система маркеров на основе группы генов микрорнк для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному

Формула изобретения

Система маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному, путем выявления метилирования, по крайней мере, одного маркера из этой группы, отличающаяся тем, что маркерами являются гены: miR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375.

Описание изобретения к патенту

Система маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному.

Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии и молекулярной биологии, и касается системы маркеров для диагностики немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), путем оценки статуса метилирования генов микроРНК: miR-129-2, miR-125bl, miR-137 и miR-375. Выявление метилирования, по крайней мере, одного гена из заявленной системы маркеров в предположительно пораженной раком ткани человека, по сравнению со здоровой тканью легкого служит диагностическим признаком НМРЛ. Заявленная система маркеров на основе генов микроРНК позволяет с высокой частотой и специфичностью диагностировать НМРЛ, а именно плоскоклеточный рак легкого (ПРЛ) и аденокарциному легкого (АК), в том числе на ранних стадиях.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) - самый распространенный вид рака среди онкопатологий человека. Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке легкого связаны, прежде всего, с поздним выявлением заболевания. При обнаружении опухолей легкого на 1-ой клинической стадии, уровень 5-летней выживаемости пациентов поднимается от 15% до 70%.

Отбор системы генов микроРНК, связанных с развитием опухолей и ассоциированных с CpG-островками, проводили с привлечением следующих баз данных: UCSC Genome Browser (hg 18 (http://genome.ucsc.edu/)), miRBase (http://www.mirbase.org/), MicroRNAdb (http://bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/micrornadb/), miRDB (http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi), miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html), TargetScan (http://www.targetscan.org/), miR2Disease Base (http://www.mir2disease.org/), miRWalk (http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/), CpGcluster (http://bioinfo2.ugr.es/CpGcluster/). Отобранные микроРНК находятся на участках хромосом, часто вовлеченных в онкогенез, или связанных с генами, вовлеченными в онкогенез. Оценка статуса метилирования генов miR-129-2, miR-125b, miR-137 и miR-375 при НМРЛ позволила на их основе составить систему маркеров для диагностики этого заболевания. Сведений о выявлении метилирования этих генов при НМРЛ в источниках информации не обнаружено.

В качестве ближайшего аналога заявляемой системы маркеров рассмотрим систему маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-34, miR-148 и miR-9 (WO 2010020787). Диагностика рака легкого осуществляется путем выявления метилирования или снижения экспрессии хотя бы в одном маркере этой системы. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.

Известные значения клинической чувствительности и специфичности для диагностики НМРЛ составляют 82% и 77% соответственно (WO 2011146937), которые достигаются путем анализа уровней экспрессии системы маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-1254 и miR-574-5p.

Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал маркеров на основе генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному. Задача решена путем:

- разработки системы маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375 - для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному, путем выявления метилирования, по крайней мере, у одного гена из этой группы.

Диагностику НМРЛ осуществляют по следующему методу.

Берут образцы ткани легкого у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания или с установленным диагнозом. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани легкого проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Далее проводят бисульфитную конверсию ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР) [4]. Для анализа метилирования каждой микроРНК методом МС-ПЦР используют две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Продукты МС-ПЦР разделяют электрофорезом в 2% агарозном геле либо в 10% полиакриламидном геле (при длине продукта ПЦР менее 160 н.п.). Далее анализируют на наличие или отсутствие продуктов МС-ПЦР для праймеров, специфичных к метилированному и неметилированному аллелю. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют образцы ДНК из лейкоцитов крови здоровых доноров. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют препараты ДНК из лейкоцитов, обработанные метилтрансферазой SssI («СибЭнзим», Новосибирск). Соответствие фрагментов МС-ПЦР исследуемым генам проверяют прямым секвенированием обеих цепей продуктов МС-ПЦР. Диагностику НМРЛ осуществляют по наличию метилирования, по крайней мере, у одного маркера системы.

Пример 1. Определение набора праймеров для гена микроРНК miR-375.

Подбор праймеров для МС-ПЦР гена микроРНК miR-375 осуществляют с помощью программы Methyl Primer Express v.1.0 (Applied Biosystems, USA) со следующими параметрами: размер ампликонов 100-200 пар оснований, от 4 до 7 CpG-динуклеотидов на пару праймеров, от 4 до 10 цитозиновых остатков, не входящих в CpG-динуклеотиды, разница в температурах плавления праймеров в паре не более 5 градусов. Первоначальные варианты пар праймеров проверены на образование димеров и вторичных структур с помощью программы Vector NTI v.10.0 (Invitrogen, USA). В результате получен заявляемый набор праймеров для гена микроРНК miR-375, который приведен в таблице 1.

Пример 2. Диагностика НМРЛ, включая ПРЛ и АК.

Для 39 пациентов с морфологически установленным диагнозом - НМРЛ, включая 26 пациентов с ПРЛ и 13 с АК, и 20-ти доноров, онкологически здоровых в анамнезе, проведен анализ метилирования заявляемой системы маркеров (таблица 2, 3). В случае ПРЛ диагноз подтвержден у 24 из 26 пациентов, что соответствует 92% случаев. В случае АК диагноз подтверждается для 11 из 13 пациентов, что соответствует 85% случаев (таблица 4). Причем заявляемая система маркеров позволяет диагностировать АК и ПРЛ на самых ранних клинических стадиях. Так, на I и II клинических стадиях АК выявляют в 78% случаев, а ПРЛ - в 89% случаев. На поздних клинических стадиях (III и IV) использование заявляемой системы маркеров позволяет выявить АК и ПРЛ в 100% случаев (таблица 4). Для 20 доноров заявляемая система выявляет метилирование в двух образцах хотя бы по одному маркеру, что соответствует 10% (таблица 3). На основании этих данных можно утверждать о возможности использовать заявляемую систему маркеров для диагностики НМРЛ, включая ПРЛ и АК.

Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемой системы маркеров.

Важным свойством заявляемой системы маркеров является высокая клиническая чувствительность и специфичность при диагностике НМРЛ. Наличие метилирования, по крайней мере, у одного маркера системы генов микроРНК выявлена у 35 из 39 пациентов с НМРЛ (90% случаев) и у двух из 20 доноров, онкологически здоровых в анамнезе (10% случаев). На основании этих данных клиническая чувствительность и специфичность заявляемой системы маркеров, рассчитанная методом ROC-анализа, составляют 90% и 90% соответственно. Таким образом, заявляемая система маркеров позволяет диагностировать НМРЛ у пациентов истинно больных данным онкозаболеванием с высокой (в 90% случаев) клинической чувствительностью.

Заявляемая система маркеров для диагностики НМРЛ характеризуется следующим.

1. Обладает клинической чувствительностью 90% и специфичностью 90%, что превосходит известные значения: 82% и 77% (WO 2011146937).

2. Позволяет диагностировать два наиболее распространенных вида НМРЛ - плоскоклеточный рак и аденокарциному на самых ранних клинических стадиях с высокой клинической чувствительностью (до 90%) и специфичностью (до 90%).

3. Позволяет осуществить диагностику в стандартизованных условиях (таблица 1) с использованием недорогих приборов отечественного производства.

Таблица 1.
Характеристика праймеров, условий5 и продуктов МС-ПЦР
Название гена и источник праймеров	Структура праймеров	Продукт ПЦР, п.н.
miR-129-21	MF1:GATTTTAGTTCGTATTAATGAGTTGGCGGTTTC MR1:AACCCCGACTACAAAATCGCG	210
	UF1:TGATTTTAGTTTGTATTAATGAGTTGGTGGTTTTG UR1:АССААССССААСТАСААААТСАСА	210
miR-125b12	MF2:TGGTGTATCGTTTTTTGTTTTC MR2:ACCCATTCGAAACGAAAC	190
	UF2:ATTTGGTGTATTGTTTTTTGTTTTT UR2:СТСАСССАТТСААААСААААС	190
miR-1373	MF3:TTTTGATTTTTTTCGGTGAC MR3:TACCGCTAATACTCTCCTCG	98
	UF3:TTTTTTGATTTTTTTTGGTGAT UR3:CTACCACTAATACTCTCCTCAA	98
miR-3754	MF4:TCGTTATCGTTATTTTAATCGTACG MR4:AAAAATTTCTATTCTAAACCACGAC	200
	UF4:TGTTATTGTTATTTTAATTGTATGG UR4:AAAAATTTCTATTCTAAACCACAAC	199
Примечания: 1[1] 2[2] 3[3] 4Подобраны авторами с использованием известных программ (Methyl Primer Express v.1.0, Vector NTI v.10.0 и т.п.)

Таблица 2.
Сопоставление данных по метилированию генов, входящих в заявляемую систему маркеров, с клинико-гистологическими характеристиками образцов от 39 пациентов с НМРЛ
№ образца	Ген микроРНК				Клиническая стадия	Степень анаплазии	Возраст/Пол	Стадия по классификации TNM
	miR-129-2	miR-125b1	miR-137	miR-375
Аденокарцинома легкого
842	+	+	-	+	IV	md	72/M	T2N2M1
882	+	-	-	-	III	Id	36/M	T4N2M0
791	+	+	+	+	III	Id	54/Ж	T3N1M0
850	+	+	+	+	III	md	61/Ж	T2N2M0
895	-	-	-	+	II	md	50/Ж	T2N0M0
848	+	+	+	-	I	md	54/М	T2N0M0
835	+	-	-	-	I	md	55/М	T2N0M0
806	-	-	-	-	I	md	59/М	T2N0M0
854	-	+	+	+	I	md	61/Ж	T2N0M0
776	+	-	+	+	I	md	58/Ж	T1N0M0
804	-	+	-	+	I	md	68/Ж	T1N0M0
883	-	+	-	-	I	hd	47/Ж	T1N0M0
838	-	-	-	-	I	hd	70/Ж	T1N0M0

Таблица 2.
(продолжение)
№ образца	Ген микроРНК				Клиническая стадия	Степень анаплазии	Возраст/Пол	Стадия по классификации TNM
	miR-129-2	miR-125b1	miR-137	miR-375
Плоскоклеточный рак легкого
852	+	+	+	+	III	Id	77/M	T4N2M0
384	-	-	+	+	III	Id	67/M	T3N0M0
815	-	+	-	-	III	md	56/М	T3N2M0
831	+	+	+	+	III	md	65/М	T3N2M0
851	-	+	-	+	III	md	59/М	T2N2M0
391	+	+	+	+	III	md	67/М	T3N0M0
534	+	+	-	+	III	md	40/М	T3N1M0
833	+	+	+	-	III	md	59/М	T1N2M0
844	-	+	+	+	II	Id	62/М	T3N0M0
817	+	+	-	+	II	Id	58/М	T3N0M0
709	-	+	-	+	II	Id	39/М	T2N1M0
808	+	-	-	+	II	Id	63/М	T2N1M0
816	-	+	-	+	II	md	71/М	T2N1M0
830	-	+	+	+	II	md	47/Ж	T2N1M0
832	-	-	-	+	II	md	58/М	T2N1M0
378	+	+	-	+	II	md	64/М	T1N1M0

№ образца	Ген микроРНК				Клиническая стадия	Степень анаплазии	Возраст/Пол	Стадия по классификации TNM
	miR-129-2	miR-125b1	miR-137	miR-375
Плоскоклеточный рак легкого
587	-	-	-	-	II	md	45/Ж	T2N1M0
840	-	+	-	-	II	md	51/Ж	T3N0M0
847	+	-	-	-	I	md-Id	51/М	T2N0M0
856	-	+	-	+	I	Id	69/М	T2N0M0
819	-	-	+	+	I	md	67/Ж	T2N0M0
843	+	+	+	-	I	md	807М	T2N0M0
934	-	-	+	-	I	md	57/М	T2N0M0
855	-	+	+	-	I	md	69/М	T2N0M0
778	-	-	-	-	I	hd	67/М	T2N0M0
513	+	+	-	+	I	hd	62/М	T2N0M0

Таблица 3.
Данные по метилированию генов, входящих в заявляемую систему маркеров в образцах, выделенных из ткани легкого 20-ти доноров, онкологически здоровых в анамнезе
№ образца	Ген микроРНК
	miR-129-2	miR-125b1	miR-137	miR-375
Онкологически здоровые в анамнезе доноры (нормальная ткань легкого)
1	-	-	-	-
2	-	-	-	-
3	-	-	-	-
4	-	-	-	-
5	-	-	-	-
6	-	-	-	-
7	-	-	-	-
8	-	-	-	-
9	-	-	-	-
10	-	-	-	-
11	-	-	-	-
12	-	-	-	-
13	-	-	-	-
14	-	-	-	-
15	-	-	-	-
16	-	-	-	-
17	-	-	-	-
18	-	-	-	-
19	-	+	-	+
20	-	-	-	+

Таблица 4.
Частота метилирования, чувствительность и специфичность заявляемой системы маркеров на разных клинических стадиях НМРЛ.
Пациенты с НМРЛ	Аденокарцинома легкого (АК)	Плоскоклеточный рак легкого (ПРЛ)	НМРЛ (АК + ПРЛ)
Тотально (I, II, III, IV клинические стадии)	85% (11/13)	92% (24/26)	90% (35/39)
Только ранние клинические стадии (I, II)	78% (7/9)	89% (16/18)	85% (23/27)
Только поздние клинические стадии (III, IV)	100% (4/4)	100% (8/8)	100% (12/12)
Чувствительность	85%	92%	90%
Специфичность	90%	90%	90%

Цитированные источники научно-технической информации

1. Bandres Е., Agirre X., Bitarte N., Ramirez N., Zarate R., Roman-Gomez J., Prosper F., Garcia-Foncillas J. 2009. Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer. Int J Cancer. 125, 2737-2743.

2. Ernesto Soto-Reyes, Rodrigo Gonzblez-Barrios, Fernanda Cisneros-Soberanis, Roberto Herrera-Goepfert, Vyctor Perez, David Cant, Diddier Prada, Clementina Castro, Felix Recillas-Targa and Luis A Herrera. Disruption of CTCF at the miR-125b1 locus in gynecological cancers. BMC Cancer. 2012-12:40.

3. Balaguer F., Link A., Lozano J.J., Cuatrecasas M., Nagasaka T., Boland R.C. and Goel A. Epigenetic silencing of miR-137 is an early event in colorectal carcinogenesis. Cancer Res. 2010 August 15; 70(16)-6609-6618.

4. Ходырев Д.С., Пронина И.В., Рыков С.В., Береснева Е.В., Фридман М.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. 2012. Метилирование группы генов микроРНК вовлечено в регуляцию экспрессии генов-мишеней RAR-beta2 и NKIRAS1 при раке легкого. Молекулярная биология 46, 773-785.