иммуноцитохимический способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (рбтл) при стимуляции их фитогемагглютинином (фга)

Формула изобретения

Способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) человека при стимуляции их в течение 72 часов фитогемагглютинином (ФГА), отличающийся тем, что оценка реакции проводится иммуноцитохимическим методом в люминесцентном микроскопе в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве маркера ядерного антигена Ki-67, выявляемого моноклональным антителом (МКА) к Ki-67, где о функциональной способности лимфоцитов судят по количеству визуализированных (светящихся) Ki-67-положительных клеток, имеющих фокусы свечения в ядре клеток, появляющиеся после искусственной стимуляции их к пролиферации фитогемагглютинином, и при значении антиген-позитивных клеток меньше 49% судят о снижении функциональной активности лимфоцитов у лиц с нарушением иммунного статуса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологии, медицины и биотехнологии, конкретно к использованию иммуноцитохимических методов оценки функционального состояния лимфоцитов при изучении иммунного статуса человека по их пролиферативной активности в ответ на стимуляцию митогеном.

Исследование функционального состояния лимфоцитов, определяемое по пролиферативному ответу на митогены или антигены, является одним из наиболее информативных методов оценки показателей клеточного иммунитета. Среди митогенов (фитогемагглютинин-ФГА, конканавалин-А - Кон-А, митоген лаконоса - pokeweed-митоген и др.) наибольшее распространение получил фитогемагглютинин (ФГА) после того, как в шестидесятых годах прошлого столетия было обнаружено, что под его влиянием большая часть лимфоцитов через 72 часа в результате пролиферации трансформируется в бласты (Hugenford H.A, .J.Hum. Genet., 1959, 11, p.215; Nowell P.C., Cancer Res., 1960, 20, p.462 - цитируется по Вершигора А.Е., Киев, 1975, с.238). В связи с этим эту реакцию назвали реакцией бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Оценка реакции первоначально проводилась на световом микроскопе с подсчетом морфологически различимых бластов. Однако из-за субъективности оценки метода морфологическая окраска была вскоре заменена на использование в конце реакции (после 3-суточного культивирования лимфоцитов с ФГА) радиоактивной метки ³Н-тимидина, включающегося в бласттрансформированные лимфоциты, с подсчетом радиоактивности на автоматическом сцинтилляционном -счетчике. До настоящего времени метка ³Н-тимидином в РБТЛ остается единственным объективным и общепризнанным методом при исследовании функционального состояния лимфоцитов в качестве показателя клеточного иммунитета как в отечественной, так и в мировой литературе (Вершигора А.Е., К. «Вища школа», 1975, с.238; Драник Г.Н., М. 2003 г., с.181; «Иммунологические методы» под редакцией Фримеля X., М., «Медицина», 1987, с.294; «Лимфоциты, методы» под редакцией Клаус Дж., М., «Мир», 1990, с.292; «Клиническая иммунология и аллергология» под редакцией Л.Йогера, М., «Медицина», т.1, с.87; Лебедев К.А. и др., М., «Медицинская книга», 2003 г., с.146; Новиков Д.К., М., «Медицина», 1996, с.23; Петров Р.В., М., «Медицина», 1987, с.176; Шабалин В.Н. и др., Л., Медицина, 1988, с.205-209; Chien C.H. et al. Hum Reprod. 2009 Aug; 24(8):1968-1975; Dabrowski M.P et al., Mediators Inflamm. 2001 Jun; 10(3):101-107 и др.).

Спектр применения этого метода достаточно широк: оценка иммунного статуса, изучение механизмов активации клеток при пролиферации, оценка действия иммуномодуляторов, сравнение с активацией аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов при пересадке костного мозга (Булычева Т.И. и др. Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), с.944-954; Дергунова Н.Н. и др. Иммунология, 2003, том 24, № 4. с.205-208), изучение влияния ФГА-стимуляции на изменение состояний регуляторных субпопуляций клеток (Т и В-лимфоцитов, NK-клеток) и продукцию цитокинов, а также корреляции ответа лимфоцитов на ФГА-стимуляцию с развитием различных заболеваний и ответом на терапию (Булычева Т.И. и др. Иммунология 2000, № 5, с.46-52; Лебедев К.А. и др. М., «Медицинская книга», 2003 г., с.146; Шабалин В.Н. и др. Л., Медицина, 1988, с.192-209; Ashwood P. et al., Brain Behav Immun. 2011 Jul;25(5):840-849; Chien CH et al., Hum Reprod. 2009 Aug;24(8):1968-1975; Dabrowski MP et al., Mediators Inflamm. 2001 Jun; 10(3):101-107; Deniz G. at al., J Immunol. 2008 Jan 15;180(2):850-857; Duarte RF et al., Gene Ther. 2002 Oct;9(20):1359-1368; Ebert EC. Clin Exp Immunol. 2003 Jun;132(3):424-429; Hainaut М. et al., Clin Exp Immunol. 2011 Jul;165(1):77-84; Szyllo K. et al., Mediators Inflamm. 2003 Jun; 12(3):131-138; Ustun S. et al., World J Gastroenterol. 2004 Dec 15;10(24):3643-3646; Yang Z.Z et al., Blood. 2006 May 1;107(9):3639-3646 Yoon SC et al. Psychiatry Investig. 2010 Mar;7(1):68-71;

и др.)

Однако необходимость использования радиоактивного ³Н-тимидина в качестве метки для оценки функционального состояния лимфоцитов при ФГА-стимуляции в РБТЛ резко ограничивает внедрение метода при определении иммунного статуса в широкую лабораторную практику, так как требует специальных условий для его проведения. В то же время этот тест особенно востребован в последнее время в связи с резким увеличением работ по иммунотерапевтическим воздействиям у больных при трансплантации органов, костного мозга, пуповинной крови при онкологических и онкогематологических заболеваниях

В связи с этим целью исследования явилось изучение возможности применения в РБТЛ для оценки пролиферативной активности лимфоцитов при ФГА-стимуляции вместо ³Н-тимидина объективного иммуноцитохимического метода с использованием в качестве метки ядерного антигена, ассоциированного с пролиферацией, выявляемого в реакции непрямой иммунофлюоресценции с помощью соответствующих моноклональных антител (МКА).

В лаборатории клинической иммунологии ГНЦ МЗ и СР (Москва) в течение длительного времени (с 1984 года) проводится работа по созданию методами гибридомной биотехнологии новых гибридом, секретирующих МКА, в том числе и к ядерным антигенам клеток, ассоциированным с пролиферацией. В результате были получены 2 гибридомы (3С9/В23 и A3), секретирующие МКА к соответствующим ядрышковым антигенам (Малашенко О.С. и др. Патент на изобретение РФ № 2145634 от 20.02.2000; Булычева Т.И. и др. Патент на изобретение РФ № 2296159 от 27.03.2007), изучена их характеристика и изменения на различных стадиях клеточного цикла в процессе ФГА-стимуляции лимфоцитов при сравнении с имеющимся общепризнанным антигеном пролиферации Ki-67 (Артеменко Е.Г. автореферат канд.дис., М., 2004; Булычева Т.И. и др. Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), 944-954; Булычева Т.И. и др. Патент на изобретение РФ № 2431670 от 20 октября 2011 г; Булычева Т.И. и др. Иммунология, 2009, № 5, стр.287-289; и др). Для изучения изменений в экспрессии новых ядерных антигенов в процессе пролиферации нами был использован метод ФГА-стимуляции лимфоцитов с оценкой реакции в непрямом методе имммунофлюоресценции с МКА к Ki-67, В23, A3, и новому белку Surf-6 при контроле с параллельно проводимой радиометрической оценкой реакции по включению в клетки ³Н-тимидина в свежевыделенные лимфоциты и через 24, 48 и 72 часа после начала инкубации их с ФГА (таблица).

Как видно из таблицы, в результате проведенных исследований и в опубликованных нами работах (Артеменко Е.Г. автореферат канд.дис., М., 2004; Булычева Т.И. и др. Пробл. гематол. и перелив. крови, 2003, № 2, стр.34-35; Булычева Т.И. и др. Патент РФ на изобретение № 2438135 от 27 декабря 2011 г.; Булычева Т.И. и др. «Иммунология», 2011, № 5, с 231-236; Григорьев А.А. Характеристика ядрышкового антигена клеток человека, выявляемого новым моноклональным антителом., автореф. канд.дис. М., 2008; Григорьев А.А и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, (2007) № 9, т.144, стр321-325; Малышева М.В., автореферат кан.дис. М., 2010; Малышева М.В. «Иммунология 2010, № 1, с.13-17; и др.) показано, что:

1) Ki-67, являющийся ядерным антигеном, практически отсутствовал в интактных лимфоцитах здоровых лиц (окрашивая не более 1% клеток), но появлялся в постепенно нарастающих количествах спустя 24 часа от начала ФГА -стимуляции, маркируя в среднем до 45-74% клеток через 48-72 часа после инкубации их с ФГА в виде светящихся в люминесцентном микроскопе фокусов в ядре клетки.

2) В23/нуклеофозмин - ядрышковый антиген клеток, выявлялся в виде 1 светящегося фокуса в ядре в среднем в 65% интактных лимфоцитов с последующим увеличением количества позитивных клеток и фокусов свечения до 4-6 с увеличением их размеров, достигающих максимума через 72 часа инкубации с ФГА при 85% маркируемых клеток.

3) A3 - новый ядрышковый антиген выявлялся практически во всех интактных лимфоцитах в виде 1 светящейся точки с последующим увеличением в процессе ФГА-стимуляции количества фокусов свечения до 8-10, образующих бусы или ожерелоподобные образования через 72 часа от начала инкубации с ФГА.

4) Surf-6 - малоизвестный ядрышковый антиген не выявлялся в интактных лимфоцитах, но при ФГА-стимуляции его экспрессия начиналась несколько раньше экспрессии Ki-67 с постепенным увеличением количества маркируемых клеток до 54% через 48 часов и 100% через 72 часа от начала инкубации с ФГА со свечением по поверхности увеличенных в размерах ядрышек.

Поставленные параллельно в реакции ФГА-стимуляции те же образцы лимфоцитов с включением в качестве маркера ³Н-тимидина показали, как и следовало ожидать, практическое отсутствие включения ³Н-тимидина в лимфоциты от начала до 24 часов инкубации с ФГА (не более 500 имп/мин) с резким возрастанием уровня радиоактивности в клетках, достигающего максимальных значений через 48-72 часа от начала стимуляции, в среднем до 25,2-28,7×10 ³ имп/мин, соответственно, (22×10³-73×10 ³ имп/мин), при индексе стимуляции, в среднем, 54,7-55,2 (от 42 до 104), что соответствовало не только полученным нами ранее данным (Булычева Т.И. и др. Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), 944-954; Булычева Т.И. и др. Иммунология 2000, № 5, с.46-52; Дергунова Н.Н. и др. Иммунология, 2003, том 24, № 4. С.205-208; Dergunova N.N. et al. Immunology Letters, 2002, 83, 67-72), но и результатам других авторов (Яздовский В.В и др. Иммунология, 1994, № 5, с.21-24; Chien СН et al., Hum Reprod. 2009 Aug;24(8):1968-1975; Dabrowski MP et al., Mediators Inflamm. 2001 Jun; 10(3):101-107; Deniz G et al., J Immunol. 2008 Jan 15;180(2):850-857 и др.)

Эти данные по включению ³Н-тимидина в лимфоциты в процессе ФГА стимуляции подтверждали наличие адекватного ответа исследуемых лимфоцитов здоровых лиц на стимуляцию их ФГА, что позволило достоверно оценивать и результаты иммуноцитохимических исследований. Более того, нарастание количества пролиферирующих клеток, оцениваемых по экспрессии антигенов Ki-67, В23, Surf-6 и A3 параллельно с увеличением количества клеток, включивших ³Н-тимидин, свидетельствовало о том, что изучаемые антигены ассоциированы с пролиферативной активностью клеток, изменяющейся в процессе ФГА- стимуляции лимфоцитов, контролируемой ранее по включению ³Н-тимидина.

В то же время при отсутствии внесения ФГА в контрольные культуры интактных лимфоцитов экспрессия изучаемых антигенов в клетках и включение в них ³Н-тимидина на всех сроках исследования практически не изменялись, соответствуя показателям непролиферирующих клеток.

Это позволило нам считать оправданным возможность использования вышеуказанных МКА не только для характеристики выявляемых с их помощью изучаемых ядерных антигенов, но и для иммуноцитохимической оценки реакции ФГА - стимуляции лимфоцитов (или согласно прежнему обозначению - РБТЛ).

Как видно из приведенных данных (таблица), все 4 изученных нами антигена могли быть названы претендентами на использование их в качестве маркеров пролиферации в реакции ФГА-стимуляции лимфоцитов (или РБТЛ). Однако, с нашей точки зрения, предпочтение следует отдать антигену Ki-67, который, хотя и подобно Surf-6, отсутствовал в интактных, а выявлялся только в пролиферирующих клетках по наличию в них светящихся фокусов, но в отличие от SURF-6 имеет наибольшее распространение во всем мире, применяясь в клинико-лабораторной практике в качестве стандартного маркера пролиферации в свежевыделенных клетках (особенно при злокачественных заболеваниях) с диагностической целью в общепринятых для иммунодиагностики панелях МКА с использованием стандартных коммерческих МКА (фирмы DAKO , Sigma и др.).

Белок Ki-67 был открыт в 1983 году (Gerdes J et al., hit J Cancer., 1983 Jan, 15;31(1):p.13-20), которые показали, что он отсутствует в ядрах интактных лимфоцитов, находящихся в G₀ периоде, а появляется в ядре и ядрышках клеток в позднем G1, а в основном в S-периоде клеточного цикла, присутствуя в G2 и М-периодах. В связи с этим показателем пролиферативной активности клеток принято считать количество клеток, экспрессирующих этот антиген, выявляемый с помощью МКА к Ki-67.

В качестве аналогов использования МКА к Ki-67 в иммуноцитохимических реакциях можно, помимо вышеназванных, привести достаточно много работ, посвященных изучению пролиферативной активности интактных (свежевыделенных) клеток у больных с различными заболеваниями, что показало их высокую диагностическую и прогностическую значимость при лимфопролиферативных, онкологических и гематологических заболеваниях (Булычева Т.И. и др. Патент РФ на изобретение № 2310201 от 10.11.2007.; Малышева М.В. и др. Клиническая лабораторная диагностика, № 12, с.23-27; Самойлова и др. Клин. лаб. диагн., 2003, 11, 35-39; Beresford et al., Breast Cancer Res. 2006; 8(6): 216; Endl et al., Exp.Cell Res. 2000; 257(2): 231-237; Gerlach С.et al. Hepatology. 1997.26(3), 573-578; Grisendy S et al. 2006, Nature, Rev., 6 493-505; Hadar et al., Pathol. Oncol. Res., 2005;11(1):45-49; Gerdes J et al. J Clin Pathol. 1986 Sep;39(9):977-80; Giangaspero F et al. Acta Neuropathol. 1987;74(2):179-82; MacCallum et al., Exp. Cell Res. 1999; 252(1):186-198; Martinez J.C et al. J.Pathol. 1993. 169(4), 405-412; Sanchez-Beato M. et al. Br.J.Cancer, 1996, 74 (7), 1956-1062; Stuart-Harris et al., Breast., 2008, 17(4):323-334; Urruticoechea et al., J. Clin. Oncol. 2005, 1;23(28):7212-7220; и др.). Кроме того, антиген Ki-67 как антиген пролиферирующих клеток используется в качестве контроля для сравнения с вновь открытыми антигенами, предположительно ассоциированными с пролиферацией, что было использовано в опубликованных нами вышеназванных работах. При этом значительное число работ касается использования МКА к Ki-67 для идентификации стадий клеточного цикла или изменению синтеза этого антигена в процессе ФГА-стимуляции под действием ингибиторов или стимуляторов клеточного цикла (Булычева Т.И. и др. Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), 944-954; 13; Григорьев А.А. автореферат канд. дис., М., 2008; Григорьев А.А. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007 № 9, т.144, стр 321-325; Малышева М.В. Иммунология 2010, № 1, с.13-17; Baish G. Et al. Cell tissue Kinet 20:387-391, 1987; Dergunova N.N. et al, Immunology Letters, 2002, 83, 67-72; Lopez F et al, Cytometry, 1991;12(1):42-49; Sasaki K. et al. J Cell Physiol. 1987 Dec;133(3):579-84 и др.). Однако в этих работах антиген Ki-67 не рассматривается в качестве маркера реакции РБТЛ, а его экспрессия не используется для оценки функционального состояния лимфоцитов как показателя клеточного иммунитета.

Наиболее близким прототипом данного способа можно считать опубликованные нами работы по использованию в реакции непрямой иммунофлюоресценции МКА к антигенам, ассоциированным с пролиферацией (В23, A3 и Surf-6), где в качестве контроля за состоянием пролиферативной активности клеток используются МКА к Ki-67 с параллельным включением метки ³Н-тимидина в лимфоциты на все сроках стимуляции их к пролиферации с помощью ФГА (см. таблицу) (Артеменко Е.Г. автореферат канд. дис., Москва, 2004; Булычева Т.И. и др. Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), 944-954); Dergunova N.N. et al., Immunology Letters, 2002, 83, 67-72 и др.). Однако и в этих работах степень экспрессии антигенов рассматривается только в плане их изменения в клеточном цикле для отнесения выявленных антигенов к числу антигенов пролиферации, т.е. для характеристики новых ядерных антигенов.

Таким образом, ни в одной из работ экспрессия антигена Ki-67 при пролиферации, искусственно вызванной ФГА-стимуляцией, не используется для оценки функциональных способностей лимфоцитов, отражающих показатель клеточного звена иммунитета при исследованиях иммунного статуса человека, а тем более для оценки состояния лимфоцитов в РБТЛ.

Предлагаемый способ заключается в применении для оценки функционального состояния лимфоцитов общепринятой реакции бласттрансформации (РБТЛ), но вместо используемой в конце реакции радиоактивной метки ( ³Н-тимидина) применяются МКА к ядерному антигену Ki-67, ассоциированному с пролиферативным состоянием клеток, выявляемому в реакции непрямой иммунофлюоресценции по визуальному (в люминесцентном микроскопе) подсчету клеток, экспрессирующих данный антиген в виде светящихся фокусов, появляющихся в ядре после 72 часовой инкубации лимфоцитов с ФГА. Способ предполагает использование известного метода (3-суточной ФГА стимуляции лимфоцитов) по новому назначению: определению функционального состояния лимфоцитов по их пролиферативной активности как показателя клеточного иммунитета человека.

Способ иммуноцитохимической оценки реакции ФГА стимуляции лимфоцитов с МКА к Ki-67 в непрямом методе иммунофлюоресценции осуществляют следующим образом.

1 этап. Выделение лимфоцитов из периферической крови обследуемых лиц.

Лимфоциты выделяют из венозной крови с помощью градиентного центрифугирования на фиколле (d=1,077 г/см³, Pharmacia, Швеция), дважды промывают средой RPMI 1640 и помещали в среду RPMI 1640, содержащую 10% пуловой сыворотки человека АВ (IY) группы, 1% 0.01 М буфера HEPES, 1% глутамина и гентамицина. В полученной взвеси подсчитывают общее количество лимфоцитов в камере Горяева для последующего исследования и культивирования с ФГА. Вся работа по выделению и культивированию лимфоцитов проводится в стерильных условиях.

II этап. Стимуляция лимфоцитов пролиферации.

Для стимуляции лимфоцитов к пролиферации к взвеси лимфоцитов добавляют ФГА (Difco, США) до конечной концентрации 25 мкг/мл и разливают в 96-луночные культуральные платы из расчета 1×10 ⁹ лимфоцитов в 1 мл среды для последующего культивирования. Культивирование лимфоцитов проводят в течение 72 часов (3-х суток) в среде, содержащей 10% пуловой сыворотки человека АВ (IY) группы, 1% 0.01 М буфера HEPES, 1% глутамина и гентамицина в СО₂ инкубаторе при 37°С. После истечения срока икубации с ФГА проводят иммуноцитохимическое исследование лимфоцитов. В качестве контроля исследуют свежевыделенные лимфоциты, полученные до начала инкубации с ФГА (интактные лимфоциты).

III этап. Иммуноцитохимическое исследование интактных или ФГА стимулированных лимфоцитов в реакции непрямой иммунофлюоресценции с МКА Ki-67.

Отмытую от сыворотки или культуральной среды суспензию лимфоцитов раскапывают на стекла с лунками, предварительно обработанными 0,1% поли-L-лизином (Serva, Германия), инкубируя в течение 30 мин во влажной камере. За счет этого достигается прочное прикрепление клеток к поверхности стекла. Для получения наилучшей визуализации используется фиксация абсолютным ацетоном 10 мин при -20°С. После фиксации клетки отмывают в фосфатном буфере (PBS) 3 раза по 5 мин и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре во влажной камере со следующими реагентами:

- PBS (в качестве отрицательного контроля)

- МКА к Ki-67 (Sigma, США) - в разведении 1:20,

PBS используют в качестве контроля для исключения прямого иммуномечения (окрашивания) клеток вторичными антителами.

После отмывания в трех сменах PBS по 10 мин для люминесцентного окрашивания результатов реакции клетки инкубируют с вторичными антителами: козьей сывороткой против иммуноглобулинов мыши, меченной ФИТЦ (Сорбент, Россия), в разведении 1:80 при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации с вторичными антителами клетки отмывают в трех сменах PBS по 10 мин при тех же условиях. После отмывания клетки заключают в мовиол (Calbiochem, Швейцария) или 50% глицерин.

Полученные препараты изучают с помощью люминесцентного микроскопа (в наших исследованиях - Axiophot , Carl Zeiss, Германия), используя объективы х100/1,3 и окуляры х10 с подсчетом количества клеток, имеющих светящиеся фокусы в области ядра с предварительной оценкой в фазово-контрастной микроскопии (см. рис.1 «Экспрессия антигена Ki-67 в лимфоцитах крови здорового человека до и после стимуляции их к пролиферации с помощью ФГА»). Захват изображения производился с помощью цифровой камеры Delta Pix, что не является обязательным условием в оценке реакции.

Итак, результат реакции выражают в количестве клеток, окрашенных МКА к Ki-67 в виде светящихся фокусов в области ядра, исследованных после 72 часов инкубации их с ФГА. Исследование 12 образцов лимфоцитов, выделенных из крови доноров, после ФГА стимуляции составило в среднем 74% (от 49% до 78%) Ki-67 положительных клеток при отсутствии свечения в интактных лимфоцитах ( 1% Ki-67 положительных клеток), что соответствует показателям функциональной активности лимфоцитов у практически здоровых лиц.

Пример 1

На станцию переливания крови ГНЦ обратилась гр-ка Н., 26 лет, с желанием стать донором. Астеническое состояние девушки вызвало сомнение, хотя в показателях крови не было выявлено существенных отклонений. Было решено проверить ее иммунный статус, в т.ч. функциональную способность лимфоцитов при их ФГА стимуляции с помощью МКА к Ki-67. Оказалось, что после 72 часового культивирования лимфоцитов с ФГА появилось лишь 23% светящихся (Ki-67 положительных клеток), что свидетельствовало о резком нарушении иммунитета; сниженными оказались и другие показатели иммунного статуса. Девушке был дан отвод от донорства, назначена иммунокоррегирующая терапия.

Пример 2

В клинику ГНЦ поступил иногородний больной с предварительным диагнозом: лимфопролиферативное заболевание, двусторонняя пневмония. При иммунофенотипировании выявлено резкое снижение CD4 лимфоцитов, а при оценке функционального состояния лимфоцитов обнаружен очень низкий показатель после их ФГА стимуляции - лишь 13% светящихся клеток, что свидетельствовало о резком иммунодефиците. Одновременно проведенные серологические и вирусологические исследования подтвердили наличие у больного синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) с ВИЧ-позитивным антигеном.

Пример 3

Больной Д., 38 лет, с диагнозом: острый лейкоз, готовился к трансплантации костного мозга. Донором должен был стать его брат. Для этого была поставлена проба на совместимость между братьями в смешанной культуре лимфоцитов (MLC) с ³ Н-тимидином, используемая обычно при подборе доноров, в которой стимуляция лимфоцитов на ФГА является одним из положительных контролей. Оказалось, что лимфоциты брата после 72 часовой стимуляции ФГА очень слабо включили ³Н-тимидин (12,3×10 ³ имп/мин), что свидетельствовало о снижении функциональной активности его лимфоцитов (т.е иммунной недостаточности). Более того, это не позволяло проводить достоверный учет реакции MLC, которая учитывается лишь через 6 суток культивирования клеток. Параллельно проведенное иммуноцитохимическое исследование ФГА-стимулированных лимфоцитов брата также показало сниженное количество Ki-67 положительных клеток (21%), что также указывало на нарушение иммунного статуса у брата, которое было выявлено до результатов с включением радиоактивной метки ³Н-тимидина. Оказалось, что такое состояние у брата больного было вызвано недавно перенесенной тяжелой пневмонией (о чем он не сообщил доктору). Из-за снижения показателей иммунитета у брата операция по трансплантации костного мозга больному брата была отложена.

Пример 4

Под контролем иммунного статуса после трансплантации костного мозга находился больной Р. с диагнозом: с острый лейкоз, ремиссия. При очередном обследовании наряду с иммунофенотипированием было проверено функциональное состояние лимфоцитов по ответу на ФГА-стимуляцию как по экспрессии Ki-67, так и по включению ³Н-тимидина. Однако в тот же день среди свежевыделенных клеток ( лимфоцитов ), которые проверяются в иммуноцитохимической реакции до внесения ФГА, было выявлено 73% светящихся с Ki-67 (т.е пролиферирующих) клеток, чего не должно быть до начала стимуляции их с ФГА. Параллельно проведенное иммунофенотипирование выявило наличие на клетках антигена CD34, что подтвердило бластную природу этих клеток, свидетельствующую о наступлении рецидива острого лейкоза. В этом случае ставить 3-суточную реакцию ФГА стимуляции не имело смысла. Больному была срочно назначена специфическая химиотерапия. Таким образом, контрольная постановка иммуноцитохимической реакции с Ki-67 до внесения ФГА в свежевыделенные клетки позволило обнаружить прогрессирование опухолевого (лейкозного) процесса по наличию большого количества Ki-67 позитивных клеток, подтвержденное данными фенотипирования. В этом случае с помощью иммуноцитохимических методов рецидив острого лейкоза был выявлен до клинико-морфологических данных, а тем более до учета реакции с ³Н тимидином, которое произошло бы только через 3 суток, которые были бы потеряны для своевременного лечения.

Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют о высокой информативности предлагаемого способа оценки функционального состояния лимфоцитов по имуноцитохимическому маркеру, т.е. по наличию Ki-67 положительных клеток после 3-суточной стимуляции их ФГА, а также при иммуноцитохимическом исследовании лимфоцитов до начала стимуляции, что обычно не проводится в этой реакции при ее оценке по включению радиоактивного ³ H-тимидина.

Итак, использование в заявленном способе иммуноцитохимического окрашивания результатов реакции с МКА к Ki-67 вместо применения ³H-тимидина позволяет не только достоверно оценить пролиферацию лимфоцитов на ФГА-стимуляцию по количеству светящихся клеток в люминесцентном микроскопе, но и упростить методику, сделав ее более доступной и безопасной, исключив радиоактивную метку, благодаря чему расширить область применения метода при оценке иммунного статуса человека.

Заявленный способ иммуноцитохимической оценки ФГА стимуляции лимфоцитов по экспрессии антигена Ki-67 имеет следующие преимущества перед оценкой РБТЛ по включению в клетки ³Н-тимидина:

1) Более информативен, так как благодаря визуальной оценке в люминесцентном микроскопе позволяет четко различать по экспрессии Ki-67 каждую клетку: как интактные лимфоциты, находящиеся в фазе G₀ клеточного цикла, так и пролиферирующие (светящиеся) клетки, находящиеся в S-фазе клеточного цикла при одновременной оценке морфологических параметров клеток при фазово-контрастной микроскопии.

2) Объективен в отличие от морфологического метода, так как позволяет по наличию светящейся метки (Ki-67 антигена) в люминесцентном микроскопе точно просчитать количество ответивших на ФГА стимуляцию пролиферирующих клеток.

3) Безопасен, доступен и более экономичный для лабораторий, проводящих иммунофенотипирование с использованием диагностического набора МКА, включающего Ki-67 в качестве антигена пролиферирующих клеток при иммунодиагностике различных гематологических и онкологических заболеваний, т.к. не требует закупки дорогостоящего оборудования (сцинтилляционного -счетчика радиоактивности, харвестера и др.) и реагентов в отличие от радиометрического способа учета реакции по включению радиоактивного изотопа ³Н-тимидина, на работу с которым необходимо получать специальное разрешение.

4) Исследование образцов лимфоцитов с Ki-67 до начала их стимуляции с ФГА позволяет проводить раннюю диагностику онкогематологических заболеваний по наличию в их крови без стимуляции увеличенного количества пролиферирующих клеток (при использовании ³ Н-тимидина оценка нестимулированных и стимулированных ФГА лимфоцитов проводится только через 3 суток).

5) Для расширения контингента лиц, обследуемых на определение иммунного статуса, и автоматизации учета реакции по экспрессии Ki-67 при ФГА стимуляции лимфоцитов оценка реакции может также проводиться на проточном цитофлюориметре по стандартной методике.

Иммуноцитохимический способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их фитогемагглютинином (ФГА).

Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Григорьев А.А.

Подписи к рисунку 1.

Экспрессия антигена Ki-67 в лимфоцитах крови здорового человека до и после стимуляции их пролиферации с помощью ФГА.

1. До стимуляции ФГА (свежевыделенные лимфоциты)

а) реакция непрямой иммунофлюоресценции лимфоцитов с МКА к Ki-67

а') фазовый контраст этих же лимфоцитов

2. Через 72 часа после инкубации лимфоцитов с ФГА

б) реакция непрямой иммунофлюоресценции клеток с МКА к Ki-67

б') фазовый контраст этих же клеток

а и б - реакция иммунофлюоресценции

а и б'-фазово-контрастная микроскопия

Источник информации

1. Артеменко Е.Г. «Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител», автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологический наук, Москва, 2004.

2. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник О.А., Шпакова А.П., Малашенко О.С, Зацепина О.В. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину». Цитология, 2000, № 3, т.42 (10), 944-954.

3. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Калинина И.А., Дейнеко Н.Л., Карасева О.В., Зацепина О.В. Новые моноклональные антитела к антигену клеточной пролиферации - ядрышковому белку В23/нуклеофозмину. Проблемы гематологии и переливание крови, 2003, № 2, стр.34-35.

4. Булычева Т.И., Григорьев А.А., Дейнеко Н.Л. «Способ иммуноцитохимической оценки пролиферации лимфоцитов человека с помощью нового маркера - ядрышкового белка A3», Патент на изобретение РФ № 2431670 от 20 октября 2011 г.

5. Булычева Т.И., Григорьев А.А., Зацепина О.В. Иммуноцитохимическое изучение природы ядрышкового белка, выявляемого новыми МКА A3. Иммунология, 2009, № 5, стр.287-289.

6. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л, Самойлова Р.С., Артеменко Е.Г., Зацепина О.В. Способ прогнозирования прогрессирования хронического лимфолейкоза. Патент РФ на изобретение № 2310201 от 10.11.2007.

7. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. «Способ иммуноцитохимической оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии С-концевого фрагмента белка В23/нуклеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции» Патент на изобретение № 2438135 от 27 декабря 2011 г.

8. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко Е.Г., Самойлова Р.С. «Диагностическое значение ядрышкового белка В23/-нуклеофозмина при хронических лимфопролиферативных заболеваниях», «Terra Medica», Лабораторная диагностика, № 2 (10) 2006, стр.16-21. 3б.

9. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Вольпина О.М., Владимирова Н.М. «Иммуноцитохимическая визуализация мономерных и олигомерных форм ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в лимфоцитах человека в процессе пролиферации». Иммунология, 2011, № 5 с.231-236.

10. Булычева Т.И, Калинина И.А, Григорьев А.А, Зацепина О.В. Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы A3, используемый для получения моноклональных антител к антигену ядрышек клеток человека. ГНЦ РАМН, Патент на изобретение, № 2296159 от 27.03.2007.

11. Булычева Т.И., Шпакова А.П., Дронова В.М., Саркисян Г.П., Любимова Л.С., Менделеева Л.П. Особенности иммунной системы у больных лейкозами после трансплантации аллогенного костного мозга, Иммунология 2000, № 5, с.46-52.

12. Вершигора А.Е. «Основы иммунологии», Киев, «Вища школа», 1975, с.238.

13. Григорьев А.А. Характеристика ядрышкового антигена клеток человека, выявляемого новым моноклональным антителом, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2008.

14. Григорьев А.А., Жарская О.О., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Изменения состояния ядрышка при длительном культивировании культуры клеток человека HeLa. , Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, № 9, т.144, стр.321-325.

15. Дергунова Н.Н., Шпакова А.П., Гемждан Э.Г., Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. Митогенное и токсическое действие фитогемагглютинина на лимфоциты периферической крови в культуре. Иммунология, 2003, том 24, № 4. С.205-208.

16. Драник Г.Н. «Клиническая иммунология и аллергология», Медицинское информационное агентство, М., 2003 г., с.180.

17. Иммунологические методы , под редакцией Фримеля X, М., «Мир», 1987, с.294.

18. Клиническая иммунология и аллергология под редакцией Л.Иогера, М. «Медицина», т.1, с.87.

19. Лебедев К.А., Понякина И.Д. «Иммунная недостаточность» М., «Медицинская книга», 2003 г., с.146

20. Лимфоциты, методы под редакцией Клаус Дж., М., «Мир», 1990, с.292

21. Малашенко О.С., Булычева Т.И., Дудник О.А. «Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы, используемый для получения моноклональных антител к ядрышковому антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией.» Патент РФ № 2145634 от 20.02.2000.

22. Малышева М.В. Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши. автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологический наук, Москва, 2010.

23. Малышева М.В., Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Самойлова Р.С., Капланская И.Б., Магоулас X., Зацепина О.В. Содержание ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках здоровых лиц и больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Клиническая лабораторная диагностика, 2010, № 12, с.35-39.

24. Малышева М.В., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Зацепина О.В. и др. «Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro», Иммунология 2010, № 1, Т.31, с.13-17

25. Новиков Д.К., Новикова В.И. «Оценка иммунного статуса», М., «Медицина», 1995, с.23.

26. Петров Р.В. «Иммунология», М., «Медицина», 1987, с.175

27. Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфоидных заболеваний. Клиническая лабораторная диагностика, 2003, 11, 35-39.

28. Шабалин В.Н., Серова Л.Д. «Клиническая иммунология», Л., Медицина, 1988, стр.192, 209.

29. Яздовский В.В., Дмитриева Н.Г., Алексеев Л.П. Динамика пролиферативного ответа лимфоцитов на митогенные лектины и анти CD3 антитела в культурах цельной крови и выделенных клеток у здоровых людей. Иммунология, 1994, № 5, с.21-24.

30. Ashwood P, Krakowiak P, Hertz-Picciotto I, Hansen R, Pessah IN, Van de Water J. Altered Т cell responses in children with autism. Brain Behav Immun. 2011 Jul;25(5):840-849.

31. Baish G., Gerdes J.Simultaneous staining of exponentially growing versus plateu phase cells with the proliferation associated antibody Ki 67 and propidium iodide: Analysis by flow cytometry. Cell tissue Kinet 20:387-391, 1987.

32. Beresford MJ, Wilson GD, Makris A. Measuring proliferation in breast cancer: practicalities and applications. Breast Cancer Res. 2006;8(6):216.

33. Chien CH, Lai JN, Liao CF, Wang OY, Lu LM, Huang MI, Lee WF, Shie MC, Chien EJ. Mifepristone acts as progesterone antagonist of non-genomic responses but inhibits phytohemagglutinin-induced proliferation in human Т cells. Hum Reprod. 2009 Aug; 24(8):1968-1975.

34. Dabrowski MP, Stankiewicz W, Plusa T, Chcialowski A, Szmigielski S. Competition of IL-1 and IL-1ra determines lymphocyte response to delayed stimulation with PHA. Mediators Inflamm. 2001 Jun; 10(3):101-107.

35. Deniz G, Erten G, Kücüksezer UC, Kocacik D, Karagiannidis C, Aktas E, Akdis CA, Akdis M. Regulatory NK cells suppress antigen-specific Т cell responses. J Immunol. 2008 Jan 15;180(2):850-857.

36. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G., Dudnik O.A., Zatsepina O.V., Malashenko O.S.. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunology Letters, 2002, 83, 67-72.

37. Duarte RF, Chen FE, Lowdell MW, Potter MN, Lamana ML, Prentice HG, Madrigal JA. Functional impairment of human T-lymphocytes following PHA-induced expansion and retroviral transduction: implications for gene therapy. Gene Ther. 2002 Oct;9(20):1359-1368.

38. Ebert EC. Activation of human intraepithelial lymphocytes reduces CD3 expression. Clin Exp Immunol. 2003 Jun;132(3):424-429.

39. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. // Exp. Cell Res. 2000; 257(2):231-237.

40. Gerdes J, Lelle RJ, Pickartz H, Heidenreich W, Schwarting R, Kurtsiefer L, Stauch G, Stein H. Growth fractions in breast cancers determined in situ with monoclonal antibody Ki-67. J Clin Pathol. 1986 Sep;39(9):977-80.

41. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer., 1983 Jan, 15;31(1):13-20.

42. Gerlach C., Sakkab D.Y., Schlozen Т et al. Ki-67 expression during rat liver regeneration after partial hepactomy. Hepatology. 1997.26(3), 573-578.

43. Giangaspero F, Doglioni C, Rivano MT, Pileri S, Gerdes J, Stein H. Growth fraction in human brain tumors defined by the monoclonal antibody Ki-67. Acta Neuropathol. 1987;74(2):179-82.

44. Grisendy S., Meccuci C., Falini B. et al. «Nucleophosmin and cancer», 2006, Nature, Rev., 6493-505.

45. Hadar T, Shvero J, Yaniv E, Ram E, Shvili I, Koren R. Expression of p53, Ki-67 and Bcl-2 in parathyroid adenoma and residual normal tissue. Pathol Oncol Res. 2005;11(1):45-49.

46. Hainaut M, Verscheure V, Ducarme M, Schandene L, Levy J, Mascart F. Cellular immune responses in human immunodeficiency virus (HIV)-1-infected children: is immune restoration by highly active anti-retro viral therapy comparable to non-progression? Clin Exp Immunol., 2011 Jul;165(1):77-84.

47. Hugenford H.Amer.J.Hum. Genet, 1959, 11, 215.

48. Lelle R.J. In situ determination of the Ki-67 growth fraction (Ki-67 GF) in human tumors (studies in breast cancer). Acta Histochemica / Supplementband, 1990, 39:109-124.

49. Lopez F, Belloc F, Lacombe F, Dumain P, Reiffers J, Bernard P, Boisseau MR. Modalities of synthesis of Ki67 antigen during the stimulation of lymphocytes. Cytometry, 1991;12(1):42-49.

50. MacCallum D.E., Hall P.A. Biochemical characterization of pKi67 with the identification of a mitotic-specific form associated with hyperphosphorylation and altered DNA binding. // Exp. Cell Res., 1999; 252(1):186-198.

51. Martinez J.C., Piris M.A., Sanchez-Beato M. et al. Retinoblastoma (Rb) gene product expression in lymphomas. Correlation with Ki-67 growth fraction.J.Pathol. 1993. 169(4), 405-412.

52. Nowell P.C.Cancer Res., 1960, 20, 462.

53. Sanchez-Beato M., Martinez-Montero J.C., Doussis-Anagnostopoulou T.A. et al. Anomolous retinoblastoma protein expression in Stemberg-Reed cells in Hodgkin's disease: a comparative study with p53 and Ki67 expression. Br.J.Cancer, 1996, 74 (7), 1956-1062.

54. Sasaki К, Murakami Т, Kawasaki M, Takahashi M. The cell cycle associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol. 1987 Dec;133(3):579-84.

55. Stuart-Harris R, Caldas C, Pinder SE, Pharoah P. Proliferation markers and survival in early breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32,825 patients. Breast. 2008 Aug;17(4):323-34.

56. Szyllo K, Tchorzewski H, Banasik M, Glowacka E, Lewkowicz P, Kamer-Bartosinska A. The involvement of Т lymphocytes in the pathogenesis of endometriotic tissues overgrowth in women with endometriosis. Mediators Inflamm. 2003 Jun;12(3):131-138.

57. Urruticoechea A., Smith I.E., Dowsett M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J Clin Oncol. 2005 Oct 1;23(28):7212-20.

58. Ustun S, Turgay N, Delibas SB, Ertabaklar H. Interleukin (IL) 5 levels and eosinophilia in patients with intestinal parasitic diseases. World J Gastroenterol. 2004 Dec 15;10(24):3643-3646.

59. Yang ZZ, Novak AJ, Stenson MJ, Witzig ТЕ, Ansell SM. Intratumoral CD4+CD25+regulatory T-cell-mediated suppression of infiltrating CD4+Т cells in B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood. 2006 May 1;107(9):3639-46.

60. Yoon SC, Kwon YA, Kim H, Kim S, Ahn Jo S, Kim DK. Altered cell viability and proliferation activity of peripheral lymphocytes in patients with Alzheimer's disease. Psychiatry Investig. 2010 Mar;7(1):68-71.

Средние данные по экспрессии в клетках ядерных антигенов и по включению 3Н-тимидина в процессе ФГА стимуляции лимфоцитов.
Время инкубации С ФГА (в часах)	Ki-67	В23	A3	Surf-6	Включение 3 Н тимидина
	Количество Ki-67+клеток (в %)	Количество В23+клеток (в %)	Количество A3+фокусов в клетках (вед)	Количество Surf-6+клеток(в %)	Количество имп/мин (в103)	ИС* (ФГА+/ФГА-)
0	0	65	1	0	0,498	-
24	5	70	2-4	32	1,7	2,4
48	45	75	5-7	54	25,2	54,7
72	74	85	8-10	100	28,7	55,2
*- индекс стимуляции равен количеству имп/мин с ФГА/имп/мин без ФГА