, и системное введение или местное введение поблизости к участкам-мишеням. Введение может выполняться однократным введением или для усиления эффекта - множественными введениями. Доза пептидов по настоящему изобретению может целесообразно подбираться в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой тела, способом введения и тому подобными факторами и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,1 мг до 10 мг, и могут вводиться от одного раза в несколько дней до нескольких месяцев.

(2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, описанные в настоящей заявке, в экспрессируемой форме. В настоящем описании фраза «в экспрессируемой форме» означает, что полинуклеотид при введении в клетку экспрессируется in vivo как полинуклеотид, который индуцирует противоопухолевой иммунитет. В иллюстрируемом варианте осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты представляющего интерес полинуклеотида включает регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) могут быть сконструированы так, чтобы достичь устойчивой вставки ТВ геном клетки-мишени (см., например, публикацию Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12, где описаны кассетные векторы гомологичной рекомбинации). См., например, публикацию Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенты США № № . 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и документ WO 98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают «голую ДНК», облеченную (опосредованную бупивакаином, полимерами, пептидами) доставку, катионные липидные комплексы и доставку, опосредованную частицами («генное ружье») или давлением (см., например, патент США № 5922687).

Пептиды по изобретению могут быть также экспрессированы вирусными или бактериальными векторами. Примеры векторов экспрессии включают ослабленные вирусные хозяева, такие как вирус коровьей оспы или птичьей оспы. Данный подход включает применение вируса коровьей оспы, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид. После введения в хозяина рекомбинантный вирус коровьей оспы экспрессирует иммуногенный пептид и, посредством этого, вызывает иммунный ответ. Векторы в виде вируса коровьей оспы и способы, используемые в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другой вектор представляет собой БЦЖ (бацилла Кальметта-Гирена). Векторы в виде БЦЖ описаны в публикации Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Очевидно широкое разнообразие других векторов, используемых для терапевтического введения или иммунизации, например векторы, представляющие собой адено- или аденоассоциированные вирусы, ретровирусные векторы, векторы в виде Salmonella typhi, векторы в виде детоксифицированного токсина сибирской язвы и тому подобные. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка полинуклеотида в организм индивида может быть или непосредственной, и в этом случае индивид подвергается непосредственному воздействию несущего полинуклеотид вектора, или непрямого, при котором клетки сначала трансформируются представляющим интерес полинуклеотидом in vitro, а затем клетки трансплантируются в организм индивида. Указанные два подхода известны как виды генной терапии соответственно in vivo и ex vivo.

Общие обзоры способов генной терапии представлены в публикациях Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантной ДНК, которые также могут использоваться для настоящего изобретения, описаны в публикациях eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Способ введения может представлять собой пероральное введение, интрадермальную, подкожную, внутривенную инъекцию или тому подобную, и системное введение или местное введение поблизости к участкам-мишеням. Введение может выполняться однократным введением или множественными введениями для подкрепления эффекта. Доза полипептида в подходящем носителе может целесообразно подбираться в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой тела, способом введения и тому подобными факторами и обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,001 мг до 1000 мг, например от 0,1 мг до 10 мг, и могут вводиться от одного раза в несколько дней до нескольких месяцев. Специалист в данной области может соответствующим образом выбрать подходящую дозу.

X. Способы с использованием пептидов, экзосом, APC и CTL

Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться для индукции APC и CTL. Экзосомы и APC по настоящему изобретению могут также использоваться для индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC могут использоваться в комбинации с любыми другими соединениями, пока соединения не ингибируют их способность индуцировать CTL. Таким образом, любое из указанных выше фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению может использоваться для индукции CTL, и, в дополнение к ним, фармацевтические средства или композиции, включающие пептиды и полинуклеотиды, могут также использоваться для индукции APC, как обсуждается ниже.

(1) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток (APC)

Настоящее изобретение относится к способам индукции APC с высокой способностью индуцировать CTL с использованием пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают стадию обеспечения контакта APC с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ обеспечения контакта APC с пептидами ex vivo может включать стадии:

a: взятия APC у индивида; и

b: обеспечения контакта APC со стадии a с пептидом.

APC не ограничиваются конкретным видом клеток и включают DC, клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, представляют белковые антигены на своих клеточных поверхностях с тем, чтобы распознаваться лимфоцитами. Предпочтительно, могут использоваться DC, поскольку они обладают самой сильной способностью индуцировать CTL среди APC. Любые пептиды по настоящему изобретению могут использоваться отдельно или с другими пептидами по настоящему изобретению.

Альтернативно, APC могут быть индуцированы введением индивиду пептида по настоящему изобретению для контакта пептида с APC in vivo и в последующем индукции APC с высокой способностью индуцировать CTL в организме индивида. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает введение пептидов по настоящему изобретению индивиду для индукции APC. В качестве другого способа, полинуклеотид по настоящему изобретению может вводиться индивиду в экспрессируемой форме для экспрессии пептида по настоящему изобретению и контакта пептида с APC in vivo. Аналогично введению пептида по настоящему изобретению, APC с высокой способностью индуцировать CTL, индуцируются в организме индивида. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает введение полинуклеотидов по настоящему изобретению индивиду для индукции APC. Объяснение фразы «форма экспрессии» можно найти в разделе «IX. Фармацевтические средства (2) Фармацевтические средства, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента».

Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает введение полипептида по настоящему изобретению в APC для индукции APC со способностью индуцировать CTL. Например, способ может включать стадии:

a: взятия APC у индивида; и

b: введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, во взятую APC.

Стадия b может выполняться, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки».

(2) Способ индукции CTL

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индукции CTL с использованием пептидов, полинуклеотидов или экзосом или APC по настоящему изобретению.

После введения пептидов, полинуклеотидов, APC или экзосом по настоящему изобретению индивиду, CTL индуцируются в организме индивида для усиления иммунного ответа, нацеленного на раковые клетки. Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа индукции CTL, причем способ может включать стадию введения пептидов, полинуклеотидов, APC или экзосом по настоящему изобретению индивиду.

Альтернативно, CTL могут быть также индуцированы ex vivo, и после индукции, активированные CTL могут быть возвращены индивиду. Например, способ может включать стадии:

a: взятия APC у индивида;

b: обеспечения контакта APC со стадии a с пептидом по настоящему изобретению; и

c: совместного культивирования APC со стадии b с CD8-положительными клетками.

APC, подлежащие кокультивированию с CD8-положительными клетками на указанной выше стадии c, могут также быть получены переносом полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC, как описано выше в разделе «VI. Антигенпрезентирующие клетки»; но не ограничиваются ими, и любые APC, которые эффективно представляют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, могут использоваться для настоящего способа.

Вместо таких APC могут также использоваться экзосомы, которые представляют на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. А именно, способ индукции CTL по настоящему изобретению может включать стадию совместного культивирования экзосом, представляющих на его поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. Такие экзосомы могут быть получены способами, описанными выше в разделе «V. Экзосомы».

Кроме того, CTL могут быть индуцированы введением полинуклеотида, кодирующего субъединицу TCR, связывающуюся с пептидом по настоящему изобретению, в CD8-положительные клетки. Такая трансдукция может выполняться, как описано выше в разделе «VIII. T-клеточный рецептор (TCR)».

(3) Способ индукции иммунного ответа

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам индукции иммунного ответа против злокачественных новообразований у индивида. Способы включают введение вакцины по настоящему изобретению, которая содержит:

(a) один или более пептидов по настоящему изобретению или его иммунологически активный фрагмент;

(b) один или более полинуклеотидов, кодирующих пептиды или иммунологически активный фрагмент (a);

(c) одну или более изолированных CTL по настоящему изобретению; или

(d) одну или более изолированных антигенпрезентирующих клеток по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, злокачественное новообразование, избыточно экспрессирующее WDRPUH, можно лечить указанными активными ингредиентами. Соответственно, перед введением вакцин или фармацевтических композиций, содержащих активные ингредиенты, предпочтительно подтвердить, повышен ли уровень экспрессии WDRPUH в подлежащих лечению злокачественных клетках или тканях, по сравнению с нормальными клетками того же органа. Таким образом, в одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится способу лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего WDRPUH, причем способ может включать стадии:

i) определения уровня экспрессии WDRPUH в злокачественных клетках или ткани, полученных у индивида, страдающего подлежащим лечению злокачественным новообразованием;

ii) сравнения уровня экспрессии WDRPUH с нормальным контролем; и

iii) введения, по меньшей мере, одного компонента, выбранного из группы, состоящей из описанных выше ингредиентов вакцины от (a) до (d) индивиду, страдающему злокачественным новообразованием, избыточно экспрессирующим WDRPUH, по сравнению с нормальным контролем.

Альтернативно, настоящее изобретение также относится к вакцине или фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из описанных выше ингредиентов вакцины от (a) до (d) индивиду, страдающему злокачественным новообразованием, избыточно экспрессирующим WDRPUH. Другими словами, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации индивида, подлежащего лечению полипептидом WDRPUH по настоящему изобретению, причем способ может включать стадию определения уровня экспрессии WDRPUH в полученных у индивида злокачественных клетках или ткани, где увеличение уровня, по сравнению с нормальным контрольным уровнем гена, указывает на то, что у индивида имеется злокачественное новообразование, которое можно лечить полипептидом WDRPUH по настоящему изобретению. Способ лечения злокачественного новообразования по настоящему изобретению будет детальнее описан ниже.

Индивид, подлежащий лечению настоящим способом, предпочтительно представляет собой млекопитающее. Иллюстративные млекопитающие включают без ограничения, например, человека, не человекообразного примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь и корову.

В соответствии с настоящим изобретением, определяется уровень экспрессии в злокачественных клетках или тканях, полученных у индивида. Уровень экспрессии может быть определен на уровне продукта транскрипции (нуклеиновой кислоты) с использованием способов, известных в данной области. Например, мРНК WDRPUH можно количественно определить с использованием зондов способами гибридизации (например, Норзерн гибридизацией). Выявление может проводиться на чипе или биологическом датчике. Использование биологического датчика предпочтительно для выявления уровня экспрессии WDRPUH. Специалисты в данной области могут получить такие зонды с использованием информации о последовательности WDRPUH. Например, кДНК WDRPUH могут использоваться в качестве зондов. При необходимости, зонд может быть мечен подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изотопы, и уровень экспрессии гена может выявляться в виде интенсивности гибридизированных меток.

Кроме того, содержание продукта транскрипции WDRPUH (SEQ ID NO: 63) может быть количественно определено использованием праймеров способами выявления на основе амплификации (например, RT-PCR (полимеразной цепной реакцией в реальном масштабе времени)). Такие праймеры могут быть также получены на основании доступной информации о последовательности гена.

В частности, зонд или праймер, используемый для настоящего способа, гибридизируется в условиях высокой, умеренной и низкой жесткости предписаний по проведению гибридизации в мРНК WDRPUH. Используемая в настоящем описании фраза «жесткие условия (гибридизации)» относится к условиям, в которых зонд или праймер гибридизируется в его целевую последовательность, но не в другие последовательности. Жесткие условия зависят от последовательности, и они различны в различных обстоятельствах. Специфическая гибридизация более длинных последовательностей наблюдается при более высоких температурах, чем более коротких последовательностей. В целом, температура жесткого условия выбирается на уровне, примерно на 5 градусов Цельсия ниже, чем точка термического плавления (Tm) для определенной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных к последовательности-мишени, гибридизируются в последовательность-мишень при равновесии. Поскольку последовательности-мишени в целом присутствуют в избытке, то при Tm, 50% зондов занимаются при равновесии. Обычно, жесткие условия представляют собой те, в которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,0 M иона натрия, обычно, примерно от 0,01 до 1,0 M иона натрия (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет, по меньшей мере, примерно 30 градусов Цельсия для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, примерно 60 градусов Цельсия для более длинных зондов и праймеров. Жесткие условия могут быть также достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид.

Альтернативно, продукт трансляции может быть выявлен для диагностики по настоящему изобретению. Например, может быть определено количество протеина WDRPUH (SEQ ID NO: 64). Способы определения количества протеина в качестве продукта трансляции включают способы иммунного анализа, в которых используется антитело, специфически распознающее протеин. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, для выявления может использоваться любой фрагмент или модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, и т.д.) антитела, пока фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связывания с протеином WDRPUH. Способы получения данных видов антител для выявления протеинов хорошо известны в данной области, и в настоящем изобретении может использоваться любой способ получения таких антител и их эквивалентов. В качестве другого способа выявления уровня экспрессии гена WDRPUH на основании продукта его трансляции, интенсивность окрашивания может наблюдаться посредством иммуногистохимического анализа с использованием антитела против протеина WDRPUH. А именно, наблюдение сильного окрашивания указывает на увеличенное присутствие протеина и в то же время высокий уровень экспрессии гена WDRPUH.

Уровень экспрессии гена-мишени, включая ген WDRPUH в злокачественных клетках, может считаться увеличенным, если он увеличивается от контрольного уровня соответствующего гена-мишени, например, на 10%, 25% или 50%; или увеличивается до более чем 1,1 раза, более чем 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз или более.

Контрольный уровень может определяться одновременно со злокачественными клетками путем использования образца (образцов), ранее взятых у индивида/индивидов, патологическое состояние (состояния) которых (канкрозные или не канкрозные) известны. Кроме того, нормальные клетки, полученные из не пораженных злокачественным процессом областей органа, пораженного злокачественным новообразованием, подлежащим лечению, могут использоваться в качестве нормального контроля. Альтернативно, контрольный уровень может определяться статистическим способом на основании результатов, полученных анализом ранее определенного уровня (уровней) экспрессии гена WDRPUH в образцах от индивидов, патологические состояния которых известны. Кроме того, контрольный уровень может представлять собой базу данных типов экспрессии из ранее тестированных клеток.

Кроме того, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, уровень экспрессии гена WDRPUH в биологическом образце может сравниваться с множественными контрольными уровнями, причем указанные контрольные уровни определяются из множественных эталонных образцов. Предпочтительно использование контрольного уровня, определенного по эталонному образцу, полученному из типа ткани, аналогичного типу ткани биологического образца, полученного у индивида. Кроме того, предпочтительно использование стандартной величины уровней экспрессии гена WDRPUH в популяции с известным патологическим состоянием. Стандартная величина может быть получена любым способом, известным в данной области. Например, диапазон средней ±2 S.D. (стандартных отклонений) или средней ±3 S.D. может использоваться в качестве стандартной величины.

В контексте настоящего изобретения, контрольный уровень, определенный в биологическом образце, который, как известно, является не канкрозным, именуется «нормальным контрольным уровнем». С другой стороны, если контрольный уровень определяется в канкрозном биологичском образце, он именуется «канкрозным контрольным уровнем».

Когда уровень экспрессии гена WDRPUH увеличивается по сравнению с нормальным контрольным уровнем или аналогичен канкрозному контрольному уровню, то у индивида может диагностироваться подлежащее лечению злокачественное новообразование.

Настоящее изобретение также относится к набору для определения индивида, страдающего злокачественным новообразованием, которое можно лечить полипептидом WDRPUH по настоящему изобретению, который может также использоваться при оценке и/или мониторинге эффективности иммунотерапии злокачественных новообразований. Предпочтительно, злокачественное новообразование представляет собой печеночно-клеточную карциному. Конкретнее, набор предпочтительно включает, по меньшей мере, один реагент для выявления экспрессии гена WDRPUH в полученной у индивида злокачественной (раковой) клетке, причем реагент может быть выбран из группы:

(a) реагента для выявления мРНК гена WDRPUH;

(b) реагента для выявления протеина WDRPUH; и

(c) реагента для выявления биологической активности протеина WDRPUH.

Подходящие реагенты для выявления мРНК гена WDRPUH включают нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с мРНК WDRPUH или идентифицируют ее, такие как олигонуклеотиды, которые имеют комплементарную последовательность к части мРНК WDRPUH. Эти виды олигонуклеотидов иллюстрируются праймерами и зондами, которые специфичны для мРНК WDRPUH. Данные виды олигонуклеотидов могут быть получены на основании способов, хорошо известных в данной области. При необходимости, реагент для выявления мРНК WDRPUH может быть иммобилизован на твердой матрице. Кроме того, в набор может быть включено несколько реагентов для выявления мРНК WDRPUH.

С другой стороны, подходящие реагенты для выявления протеина WDRPUH, включают антитела к WDRPUH. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, любой фрагмент или модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, и т.д.) антитела может использоваться в качестве реагента, пока фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связывания с протеином WDRPUH. Способы получения указанных видов антител для выявления протеинов хорошо известны в данной области, и любой способ может использоваться в настоящем изобретении для получения таких антител и их эквивалентов. Кроме того, антитело может быть мечено молекулами, генерирующими сигнал посредством прямой связи или методики непрямого мечения. Метки и способы мечения антител и выявления связывания антител с их мишенями хорошо известны в данной области, и для настоящего изобретения могут использоваться любые метки и способы. Кроме того, в набор могут быть включены несколько реагентов для выявления протеина WDRPUH.

Набор может содержать несколько указанных выше реагентов. Например, образцы ткани, полученные у индивидов, страдающих и не страдающих злокачественными новообразованиями, могут служить в качестве полезных контрольных реагентов. Набор по настоящему изобретению может, кроме того, включать другие материалы, желательные с точки зрения производителя и пользователя, включая буферы, разбавители, наполнители, иглы, шприцы и вкладыши упаковки (например, письменные, печатные, CD-ROM (компакт-диски только со считываемой памятью) и т.д.)) с инструкциями по применению. Эти реагенты и тому подобные могут содержаться в контейнере с этикеткой. Подходящие контейнеры включают флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из разнообразных материалов, таких как стекло и пластик.

В качестве варианта осуществления настоящего изобретения, когда реагент представляет собой зонд против мРНК WDRPUH, реагент может быть иммобилизован на твердой матрице, такой как пористая полоска, для образования, по меньшей мере, одного участка выявления. Область измерения или выявления на пористой полоске может включать множество участков. Причем каждый содержит нуклеиновую кислоту (зонд). Тестирующая полоска может также содержать участки для отрицательных и/или положительных контролей. Альтернативно, контрольные участки могут располагаться на полоске, отдельно от тестирующей полоски. Возможно содержание в различных участках выявления различных количеств иммобилизованных аминокислот, т.е. большее количество в первом участке выявления и меньшие количества в последующих участках. После добавления тестируемого образца число участков, проявляющих выявляемый сигнал, обеспечивает количественную индикацию количества мРНК WDRPUH, присутствующего в образце. Участки выявления могут быть сконфигурированы в любую выявляемую форму и обычно имеют форму полосы или точки,занимающейширину тестирующей полоски.

Набор по настоящему изобретению может, кроме того, включать образец положительного контроля или стандартный образец WDRPUH standard. Образец положительного контроля по настоящему изобретению может быть получен сбором WDRPUH-положительных образцов, а затем анализируются указанные уровни WDRPUH. Альтернативно, очищенный протеин WDRPUH или полинуклеотид могут добавляться к клеткам, не экспрессирующим WDRPUH, для образования положительного образца или стандарта WDRPUH. В настоящем изобретении, очищенный WDRPUH может представлять собой рекомбинантный протеин. Уровень WDRPUH в образце положительного контроля составляет, например, больше, чем величина отсечки.

Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и для содействия среднему специалисту в данной области в его реализации и использовании. Примеры никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Клеточные линии

Линия лимфобластоидных клеток A24 (A24LCL) была получена трансформацией вирусом Эпштейна-Бара в HLA-A24-положительные B-лимфоциты человека. T2 (HLA-A2), COS7, линию клеток африканских зеленых обезьян закупали в ATCC (Американской Коллекции Типовых Культур).

Выбор перспективных пептидов, происходящих из WDRPUH

Пептиды 9-mer и 10-mer, происходящие из WDRPUH, которые связываются с молекулами HLA-A*2402 и HLA-A*0201, прогнозировались с использованием программного обеспечения прогноза связывания «BIMAS» (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)). Указанные пептиды были синтезированы компаниями Sigma (Sapporo, Japan) или Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX) в соответствии со стандартным способом твердофазного синтеза и очищались высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в обращенной фазе. Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) в концентрации 20 мг/мл и хранили при -80ºC.

Индукция CTL in vitro

Происходящие из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC) для индукции реакций цитотоксических T лимфоцитов (CTL) против пептидов, представленных на человеческом лейкоцитарном антигене (HLA). DC генерировали in vitro, как описано в литературе (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). В частности, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные у здорового добровольца (HLA-A*2402-положительные и HLA-A*0201-положительные) раствором Ficoll-Plaque (Pharmacia), отделяли адгезией к пластиковой чашке для культуры ткани (Becton Dickinson) с тем, чтобы обогатить их в виде моноцитарной фракции. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 ЕД/мл фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) (R&D System), и 1000 ЕД/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V Medium (Invitrogen), содержащей 2% инактивированную нагреванием аналогичную сыворотку (AS). После 7 дней культивирования индуцированные цитокином DC подвергали пульсирующему воздействию 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина течение 3 ч при 37º C в среде AIM-V. Оказалось, что генерированные клетки экспрессируют молекулы, связанные с DC, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA II класса, на их поверхностях (данные не представлены).

Эти подвергнутые пульсирующему воздействию пептидами DC затем инактивировали митомицином C (MMC) (30 мкг/мл в течение 30 мин) или рентгеновским облучением (20 Гр) и смешивали в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными положительным отбором для выделения CD8-положительных клеток Positive Isolation Kit (Dynal). Данные культуры помещали в 48-луночные планшеты (Corning); каждая лунка содержала 1,5×10⁴ подвергнутых пульсирующему воздействию пептидами DC, 3×10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/ил IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Через 3 дня, эти культуры дополняли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. На 7 и 14 дни, T-клетки дополнительно стимулировали подвергнутыми пульсирующему воздействию пептидами аутологичными DC. DC получали каждый раз, выполняя те же описанные выше стадии. CTL тестировали против подвергнутых пульсирующему воздействию пептидами клеток A24LCL или T2 после третьего цикла пептидной стимуляции на 21-й день (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Процедура размножения CTL

CTL размножали в культуре с использованием способа, аналогичного способу, описанному Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Общее количество CTL, составляющее 5×10 ⁴, суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS с 2 видами линий человеческих B-лимфобластоидных клеток, инактивированных митомицином C, в присутствии 40 нг/мл анти-CD3 моноклонального антитела (Pharmingen). Через сутки после начала культивирования, к культурам добавляли 120 МЕ/мл IL-2. В культуры подавали свежую среду AIM-V/5% AS, содержащую 30 МЕ/мл IL-2 на 5, 8 и 11-й дни (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Получение клонов CTL

Разведения производили до содержания 0,3, 1 и 3 CTL/лунку в 96-луночный микротитровальный планшет с круглым дном (Nalge Nunc International). CTL культивировали при 1×10⁴ клетках/лунку 2 видов линий человеческих B-лимфобластоидных клеток, 30 нг/мл анти-CD3 антитела и 125 ЕД/мл IL-2 в общем количестве 150 мкл/лунку среды AIM-V, содержащей 5% AS. 50 мкл/лунку IL-2 добавляли к среде через 10 дней с тем, чтобы достичь конечной концентрации 125 МЕ/мл IL-2. Активность CTL тестировали на 14-й день, и клоны CTL размножали с использованием такого же способа, как описано выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Специфическая активность CTL

Для исследования специфической активности CTL выполняли иммуноферментный анализ пятна (ELISPOT) интерферона (IFN)-гамма и ферментный иммуноферментый анализ IFN-гамма (ELISA). В частности, подвергнутые пульсирующему воздействию пептидов A24LCL (1×10⁴/лунку) или T2 (1×10⁴ /лунки) получали в качестве стимулирующих клеток. Культивированные клетки в 48 лунках использовали в качестве реагирующих клеток. ELISPOT-анализ IFN-гамма и анализ ELISA IFN-гамма выполняли в соответствии с процедурой, рекомнедуемой производителем.

Трансфекция плазмид

кДНК, кодирующие открытые рамки считывания генов-мишеней, HLA-A24 и HLA-A*0201, амплифицировали PCR. Амплифицированный PCR продукт генов-мишеней и HLA-A24 или HLA-A*0201 клонировали в вектор pIRES (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605). Плазмиды трансфецировали в COS7, который представляет собой ген-мишень, и HLA-A24-нулевую линию клеток, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen), в соответствии с процедурами, рекомендуемыми производителем. Через 2 дня после трансфекции трансфецированные клетки собирали версеном (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней (5×10⁴ клеток/лунку) для анализа активности CTL.

Результаты

Прогноз связывающих HLA-A24 и HLA-A2 пептидов, происходящих из WDRPUH

В таблице 1 показаны связывающие HLA-A24 пептиды WDRPUH в порядке самого высокого сродства связывания. Всего 25 пептидов, имеющих потенциальную способность связывания HLA-A24, были выбраны и исследованы для определения пептидов (таблица 1). В таблице 2 показаны связывающие HLA-A2 пептиды 9mer и 10mer WDRPUH в порядке самого высокого сродства связывания. Всего 25 пептидов, имеющих потенциальную способность связывания HLA-A2, были выбраны и исследованы для определения пептидов (таблица 2).

Таблица 1 Связывающие HLA-A24 пептиды, происходящие из WDRPUH, прогнозированные BIMAS
Исходное положение указывает число аминокислотных остатков от N-конца WDRPUH. Балльная оценка связывания получена по «BIMAS»

Таблица 2 Связывающие HLA-A2 пептиды, происходящие из WDRPUH, прогнозированные BIMAS
Исходное положение указывает число аминокислотных остатков от N-конца WDRPUH. Балльная оценка связывания получена по «BIMAS»

Индукция CTL пептидами, прогнозированными по WDRPUH, ограниченному HLA-A*2402, и установление линий CTL, стимулированных пептидами, происходящими из WDRPUH

CTL для пептидов, происходящих из WDRPUH, генерировали в соответствии с последовательностями операций, описанных в разделе «Материалы и методы». Специфическую активность пептидов в отношении CTL определяли ELISPOT-анализом IFN-гамма (фиг. 1a-f). Анализ показал, что клетки в лунках № 3 и № 6, стимулированные WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), № 8, стимулированные WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), № 2 и № 6, стимулированные WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), № 1, № 2 и № 5, стимулированные WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), № 2, № 3, № 4, № 6, № 7 и № 8, стимулированные WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e) и № 5, № 6 и № 8, стимулированные WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f), продемонстрировали мощную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками.

Кроме того, клетки в положительных номерах лунок № 6, стимулированные SEQ ID NO: 1, № 8, стимулированные SEQ ID NO: 2, № 2, стимулированные SEQ ID NO: 3, № 5, стимулированные SEQ ID NO: 4, № 4, стимулированные SEQ ID NO: 16 и № 6, стимулированные SEQ ID NO: 17, размножились и установились в виде линий CTL. Активность CTL этих линий CTL определяли ELISA анализом IFN-гамма (фиг. 2a-f). Все линии CTL продемонстрировали мощную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых пульсирующему воздействию соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями без пульсирующего воздействия пептидов. С другой стороны, ни одна линия CTL не могла быть установлена стимуляцией другими пептидами, показанными в таблице 1, несмотря на то, что пептиды прогнозировались как имеющие активность связывания с HLA-A*2402 (данные не представлены). В результате, был проведен скрининг 6 пептидов, происходящих из WDRPUH в качестве пептидов, которые могут индуцировать линии активных CTL.

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих WDRPUH и HLA-A*2402

Полученные линии CTL, выращенные против пептидов по настоящему изобретению, были исследованы для выявления их способности распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессируют WDRPUH и молекулу HLA-A*2402. Специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфецированных и WDRPUH полной длины, и генами молекулы HLA-A*2402 (специфической моделью для клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют WDRPUH и ген HLA-A*2402), тестировали с использованием линий CTL, выращенных соответствующими пептидами в качестве эффекторных клеток. Клетки COS7, трансфецированные или WDRPUH полной длины, или геном HLA-A*2402, получали в качестве контроля. На фиг. 3 CTL, стимулированные SEQ ID NO: 2, проявили мощную активность CTL против клеток COS7, экспрессирущих и WDRPUH, и HLA-A*2402. Напротив, не была выявлена значимая специфическая активность CTL против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрируют, что WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) естественно перерабатывался и представлялся на поверхности клетки-мишени молекулой HLA-A*2402 и распознавался CTL. Эти результаты указали на то, что данный пептид, происходящий из WDRPUH, может применяться в качестве вакцин против злокачественных новообразований для пациентов, страдающих опухолями, экспрессирующими WDRPUH.

Индукция CTL прогнозируемыми пептидами из WDRPUH, ограниченного HLA-A*0201

CTL, распознающие пептиды, происходящие из WDRPUH, были генерированы в соответствии с последовательностями операций, описанными в разделе «Материалы и методы». Специфическую для пептидов активность CTL определяли ELISPOT-анализом IFN-гамма (фиг. 4a-l). Клетки в лунках № 2 и № 7, стимулированные WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30) (a), № 2, стимулированные WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31) (b), № 3, стимулированные WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34) (c), № 6, стимулированные WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36) (d), № 4, стимулированные WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37) (e), № 4, стимулированные WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40) (f), № 2 и № 8, стимулированные WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41) (g), № 5, стимулированные WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45) (h), № 2, стимулированные WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49) (i), № 6, стимулированные WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55) (j), № 7, стимулированные WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57) (k) и № 6, стимулированные WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61) (l) демонстрировали мощную продукцию IFN-гамма, по сравнению с клетками в контрольных лунках. С другой стороны, невозможно было выявить мощную продукцию IFN-гамма при стимуляции другими пептидами, показанными в таблице 2, несмотря на то, что эти пептиды прогнозировались как имеющие активность связывания с HLA-A*0201 (данные не представлены).

Получение линий и клонов CTL против пептидов, специфичных для WDRPUH

Клетки, которые проявили специфическую для пептидов активность CTL ELISPOT-анализом IFN-гамма в лунке номер № 7, где клетки стимулировались SEQ ID NO: 30 и № 3, где клетки стимулировались SEQ ID NO: 34, размножались и устанавливались в качестве линий CTL. Активность CTL этих линий CTL определяли ELISA-анализом IFN-гамма (фиг. 5a и b). Обе линии CTL демонстрировали мощную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых пульсирующей обработке соответствующими пептидами, по сравнению с клетками-мишенями без пульсирующей обработки пептидами. Кроме того, клоны CTL были установлены ограничивающим разведением из линий CTL, и продукцию IFN-гамма из клонов CTL против клеток-мишеней, подвергнутых пульсирующей обработкой соответствующими пептидами, определяли ELISA-анализом IFN-гамма.

Мощная продукция IFN-гамма из клонов CTL, стимулированных SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 34, демонстрируется на фиг. 5c и d.

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих WDRPUH и HLA-A*0201

Полученные клоны CTL, выращенные против пептидов по настоящему изобретению, исследовали для выявления их способности распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессируют WDRPUH и молекулу HLA-A*0201. Специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфецированных и WDRPUH полной длины, и генами молекулы HLA-A*0201 (специфической моделью для клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют WDRPUH и ген HLA-A*0201), тестировали с использованием линий CTL, выращенных соответствующими пептидами в качестве эффекторных клеток. Клетки COS7, трансфецированные генами или WDRPUH полной длины, или HLA-A*0201, получали в качестве контроля. На фиг. 5e CTL, стимулированные SEQ ID NO: 34, проявили мощную активность CTL против клеток COS7, экспрессирущих и WDRPUH, и HLA- A* 0201. Напротив, не была выявлена значимая специфическая активность CTL против контролей. Эти данные ясно демонстрируют, что пептиды WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34) были эндогенно экспрессированы и представлены на поверхности клеток-мишеней молекулой HLA-A*0201 и распознавались CTL. Эти результаты указали на то, что WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34) может применяться в качестве вакцин против злокачественных новообразований для пациентов, страдающих опухолями, экспрессирующими WDRPUH.

Анализ гомологии антигенных пептидов

CTL, стимулированные

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16),

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17),

WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID NO: 57) и

WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID NO: 61),

проявили значимую и специфическую активность CTL. Данный результат может быть вызван тем, что указанные пептидные последовательности гомологичны пептидам, происходящим из других молекул, которые, как известно, сенсибилизируют иммунную систему человека.

Для исключения этой возможности анализы гомологии выполняли для указанных пептидных последовательностей с использованием в качестве вопросов алгоритм BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательность со значимой гомологией. Результаты анализов гомологии указывают на то, что последовательности

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16),

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17),

WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID NO: 57) и

WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID NO: 61),

являются уникальными, и, таким образом, насколько известно заявителям, маловероятно, что эти молекулы вызовут непреднамеренные иммунологические реакции на какие-либо не относящиеся к ним молекулы.

В заключение, были идентифицированы новые пептиды эпитопов HLA-A24 и A2, и было продемонстрировано, что их можно применять для иммунотерапии злокачественных новообразований.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение описывает новые TAA, в частности TAA, происходящие из WDRPUH, которые индуцируют мощные и специфические противоопухолевые иммунные реакции и применимы для таких типов злокачественных новообразований как печеночно-клеточная карцинома. Такие TAA гарантируют дальнейшее развитие клинического применения стратегии пептидной вакцинации при злокачественных новообразованиях.

Хотя изобретение было детально описано и со ссылкой на определенные варианты его осуществления, следует понимать, что предшествующее описание является, по существу, иллюстративным и предназначено для демонстрации изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Посредством обычного экспериментирования, специалист в данной области легко поймет, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации без отхода от сущности и объема изобретения. Таким образом, предполагается, что изобретение определяется не приведенным выше описанием, а следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.