тест-система для полуколичественного иммунохроматографического анализа

Формула изобретения

Тест-система для полуколичественного иммунохроматографического анализа, состоящая из пластиковой подложки, на поверхности которой путем ламинирования внахлестку расположены мембрана для нанесения исследуемого образца, мембрана для конъюгата наночастиц золота со специфическими первыми моноклональными антителами против определяемого соединения, аналитическая мембрана и отсасывающая мембрана, отличающаяся тем, что на аналитической мембране в поперечном направлении сформировано от 2 до 10 дискретных параллельных тестовых линий путем предварительного нанесения на мембрану растворов вторых специфических моноклональных антител против определяемого соединения, причем концентрация антител последовательно возрастает от линии к линии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического определения с использованием в качестве маркера золотых наночастиц и может быть использовано в биотехнологии и медицинской диагностики для полуколичественного визуального определения поливалентных антигенов, в том числе белков, с чувствительностью, достигаемой известными методами твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

В течение последнего десятилетия получили развитие так называемые «быстрые методы» проведения анализа различных соединений с визуальной регистрацией результатов, которые уже нашли широкое использование в медицинской диагностике, фармацевтической и пищевой промышленности, охране окружающей среды, ветеринарии и других областях (R.C. Wang, H.Y. Tse, Eds., Lateral Flow Immunoassay, Springer, 2009). Методы основаны на использовании специальных мембранных носителей с заранее импрегнированными в них реакционными компонентами, позволяющими определять анализируемое соединение по окрашиванию линии в тестовой зоне устройства. Наиболее распространенным вариантом является иммунохроматографический метод, основанный на связывании определяемого антигена специфическими антителами в тестовой области аналитической мембраны с использованием в качестве визуальной метки образующегося иммунокомплекса окрашенных в розовый цвет частиц коллоидного золота (Posthuma-Trumpie G.A., Jakob Korf J, Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem, 2009, vol.393, pp.569-582)

На фиг.1. приведена схема тест-системы для иммунохроматографического определения антигенов по сэндвич-схеме иммуноанализа (см., например, патент США № 5712172, МПК G01N/533, опубл. 27.12.1997 - прототип).

Основой устройства является тест-полоска, состоящая из нескольких ламинированных на пластиковой подложке 1 примыкающих друг к другу мембран, по которым движется поток жидкости, содержащей анализируемый образец 2. На стекловолоконной мембране 6 содержится конъюгат наночастиц золота со специфическими первыми моноклональными антителами к определяемому антигену. На аналитической мембране 3 в виде узкой линии в тестовой зоне 4 нанесены вторые специфические моноклональные антитела к определяемому антигену и в аналогичной контрольной зоне 5 - вторичные (антивидовые) антитела против первых специфических моноклональных антител. При нанесении образца 2 на специальную мембрану 7 для образца, расположенную у начала тест - полоски, начинается его движение вдоль полоски под действием капиллярных сил. В присутствии определяемого антигена в образце, по мере продвижения вдоль мембраны происходит его взаимодействие с конъюгатом меченых золотом первых моноклональных антител и образование комплекса антигена с сорбированными на поверхности коллоидных частиц золота специфическими первыми моноклональными антителами. В тестовой зоне 3 происходит связывание иммунокомплекса иммобилизованными специфическими вторыми моноклональными антителами и наблюдается появление окрашенной линии, интенсивность окраски которой пропорциональна содержанию анализируемого вещества в образце. Избыток несвязавшихся меченых антител проходит далее к контрольной зоне 8, где образуется вторая окрашенная линия. При отсутствии в исследуемом образце определяемого антигена, меченные золотом антитела задерживаются лишь вторичными антителами в области контрольной линии 8. Таким образом, наличие видимой окраски в контрольной зоне в обоих случаях свидетельствует о работоспособности теста. Расположение дополнительной впитывающей мембраны 9 на конце тест - полоски позволяет осуществлять более равномерное и продолжительное движение образца вдоль полоски.

В этой связи рассмотренное в прототипе устройство и метод визуального анализа является качественным, позволяющим на основании появления или отсутствия тестовой полосы по принципу «да-нет» говорить о наличии или отсутствии определяемого соединения в анализируемом растворе. Появление окрашенной линии в тестовой зоне свидетельствует о превышении некоторого порогового уровня концентрации антигена в анализируемом растворе. Наилучшие достоверные результаты получают для тех антигенов, для которых наблюдается значительное превышение некоторой пороговой концентрации (например, в медицинской практике, при определении хорионического гонадотропина человека для ранней диагностики беременности).

Интенсивность окраски тестовой линии зависит от концентрации определяемого в образце антигена, однако определение интенсивности окраски тестовой линии визуальным методом для получения полуколичественных результатов сопряжено с большими ошибками ввиду трудности визуальной сравнительной оценки интенсивности окраски линии со стандартными шаблонами. Количественная оценка может быть достигнута только с использованием специальных фотометрических методик, основанных на отражении или отражательных фотометров, например (патент РФ № 2217755, МПК⁷ G01N 33/53, G01N 21/01, опубликовано: 27.11.2003), что значительно усложняет и удорожает стоимость проводимого анализа.

Задачей настоящего изобретения является создание тест-системы (устройства) для осуществления полуколичественного визуального иммунохроматографического анализа и бесприборной оценки результатов, основанной не на определении интенсивности окрашивания тестовой полосы, а на подсчете числа окрашенных тестовых линий. Схема предлагаемой тест - системы представлена на фиг.2. Задача решается тем, что используют тест-систему для иммунохроматографического анализа, включающую пластиковую подложку 1 с ламинированными на ее поверхности внахлестку (соприкасающимися по концам) мембранами (мембрана для образца 2, мембрана для конъюгата золотых наночастиц с первыми специфическими моноклональными антителами 3, аналитическая мембрана 4 с тестовой 5 и контрольной 6 зонами, отсасывающая мембрана 7), причем на аналитической мембране 4 в тестовой зоне 5 расположено от 2 до 10 поперечных параллельных тестовых линий, образованных путем нанесения на мембрану растворов вторых специфических моноклональных антител против определяемого соединения с концентрацией антител, последовательно увеличивающейся в направлении движения образца жидкости. В конечном участке аналитической мембраны иммобилизуют в виде поперечной контрольной линии 6 антивидовые антитела, которые связывают избыток конъюгата золотых частиц в ходе проведения анализа с образованием окрашенной контрольной линии.

Принцип работы заявляемой тест-системы заключается в следующем. При нанесении образца 8, содержащего определяемый антиген, на мембрану для нанесения образца 2 под действием капиллярных сил раствор анализируемого соединений движется вдоль полоски, взаимодействует с конъюгатом специфических антител с золотыми наночастицами, иммобилизованном в мембране для конъюгата 2, и образующийся иммунокомплекс далее распространяется вдоль аналитической мембраны 4, на которой иммобилизованы вторые специфические антитела в тестовой зоне 5 в виде нескольких линий с последовательно увеличивающейся концентрацией антител. В зависимости от концентрации анализируемого антигена, образующийся иммунокомплекс будет задерживаться различными участками тестовой зоны 5 аналитической мембраны 4: при относительно небольших концентрациях антигена в образце, удерживание иммунокомплекса будет наблюдаться только в удаленных зонах с достаточно высокой концентрацией сорбированных антител, наоборот, при больших концентрациях антигена в образце эффективность связывания в иммунокомплекс и количество проявляемых линий будет увеличиваться и включать начальные зоны с относительно малым содержанием сорбированных на мембране антител. Ввиду того, что золотые наночастицы имеют ярко выраженную розовую окраску, количество окрашенных линий в тестовой зоне мембраны будет пропорционально концентрации определяемого соединения в анализируемом растворе. При достижении контрольной линии 6 избыток конъюгата задерживается на ней, проявляя окраску, свидетельствующую о работоспособности теста. Таким образом количество видимых линий в аналитической зоне будет пропорционально определяемой концентрации анализируемого соединения.

Количество линий с иммобилизованными антителами можно варьировать от двух до 10, тем самым изменяя число диапазонов определяемых концентраций антигена. Количество наносимых линий с увеличивающейся вдоль мембраны концентрацией сорбированных антител может зависеть от требуемого (заданного) числа диапазонов определения анализируемого соединения. При нанесении двух тестовых линий устанавливается три области исследуемых концентраций (низкая, в случае отсутствия окрашивания двух линий, средняя - при наличии окрашивания второй линии и высокая - в случае одновременного окрашивания первой и второй линий). В общем случае при нанесении п тестовых линий количество определяемых диапазонов концентраций составляет (n+1).

Таким образом, основным отличительным существенным признаком изобретения является наличие в тестовой зоне множества линий с сорбированными антителами с градиентным увеличением количества сорбированных антител в направлении движения образца в виде дискретных (неперекрывающихся) линий. Градиентное распределение концентрации сорбированных моноклональных антител на поверхности мембраны (или числа линий с изменяющейся концентрацией антител) можно устанавливать в зависимости от природы анализируемого объекта и необходимого диапазона измеряемых концентраций, а также нижней границы определяемого содержания вещества. В частности, если необходимо получить ответ по принципу «да-нет» (например, в случае анализов на присутствие вирусов, антител, наркотиков, токсикантов, наличие беременности и т.д.) можно в каждом конкретном случае задать такой закон изменения концентрации антител на носителе, согласно которому при окрашивании числа полосок более некоторой критической длины ответ положительный, или наоборот.

Возможность варьирования концентрации сорбированных антител и числа наносимых линий в тестовой зоне позволяет установить взаимозависимость между диапазонами определяемых концентраций и числом окрашенных линий в тестовой зоне.

Совокупность перечисленных отличительных признаков ранее для решения задачи визуального иммунохроматографического анализа не использовалась, и поэтому отвечает критерию существенные отличия.

Пример 1

Получение наночастиц коллоидного золота.

В колбу с магнитной мешалкой добавляют 99 мл бидистиллированной воды и 1 мл 1%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты. Раствор нагревают до кипения, после чего быстро при перемешивании добавляют 1,6 мл 1%-ного водного раствора цитрата натрия. Раствор кипятят еще 15 минут при перемешивании, затем охлаждают в темноте до комнатной температуры.

Получение конъюгата частиц золота с антителами

К 2 мл раствора коллоидного золота добавляют при перемешивании необходимое количество 0,1 М раствора Na₂CO₃ до достижения значения pH=7,0-7,5 (около 20 мкл). Затем по каплям при перемешивании добавляют 200 мкл раствора первых мышиных моноклональных антител против определяемого антигена с концентрацией 15 мг/мл, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 40 минут. Далее добавляют 20%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) до конечной концентрации 0,2%, инкубируют 20 минут и добавляют сахарозу до конечной концентрации 10% и азида натрия до конечной концентрации 0,01%.

Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугируют 30 минут при 10000 об/мин и температуре +4°C. Супернатант удаляют, осадок перерастворяют в требуемом объеме 0,01М фосфатного буфера (ФБ), содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы. Полученный раствор конъюгата коллоидного золота с антителами с оптической плотностью 2 опт.ед. наносят на полоску стекловолоконной мембраны для конъюгата размером 5×260 мм со скоростью 50 мм/сек с помощью автоматического устройства AirJet Quanti 3000 («BioDot», США). Мембрану с нанесенным конъюгатом высушивают в течение 0,5 ч в суховоздушном термостате при температуре 50-60°C и относительной влажности 25-30%.

Получение иммунохроматографического композита для проведения анализа простато-специфического антигена

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану размером 25×260 мм на расстоянии 5 мм от края и на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью автоматического устройства BioJet Quanti 3000 с использованием двух насосов наносят одновременно две тестовые линии со следующими концентрациями специфических вторых мышиных моноклональных антител в 0,01М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР; фосфатный буфер, содержащий 0,14 М NaCl): 1 линия - 0,5 мг/мл; 2 линия - 0,1 мг/мл.

Затем на расстоянии 5 мм от первой линии наносят контрольную линию с раствором аффинно очищенных антивидовых антител овцы против мыши (1 мг/мл в ФСБР). При нанесении линий используют следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000: размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Количество иммобилизуемых антител 1 мкл раствора на 1 см линии.

Мембрану высушивают в течение 2 ч в суховоздушном термостате при температуре 37°C и относительной влажности 25-30%.

С помощью ламинатора на пластиковую подложку с клеящим слоем прикрепляют полоски мембрану для образца, мембрану для конъюгата, нитроцеллюлозную мембрану и отсасывающую мембрану таким образом, чтобы край последующей мембраны перекрывался с краем предыдущей мембраны на 2 мм. После ламинирования мембран проводят ламинирование прозрачной пленкой с нанесенными стрелками, указывающими направление погружения полоски в буферный раствор.

Пластиковую подложку с ламинированными мембранами разрезают с помощью резака на полоски шириной 4 мм. Готовые тест-полоски помещают в пакеты из фольги с силикагелевым осушителем и хранят при температуре 4-20°C.

Проведение анализа общего ПСА в сыворотке крови

Вскрыть упаковку с тест-полосками перед анализом, извлечь необходимое для анализа количество тест-полосок из упаковки. Внести по 150 мкл ФБ в лунки планшета для иммуноферментного анализа. Аккуратно пипеткой нанести 30 мкл анализируемой сыворотки крови на нижний край тест-полоски (на расстоянии 0,5-1,0 см от края, см. фиг.3), осторожно погрузить конец тест-полоски в лунку планшета с буферным раствором (направление погружения в раствор указано стрелками) и включить секундомер. Через 15 мин извлечь тест-полоску из буферного раствора и визуально оценить результат (появление окрашенных в розовый цвет линий).

Если в тестовой зоне наблюдается ярко выраженное окрашивание только одной контрольной линии - концентрация ПСА составляет менее 3 нг/мл (фиг.3а).

Если помимо окрашивания контрольной линии наблюдается заметное окрашивание только одной тестовой линии - концентрация ПСА находится в диапазоне от 3 до 10 нг/мл (рис.3б).

Если помимо контрольной линии наблюдается окрашивание в тестовой зоне двух тестовых линий - концентрация ПСА равна или превышает 10 нг/мл (фиг.3в).

Отсутствие окрашивания контрольной линии (фиг.3г, д, е, ж) свидетельствует о нарушении работы набора и требует проведения повторного анализа с использованием другой тест-полоски. Возможные причины этого - неправильное выполнение процедуры анализа или нарушение условий хранения набора.

Пример 2

Получение наночастиц коллоидного золота и конъюгата частиц золота с антителами

Используют методику приготовления коллоидного золота и его конъюгата со специфическими первыми моноклональными антителами против белка, связывающего жирные кислоты (БСЖК), согласно описанию Примера 1.

Получение иммунохроматографического композита для проведения анализа БСЖК

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану в виде двух тестовых линий на расстоянии 5 мм друг от друга наносят растворы специфических антител в 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) с помощью программируемого автоматического диспенсера BioJet Quanti 3000 для формирования аналитической зоны: 1 линия - 0,5 мг/мл; 2 линия - 0,2 мг/мл. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической зоны наносяти раствор аффинно очищенных антивидовых антител овцы против мыши с концентрацией 1 мг/мл. Используют следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000 для нанесения образцов: размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Высушивание полосок проводили в течение 24 ч при +37°С. Ламинирование осуществляют согласно описанию Примера 1.

Проведение иммунохроматографического анализа БСЖК

Предварительно на мембрану для нанесения образца каждой тест-полоски наносят по 30 мкл анализируемых образцов сывороток крови. Далее готовые полоски с нанесенным исследуемым образцом вертикально помещают в лунки микропланшета для иммуноферментного анализа со 150 мкл 0,01 М ФСБР, содержащего 0,1% твин-20. Через 15 минут тест-полоски помещают на горизонтальную поверхность и визуально оценивают результат (появление окрашенных в розовый цвет линий).

Интерпретация результатов

При концентрации БСЖК в исследуемом образце менее 2 нг/мл наблюдается появление только одной окрашенной контрольной линии. Появление только одной тестовой линии в аналитической зоне соответствует концентрации БСЖК от 2 нг/мл до 15 нг/мл. Дополнительное появление второй тестовой линии в аналитической зоне наблюдается при концентрации БСЖК в образце >15 нг/мл, что является положительным результатом и свидетельствует о превышении диагностического уровня некроза миокарда.

Пример 3

Получение наночастиц коллоидного золота и конъюгата частиц золота с антителами

Используют методику приготовления коллоидного золота и его конъюгата со специфическими первыми моноклональными антителами против IgE человека, согласно описанию Примера 1.

Получение иммунохроматографического композита

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану размером 25×260 мм на расстоянии 5 мм от края и на расстоянии 2 мм друг от друга с помощью автоматического устройства BioJet Quanti 3000 наносят пять тестовых линий со следующими концентрациями специфических вторых мышиных моноклональных антител в 0,01М ФСБР: 1 линия - 1 мг/мл; 2 линия - 0,5 мг/мл; 3 линия - 0,25 мг/мл; 4 линия - 0,1 мг/мл; 5 линия - 0,05 мг/мл.

Затем на расстоянии 5 мм от первой линии наносят контрольную линию с раствором аффинно очищенных антивидовых антител овцы против мыши (1 мг/мл в ФСБР). При нанесении линий используют следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000: размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Количество иммобилизуемых антител 1 мкл раствора на 1 см линии.

Мембрану высушивают в течение 2 ч в суховоздушном термостате при температуре 37°C и относительной влажности 25-30%.

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану наносят раствор специфических вторых моноклональных антител против IgE человека в 0,01 М ФСБР с помощью программируемого автоматического диспенсера BioJet Quanti 3000 для формирования аналитической зоны. Используют следующие параметры насоса для нанесения образцов; размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Концентрации специфических антител против IgE человека в растворах составляли, соответственно: 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 4 мм от аналитической зоны наносят раствор аффинно-очищенных антивидовых антител овцы против мыши с концентрацией 1 мг/мл. Высушивание полосок проводят в течение 1 ч при +37°C.

Ламинирование осуществляют согласно описанию Примера 1.

Проведение иммунохроматографического анализа общего IgE человека

Предварительно на мембрану для нанесения образца каждой тест-полоски наносят по 30 мкл стандартных растворов IgE, а затем анализируемых образцов сывороток крови. Далее готовые полоски с нанесенным исследуемым образцом вертикально помещают в лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа со 150 мкл ФСБР. Через 15 минут тест-полоски кладут на горизонтальную поверхность и высушивают. Проводят визуальное определение результатов анализа путем подсчета числа видимых линий в тестовой зоне аналитической мембраны и сравнение полученных результатов со стандартными значениями концентраций IgE (см. Табл.1).

Таблица 1.
Зависимость числа окрашенных линий в аналитической зоне от концентрации IgE в сыворотке крови
Концентрация IgE в сыворотке	Число окрашенных линий в аналитической зоне	Общее число окрашенных линий в аналитической зоне и контрольной зонах
<5 МЕ/мл	0	1
5-20 МЕ/мл	1	2
20-80 МЕ/мл	2	3
80-300 МЕ/мл	3	4
300-500 МЕ/мл	4	5
>500 МЕ/мл	5	6