технология определения трисомии хромосом методом секвенирования

Формула изобретения

1. Способ определения трисомии хромосом плода, отличающийся тем, что из плазмы беременных женщин выделяют внеклеточную ДНК, подвергают её бисульфидной конвертации с последующей ПЦР и дальнейшему массовому параллельному секвенированию дифференциально метилированных участков; в качестве контроля дифференциально метилированных участков используют участки с различным уровнем метилирования у матери и плода, анализируют данные путем определения отношения количества чтений, полученных при секвенировании дифференциально метилированных участков ДНК на целевой и контрольной хромосомах, где в случае трисомии, при константном количестве чтений ДНК плода, картированных на дифференциально метилированных участках хромосом, будет наблюдаться количество чтений, картированных на целевую хромосому, к количеству чтений на контрольных хромосомах, равное 3/2, тогда как в норме это отношение будет постоянным и равным 1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве контрольных дифференциально метилированных участков используются участки с различным уровнем метилирования у матери и плода, расположенные на аутосомах.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве целевых дифференциально метилированных участков используются участки с различным уровнем метилирования у матери и плода и расположенные на целевой хромосоме, отличной от контрольных хромосом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, клинической молекулярной биологии, генетическим исследованиям, и может быть использовано в качестве пренатальной неинвазивной диагностики трисомии хромосом у плода в период первого триместра беременности.

Используемый на сегодняшний день метод пренатальной диагностики трисомии - УЗИ в сочетании с биохимическим анализом крови беременной (тройной тест с использованием альфафетопротеина АФП, хорионического гонадотропина ХГЧ и неконъюгированного эстриола НЭ, patent US 5324667,1992, patent US 5622176,1995) - позволяет выявить более 90% случаев заболевания. У 3-5% пациенток группы высокого риска может проводиться забор генетического материала плода посредством амниоцентеза или биопсии хориона. Эти методы являются инвазивными и связаны с 1% риском развития ятрогенного аборта. Альтернативой являются современные технологии, которые позволяют производить пренатальную диагностику трисомии неинвазивно для плода: анализируя следы генетического материала плода, находящиеся в крови матери. Внеклеточная ДНК (вкДНК) плода выявляется в крови матери начиная с первого месяца беременности и составляет в норме от 3 до 6% от общей вкДНК матери [1]. Посредством поиска специфических нуклеотидных последовательностей вкДНК успешно анализируется с целью определения пола будущего ребенка, а также его резус-фактора у резус-негативных женщин (patent US 6258540, 1999).

Аналогичный подход применен в нескольких зарубежных исследованиях для выявления анэуплоидий у плода. Клиническая эффективность и практическая применимость методики были оценены в недавнем многоцентровом исследовании, проведенном в Гонконге, Великобритании и Голландии [2]. Авторами был применен метод мультиплексного секвенирования вкДНК. Данный способ включает следующие стадии: выделение вкДНК, приготовление геномной библиотеки, секвенирование, определение количества 21 хромосомы. Недостатком данного способа является нормирование количества плодной ДНК по Y хромосоме, что допустимо только в случае беременности мальчиком (male pragnancy), а также избыточное количество информации, полученной в процессе нецелевого, тотального секвенирования вкДНК, что, в свою очередь, негативно скажется на стоимости и доступности данного анализа.

Аналогом предлагаемого изобретения является метод, предложенный компанией Sequenom (США, Сан Диего, Калифорния, US Patent No. 6258540). Это обширное исследование опубликовано в 2011 году [3], а в 2012 году метод неинвазивной пренатальной диагностики нашел свое коммерческое применение в виде теста «MaterniT21». Недостатком данного метода также является избыточное количество информации, получаемое в процессе нецелевого секвенирования, что требует дорогостоящего оборудования и негативно скажется на доступности данного анализа.

Близким к предлагаемому способу диагностики трисомии является метод, описанный в Евразийском патенте № 014274, 2010 г. Недостатком данного метода является патентование именно принципа определения последовательностей ДНК, принадлежащих плоду в смеси вкДНК матери и плода, с помощью дифференциально метилированных участков без описания какого-либо способа количественного определения гомологичных хромосом.

Также близким к предлагаемому способу диагностики трисомии является метод, описанный в статье Papageorgiou с соавторами [4], где был предложен метод разделения ДНК матери и плода по статусу метелирования дифференциально метелированных участков. Недостатком данного способа является технология определения количества гомологичных хромосом с помощью количественной полимеразной цепной реакции, что значительно снижает чувствительность и точность метода.

В Российской Федерации в настоящий момент нет прямых или косвенных аналогов данной методики. Технической задачей настоящего изобретения является упрощение способа, повышение чувствительности и точности анализа описанных выше зарубежных аналогов.

Сущность способа заключается в количественном определении чтений ДНК при секвенировании участков целевой хромосомы плода во фракции внеклеточной ДНК матери в первом триместре беременности, а именно - определение количества гомологичных хромосом. Нормирование количества чтений ДНК целевой хромосомы осуществляется по количеству чтений ДНК на других аутосомах. Определение плодной ДНК в общей смеси внеклеточной ДНК осуществляется посредством измерения статуса метилирования участков ДНК в норме, метилированных в различной степени у плода и матери. Статус метилирования ДНК определяли после бисульфитной обработки ДНК, приводящей к конверсии неметилированных оснований цитозина в урацил, и сохранения защищенного метильной группой 5-метилцитозина с последующей ПЦР со специфичными к модифицированной последовательности праймерами и секвенирования. Для этого на целевой хромосоме были выбраны несколько известных участков ДНК с различной степенью метилирования у матери и плода. Данные участки дифференциального метилирования отличались гиперметилированием плодной ДНК по сравнению с материнской. Контролем служили дифференциально метилированные участки ДНК, расположенные на других аутосомах. По отношению к уровню метилирования материнской ДНК контрольные участки плодной ДНК были как гиперметилированны, так и гипометилированны. Использование для определения состояния трисомии внеклеточной ДНК, а также секвенирования ДНК небольшими, длиной до 300 нуклеотидов участками, дифференциально метилированных у плода и матери, позволяет значительно повысить достоверность и чувствительность метода пренатальной диагностики трисомии в период первого триместра беременности.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с зарубежными аналогами, являются:

1. Использование внеклеточной ДНК выделенной из плазмы матери.

2. Использование различий в статусе метилирования участков ДНК у матери и плода, что позволяет определить долю плодной ДНК в смеси плодной и материнской ДНК.

3. Целевое секвенирование небольших, менее 300 нуклеотидов, участков ДНК увеличивает чувствительность и точность анализа, а также предлагает меньшие требования к аппаратуре.

Технология определения трисомии осуществляется следующим способом.

У женщин, проводящих пренатальную генетическую диагностику в первый триместр беременности, была собрана кровь в ватуйнеры с ЭДТА, объемом 9 мл. Полученную кровь центрифугировали 10 мин 2000 об/мин для получения плазмы, богатой тромбоцитами.

Далее плазму повторно центрифугировали 15 мин 16000 об/мин для получения очищенной плазмы. Внеклеточную ДНК получали с использованием набора реактивов QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen), руководствуясь инструкцией к набору. Концентрацию полученной вкДНК определяли с помощью Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies).

Полученную ДНК модифицировали обработкой бисульфитом натрия, при которой неметилированные цитозины превращаются в урацилы, а метелированные цитозины остаются неизменными. Бисульфитную модификацию проводили, используя набор реактивов EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research).

Бисульфитно модифицированную ДНК секвенировали с использованием следующих праймеров на дифференциально метилированные участки (ДМУ):

При математическом анализе данных определяли количество чтений, полученных при секвенировании дифференциально метилированных участков ДНК, как на целевой хромосоме, так и на других аутосомах. Секвенирование участков ДНК после бисульфитной конвертации позволяет все полученные последовательности разделить на относящиеся к матери или к плоду. В случае трисомии, при константном количестве чтений ДНК плода, картированных на контрольные участки, будет наблюдаться большее количество чтений, картированных на участки целевой хромосомы. Т.е. в случае трисомии у плода отношение чтений, картированных на 21 хромосому, к количеству чтений на остальных аутосомах будет равно 3/2. Тогда как это отношение в норме у плода и матери будет постоянным и равно 1.

Источники информации

1. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997 Aug 16; 350(9076):485-7.

2. Eric Z. Chen, Rossa W.K.Chiu, Hao Sun, Ranjit Akolekar, K.C.Alien Chan, Tak Y.Leung, Peiyong Jiang, Yama W.L.Zheng, Fiona M.F.Lun, Lisa Y.S.Chan, Yongjie Jin, Attie T.J.I.Go, Elizabeth T.Lau, William W.K.To, Wing C.Leung, Rebecca Y.K.Tang, Sidney K.C.Au-Yeung, Helena Lam, Yu Y.Kung, Xiuqing Zhang, John M.G. van Vugt, Ryoko Minekawa, Mary H.Y.Tang, Jun Wang, Cees B.M.Oudejans, Tze K.Lau, Kypros H.Nicolaides, and Y.M.Dennis Lo. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. PLoS One. 2011; 6(7): e21791.

3. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, Ehrich M, van den Boom D, Bombard AT, Deciu C, Grody WW, Nelson SF, Canick JA. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011 Nov; 13(11):913-20.

4. Papageorgiou EA, Fiegler H, Rakyan V, Beck S, Hulten M, Lamnissou K, Carter NP, Patsalis PC. Sites of differential DNA methylation between placenta and peripheral blood: molecular markers for noninvasive prenatal diagnosis of aneuploidies. Am J Pathol. 2009. 174(5):1609-18.