способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли -308G/A TNF и прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления аллеля -308A TNF .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей больных сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2-го типа (СД2) представляет собой эндокринное заболевание, которое возникает в результате поражения b-клеток поджелудочной железы или развития инсулинорезистентности [Joseph NA., Greenberg AS. Adipocytocines and insulin resistance. // J Clin Endocrinol. Metab. 2004. - № 89(2). - P. 447-460]. Болезнь проявляется гипергликемией, поражением органов-мишеней [Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология: учебник для мед.вузов/ Под ред. акад. РАМН И.И.Дедова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 430 с.].

Течение сахарного диабета 2-го типа характеризуется развитием различных осложнений. Наиболее частыми его осложнениями являются диабетическая ретинопатия, ангиопатия нижних конечностей, диабетическая нефропатия, полинейропатия нижних конечностей. Связь между продолжительностью жизни пациентов и осложнениями сахарного диабета очевидна. Одним из грозных осложнений сахарного диабета 2-го типа является ангиопатия нижних конечностей, которая проявляется болями в ногах, развитием «перемежающейся хромоты», снижением пульсации артерий стоп и развитием сидрома диабетической стопы. В дальнейшем при отсутствии лечения развивается гангрена с последующей ампутацией конечности [Williams D.T., Price Р, Harding K.G. "An Evaluation of Screening Methods for Arterial Component of Diabetic Foot Disease in the Community". Program and abstractbook of the 4 th international Symposium on the Diabetic foot, 22-24 May 2003, Noordwijekerhout, The Netherlands: 62].

Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в развитии осложнений сахарного диабета 2-го типа играют провоспалительные цитокины, такие как ФНО и его рецепторы [Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. «Функциональный полиморфизм гена TNF и патология». Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. С.4-10]. Фактор некроза опухоли - внеклеточный белок, многофункциональный провоспалительный цитокин, продуцируемый в основном моноцитами и макрофагами, влияет на липидный метаболизм, коагуляцию, устойчивость к инсулину и функционирование эндотелия. Этот цитокин действует на клетки-мишени практически всех органов и тканей. Ген человеческого ФНО (TNF ) был клонирован в 1985 году. Ген картирован на хромосоме 6р21.3, в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, В, С) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR), между генами Lt и Lt [Глотов О.С., Баранов B.C. Генетический полиморфизм, мультифакториальные болезни и долголетие//Медицинская генетика-2007. - т.6, № 4(58)-С.17-29], имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Последний экзон более чем на 80% кодирует белок. Известно более 30 полиморфных вариантов гена (микросателлиты, SNP-полиморфизмы), но только около половины из них влияют на экспрессию ФНО- in vitro. Согласно литературным данным, высокопродуктивным аллелем при генетическом полиморфизме -308G/A TNF является аллель -308А TNF [Fernandez Н., Копеш В, Fernandes N, Hameed М, Cohen МС, Raveche Е, Cohen S. Investigation of promoter polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10 genes in liver transplant patients. Transplantation 2002; 73: 1886-1891].

Существует три основных направления действия TNF : цитотоксическое, направленное на клетки опухоли; иммуномодулирующее и провоспалительное, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток; влияние на метаболизм. TNF активно участвует в процессе быстрого увеличения размеров клетки и инициации апоптоза. Помимо прямого провоспалительного действия TNF обладает широким спектром иммунорегуляторных эффектов и участвует в регуляции обменных процессов [Баранов B.C. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) / B.C.Баранов, Е.В.Баранова, Т.Е.Иващенко // СПБ: «Интермедика», 2000-272 с.].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе данных о полиморфизме гена фактора некроза опухоли.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли.

Известен метод для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и способа прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа на фоне апоптоза лимфоцитов по патенту РФ № 2452965, опубл. 10.06.2012, «Способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа с помощью оценки апоптоза лимфоцитов». Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа). Способ включает забор периферической венозной крови и определение процентного содержания апоптотических лимфоцитов An+/PI-, при значении содержания лимфоцитов An+/PI- ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год, при содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и прогнозируется умеренный риск развития осложнений, уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета.

Недостаток метода заключается в том, что с его помощью можно спрогнозировать только риск развития осложнений, но невозможно спрогнозировать, какое осложнение из возможных может быть у конкретного пациента.

За прототип выбран патент РФ № 2461005, опубл. 10.09.2012, «Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якуток», где предложен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии путем типирования ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и выявления методом полимеразной цепной реакции T45G полиморфизма гена адипонектина (ADIPOQ). При выявлении генотипа *Т/*Т и аллеля *Т прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Недостаток прототипа заключается в том, что он рассматривает лишь одно из осложнений сахарного диабета 2-го типа - диабетическую ретинопатию, и предназначен только для пациентов определенной этнической принадлежности, а именно - якутов.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у индивидуумов русской национальности по данным о генетическом полиморфизме фактора некроза опухоли- (-308G/A TNF ).

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития диабетической ангиопатии у индивидуумов русской национальности больных сахарным диабетом 2-го типа.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли (-308G/A TNF );

- прогнозирование повышенного риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления аллеля -308A TNF .

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа по наличию аллеля -308А гена фактора некроза опухоли (полиморфизм -308G/A TNFa).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂ , 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Типирование полиморфного локуса фактора некроза опухоли проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (табл.1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин. при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин. при 52°C; денатурация - 15 сек при 95°C.

Таблица 1
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
TNF	-308G/A	F:5'-GAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAG-3'	(T.Kim, 2003)
		R:5'-GGCCACTGACTGATTTGTGTGTAG-3'
	(промотор)	5'-FAM-CCGTCCTCATGCC- RTQ1-3' 5'
		ROX-CCGTCCCCATGCC - RTQ1-3'

Изобретение характеризуется на фиг.1, где представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFa (где - гомозиготы -308АА, - гомозиготы -308GG, - гетерозиготы -308GA, - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю А.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с развитием ангиопатии нижних конечностей при сахарном диабете 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст]./ О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков, В. Statistical искусство анализа данных на компьютере./ В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития ангиопатии нижних конечностей в течении сахарного диабета 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом и 308 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что пациенты с развившейся ангиопатией нижних конечностей имеют наибольшую частоту аллеля -308А TNF (17,31%) в сравнении с контрольной группой (11,06%, ²=5,77, p=0,02, OR=l,68, 95% CI 1,09-2,59) и больными сахарным диабетом 2-го типа без ангиопатии нижних конечностей (10,38%, ²=4,49, p=0,03).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлеченности генетического полиморфизма -308G/A фактора некроза опухоли в формирование ангиопатии нижних конечностей. Маркером развития ангиопатии нижних конечностей у больных СД2 является аллель -308А TNF . Больным сахарным диабетом 2-го типа при выявлении генетического фактора риска развития ангиопатии нижних конечностей (-308А TNF ) следует рекомендовать динамический контроль состояния сосудов нижних конечностей (определение пульсации периферических артерий, ультразвуковая допплерография и допплерометрия сосудов нижних конечностей) с целью ранней диагностики и своевременного лечения ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа (применение сосудистых препаратов, антикоагулянтов, гиполипидемической терапии).