применение l. casei ssp. paracasei в качестве противогрибкового средства

Формула изобретения

1. Применение бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518 для придания противогрибковых свойств ферментированному молочному продукту.

2. Способ ингибирования развития плесени класса аскомицетов (Ascomycetes) в ферментированном молочном продукте, отличающийся тем, что он включает ферментацию молочного субстрата в присутствии бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518 в течение времени, составляющего по меньшей мере 5 ч, для появления в субстрате противогрибковой активности.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что количество указанных бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518, используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10 ⁶ КОЕ на грамм молочного субстрата.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что количество указанных бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518, используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10⁷ КОЕ на грамм молочного субстрата.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает, если необходимо, доведение рН ферментируемого субстрата до величины больше 4.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная плесень класса аскомицетов принадлежит к роду Penicillium .

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению Lactobacillus casei для защиты молочного продукта от развития плесеней.

Использование микроорганизмов, выбранных с целью улучшения хранения пищевых продуктов, известно тысячелетия. Среди этих микроорганизмов можно назвать молочнокислые бактерии, которые широко используют для хранения молочных продуктов, мясных продуктов или продуктов растительного происхождения, предназначенных для питания человека или животного. Улучшение хранения пищевых продуктов молочнокислыми бактериями основано, большей частью, на их способности продуцировать во время ферментации молочную кислоту и другие органические кислоты, которые ингибируют рост нежелательных микроорганизмов (бактерий и плесеней), понижая рН среды, делая ее неблагоприятной для роста этих микроорганизмов, и/или которые оказывают прямое токсическое воздействие на них. Помимо этих органических кислот, некоторые молочнокислые бактерии продуцируют вещества, обладающие противогрибковыми и/или антибактериальными свойствами такие, как пероксид водорода, диацетил или низин.

В заявке ЕР 0221499 описаны противогрибковые свойства Lactobacillus casei ssp. rhamnosus NRRL-B-15972. Когда эту бактерию культивируют на агаровой среде с добавкой огуречного сока, она способна полностью ингибировать рост Chaetomium olivacium и, частично, рост Aspergillus terreus и Verticillium sp. Зато в этих условиях она не оказывает никакого воздействия на рост Penicillium oxalicum; однако ингибирующее воздействие на этот микроорганизм наблюдали с культурами этой бактерии на огуречном соке при рН порядка 3,7.

В заявке ЕР 0576780 описаны противогрибковые воздействия Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-705. Культуры этой бактерии, полученные в среде на основе молочной сыворотки, в которую добавлены гидролизат казеина и экстракт дрожжей, могут ингибировать рост Penicillium, Cladosporium, Fusarium и Candida.

В заявке РСТ WO 97/36603 описаны противогрибковые воздействия Lactobacillus casei ssp. Casei № 94/49432. Культуры этой бактерии, полученные на синтетической среде с добавкой экстракта дрожжей, обладают противогрибковым действием на Alternaria, Chaetomtum, Cladosporium, Colletotrichum, Cunninghamella, Dothiorella, Geotrichum, Phoma и Phomopsis.

В заявке ЕР 1308506 описаны противогрибковые и антибактериальные воздействия комбинации Propionibacterium jensenil с некоторыми штаммами Lactobacillus casei ssp. paracasei .

В настоящее время авторы изобретения констатировали, что бактерии вида Lactobacillus casei ssp. Paracasei обладают противогрибковой активностью, в частности, в отношении плесеней рода Penicillium, когда их используют изолированно, то есть без объединения с другими противогрибковыми бактериями, в частности, с Propionibacterium jensenil.

Эта противогрибковая активность обладает следующими характеристиками.

Она не проявляется, когда L. casei культивируют на синтетической среде, но появляется, когда L. casei культивируют на молоке, или среде на основе молока, начиная с 5 часов культивирования. Она становится максимальной после 24-48 часов ферментации.

Она чувствительна к рН. Она исчезает при рН ниже 4, но, тем не менее, вновь появляется, если рН поднимается выше 4.

Равным образом, она чувствительна к нагреванию. Она исчезает после термообработки в течение 1 минуты при 60°С.

С другой стороны, она не связана ни с продуцированием органических кислот, таких как сорбиновая, пропионовая или бензойная кислоты (которые известны из-за их противогрибковой активности), ни с продуцированием пероксида водорода, так как эти вещества не детектируются в культурах L. casei ssp. paracasei, обладающих противогрибковыми свойствами.

Объектом настоящего изобретения является применение бактерии вида L. casei ssp. paracasei для придания противогрибковых свойств ферментированному молочному продукту.

В частности, объектом настоящего изобретения является способ ингибирования развития плесени класса аскомицетов (Ascomycetes), в частности, рода Penicillium, в ферментированном молочном продукте, отличающийся тем, что он включает ферментацию молочного субстрата в присутствии бактерии вида L. casei ssp. paracasei в течение времени, достаточного для появления в субстрате противогрибковой активности. Эта противогрибковая активность имеет следствием ингибирование развития указанной плесени в случае загрязнения указанного продукта этой плесенью после ферментации.

Преимущественно, количество указанной бактерии вида L. casei ssp. paracasei , используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10⁶, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁷, более предпочтительно, находится в диапазоне от 10⁷ до 10⁸ КОЕ (u.f.c.) на грамм молочного субстрата.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа согласно изобретению, ферментацию указанного субстрата осуществляют в течение по меньшей мере 5 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно, в течение 24-48 часов. Чтобы получить противогрибковую активность, используя короткие времена ферментации, предпочтительно использовать относительно значительное количество L. casei ssp. paracasei; например, чтобы наблюдать противогрибковую активность после 5 часов ферментации молочного субстрата, обсеменение должно быть осуществлено из расчета по меньшей мере10 ⁷ КОЕ на грамм молочного субстрата.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа согласно изобретению, он включает, если необходимо, доведение рН ферментируемого субстрата до величины больше 4, предпочтительно, находящейся в интервале от 4 до 6,5.

Предпочтительно, указанная бактерия вида L. casei ssp. paracasei представляет собой бактерию штамма CNCM I-1518. Этот штамм описан, в частности, в европейской заявке ЕР 0794707; она была подана, согласно положениям Будапештского договора, 30 декабря 1994 г. в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Национальную коллекцию культур микроорганизмов), 25 улица Рыжего Доктора (Docteur Roux) в Париже.

Настоящее изобретение будет лучше понято при помощи дополнения к описанию, следующего ниже, которое ссылается на примеры, иллюстрирующие противогрибковую активность штамма L. casei ssp. paracasei.

ПРИМЕР 1. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ В ПРИСУТСТВИИ L. CASEI SSP. PARACASEI

Ферментированный молочный продукт, содержащий L. casei ssp. paracasei (Actimel®, содержащий штамм CNCM I-1518 в комбинации с S. thermophilus и L. bulgaricus) и ферметированный молочный продукт, содержащий S. thermophilus и L. bulgaricus (контрольный образец), были инокулированы 6 грибковыми видами из расчета 10² спор:

Mucor circinelloides (2 тестируемых штамма); Mucor plumbeus; Penicillium expansum; Penicillium roqueforti; Penicillium brevicompactum.

Эти виды являются типичными представителями загрязнений, обычно встречающихся на свежих молочных продуктах.

Затем продукты инкубировали при 10°С и изучали все 7 дней на предмет появления талломов грибкового роста.

На обоих продуктах наблюдали значительное развитие видов Mucor, начиная с 14 дней в случае Actimel®, и начиная с 7 дней в случае контрольного продукта. Зато наблюдали предельно слабый рост (агрегаты) или отсутствие видимого роста Penicillium на Actimel® после 40 дней инкубирования, тогда как наблюдали поражение поверхности контрольного продукта только через 14 дней.

Во второй серии экспериментов противогрибковую активность штамма CNCM I-1518 оценивали по методике, происходящей из методики антибиограмм. Она заключается в смешивании тестируемого продукта с агаром (80% продукта + 20% раствора агара с концентрацией 15 г/л) и выливании смеси в чашку Петри.

На затвердевшую среду помещали 3 диска из стерильной бумаги, на которые наносили 100 спор тестируемой плесени (P. expansum. LMSA 00083).

Чашки Петри инкубировали при 25°С и при 10°С. Регулярно измеряли диаметр грибкового таллома.

Были протестированы следующие продукты:

Actimel®, молочная смесь Actimel® с S. thermophilus и L. bulgaricus без штамма CNCM I-1518; молочная смесь Actimel® без S. thermophilus и L. bulgaricus, ферментированная в течение 24 часов в присутствии штамма CNCM I-1518.

Результаты двух опытов для каждого из тестируемых условий проиллюстрированы в таблице I, следующей ниже.

ТАБЛИЦА I
	Диаметр таллома после		Диаметр таллома (мм)		Диаметр таллома(мм)
	инкубирования (мм)		после 17 дней при 10°С		после 24 дней при 10°С
	Опыт 1	Опыт 2	Опыт 1	Опыт 2	Опыт 1	Опыт 2
	8 дней при 25°С	7 дней при 25°С
Actimel®	17,6±4,4	19,2±4,8	9,6±0,5	10±0,9	10,9±0,8	12,9±1,8
(стандартный)
(коммерческий)
Actimel®	>65	>65	>65	>65	>65	>65
Без L.casei
Молочная смесь
Actimel® фер-
ментированная
24 ч с L.casei	9,4±1	8,8±1	11,4±1	15,1±1,2	14,1±0,9	17,2±1,2
в отсутствие
S. thermophilus и
L. bulgaricus

Оба продукта, содержащих штамм CNCM I-1518 (Actimel®, и молочная смесь Actimel®, ферментированная 24 ч с L.casei в отсутствие S. thermophilus и L. bulgaricus), проявляют противогрибковую активность в противоположность продукту, который его не содержит (молочная смесь Actimel® без L.casei).

ПРИМЕР 2. КИНЕТИКА ПОЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИВО ВРЕМЯ ФЕРМЕНТАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ L. CASEI SSP. PARACASEI

Тесты на противогрибковую активность осуществляли на смеси (Mix), представляющей собой снятое молоко, в которое добавлено 2% глюкозы и 6% молочных белков (обычные белки снятого молока), обсемененное 10⁷ КОЕ/мл (cfu/ml) штамма CNCM I-1518 в лиофилизированной форме. Образцы смеси отбирали до и после инокулирования штаммом CNCM I-1518, затем после 15 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч ферментации.

Перед тестами на противогрибковую активность отобранные и замороженные образцы облучали дозой 10 кГр для того, чтобы блокировать развитие бактерий с целью избежать их развития и метаболизма во время испытания. Тестируемые образцы предварительно размораживали и доводили рН образцов до 6,2 (рН исходной смеси). Испытания осуществляли, как описано выше, в примере 1.

Результаты этих тестов (измерение диаметра таллома) иллюстрируются таблицей II, следующей ниже. Надписи «Таллом на диске» и «Агрегаты» относятся к следам грибкового роста, наблюдаемым только на диске.

ТАБЛИЦА II
Тест 7 дней при 25°С
Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
	Т0	Т 15 ч	Т 24 ч			Т 48 ч		Т 72 ч
36,8 мм±10,2	22,5 мм±3,1	19,3 мм±2,7	Агрегаты			Агрегаты		Агрегаты
Тест 19 дней при 10°С
Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
	Т0	Т 15 ч		Т 24 ч	Т 48 ч		Т 72 ч
48,5 мм±1,9	13,8 мм±3,3	Таллом на диске		Агрегаты	Агрегаты		Агрегаты

Эти испытания показывают раннее появление противогрибковой активности, которая, кажется, иногда слабо присутствует с момента инокуляции, но четко появляется только начиная с 15 ч ферментации и становится максимальной между 24 ч и 48 ч. Эта активность всегда присутствует после 48 ч и даже 72 ч при условии, что рН будет больше 4.

ПРИМЕР 3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ К рН

Тесты на противогрибковую активность осуществляли в тех же самых условиях, что в примере 2, приведенном выше, но без регулирования рН перед тестами.

Результаты иллюстрируются таблицей III, следующей ниже.

ТАБЛИЦА III
	Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
		Т0	Т 15 ч	Т 24 ч	Т 48 ч	Т 72 ч
рН	6,32	6,01	5,63	4,8	3,94	3,75
	33,2 ± 2,5	12,8±1,3	Агрегаты	Агрегаты	34,3±11,4	25,2±2,1

Эти результаты показывают, что противогрибковая активность ухудшается, когда рН становится меньше 4.

Однако это ухудшение кажется обратимо, так как противогрибковая активность восстанавливается, если рН довести до величины больше 4.

ПРИМЕР 4. ВЛИЯНИЕ СРЕДЫ ФЕРМЕНТАЦИИ НА ПРОТИВОГРИБКОВУЮ АКТИВНОСТЬ

Чтобы определить, связана ли противогрибковая активность со средой культивирования, были проведены испытания, используя в качестве среды культивирования, с одной стороны, молочную смесь, описанную в примере 2, и, с другой стороны, синтетическую среду следующего состава: пептон 10 г/л; экстракт мяса 10 г/л; экстракт дрожжей 5 г/л; дикалийфосфат 2 г/л; цитрат аммония 2 г/л; сульфат магния 0,1 г/л; сульфат марганца 0,05 г/л; глюкоза 20 г/л; твин 80: 1 мл; деионизированная вода: количество, достаточное для 1 л. Эти среды обсеменяли 10⁷ КОЕ/мл штамма CNCM I-1518 в лиофилизированной форме. После 24 и 48 часов культивирования противогрибковую активность определяли, как описано в примере 2, в течение 7 дней при 25°С и 20 дней при 10°С.

Когда культивирование осуществляли на молочной смеси, наблюдали полное ингибирование грибкового роста, какова бы ни была температура тестирования. Зато никакого ингибирования не наблюдали, когда культивирование осуществляли на синтетической среде, и это при эквивалентной бактериальной популяции.