способ прогнозирования туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью

Формула изобретения

Способ прогнозирования множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, заключающийся в исследовании пациента до начала проведения специфической химиотерапии противотуберкулезными препаратами, отличающийся тем, что определяют содержание в крови CD45R0 ⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺CD4⁺CD25 ^+hi и CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3⁺CD4⁺CD25 ^- Т-хелперов вычисляют значения линейных классификационных функций по уравнениям

d₁=-14,0015-0,0626·x ₁+0,5181·x₂+2,4285·x₃+0,2255·x ₄,

d₂=-22,6954-0,1710·x₁ +0,6689·x₂+3,1202·x₃+0,3229·x ₄,

где x₁, x₂, x₃ , x₄ - количество субпопуляций CD45R0⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺CD4⁺CD25^+hi и CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов, соответственно, и при d₁<d₂ прогнозируют туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии и пульмонологии, клинической иммунологии, аллергологии и может быть использовано для прогнозирования туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) у впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБ).

В современных условиях туберкулезом легких (ТБ) характеризуется тяжелым клиническим течением, патоморфозом, выраженной функциональной недостаточностью иммунной системы пациента и высоким процентом летальных исходов [1, 13]. Отличительной чертой сложившейся на сегодняшний день эпидемиологической ситуации по ТБ является формирование штаммов микобактерий, мульти- и широкорезистентных к лекарственным препаратам стандартной ' антимикобактериальной терапии. При этом изменение биологических свойств возбудителя оказывает существенное влияние на процесс бактериовыделения и определяет патоморфоз заболевания. По данным ВОЗ (2010), основанным на информации, поступившей из 114 стран мира, первичная МЛУ микобактерий туберкулеза МБТ составляет около 4% от всех впервые выявленных случаев ТБ, а на территории стран СНГ данный показатель выше в 3-6 раз [10, 12]. Становится очевидным, что МЛУ МБТ у впервые выявленных больных ТБ является глобальной общемировой проблемой. Таким образом, разработка способов и моделей прогноза МЛУ МБТ у впервые выявленных больных ТБ представляется актуальной и своевременной.

Известен способ прогнозирования течения ТБ с МЛУ у впервые выявленных больных, заключающийся в исследовании нейтрофилов периферической крови: у больного производят забор крови, определяют значения спонтанного и стимулированного НСТ-теста и при значении спонтанного НСТ-теста менее или равного 13% и при значении стимулированного НСТ-теста менее или равного 20% прогнозируют положительную рентгенологическую динамику через три месяца противотуберкулезной терапии [7]. Данный способ позволяет осуществлять прогнозирование клинического течения ТБ с уже диагностированной МЛУ возбудителя, но не риск развития МЛУ как таковой.

Известен способ прогнозирования течения ТБ. Сущность способа: у больного определяют индекс возврата лаважной жидкости, определяемый в процентах как соотношение полученной лаважной жидкости к количеству введенной, а также нейтрофильно-макрофагальный коэффициент, определяемый как соотношение относительного числа нейтрофилов к числу альвеолярных макрофагов. При величинеиндекса возврата лаважной жидкости, составляющей/менее или равной 25%, и повышении нейтрофильно-макрофагального коэффициента более или равного 1,0 прогнозируют прогрессирование туберкулезного процесса. Использование способа позволяет определить тяжесть специфического процесса, дает возможность прогнозировать эффективность лечебных мероприятий и отдельных результатов лечения ТБ [8]. Указанный способ также имеет прогностическое значение, прежде всего в аспекте клинического течения ТБ и обеспечивает проведение своевременной коррекции лечебных мероприятий.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования развития лекарственно-устойчивого ТБ, заключающийся в следующем. В первые 3-5 дней после поступления больного в стационар в качестве факторов риска при балльной оценке определяют: бактериовыделение, клиническую форму туберкулеза; распространенность туберкулезного процесса в легких; категорию; контакт с больным туберкулезом, злоупотребление алкоголем; социальный статус пациента, пол; возраст; табакокурение; давность флюорографического обследования; тип структуропостроения фракций сыворотки крови, совокупность патологических маркеров некробиоза во фракциях сыворотки крови. Подсчитывает сумму баллов и при сумме баллов 1-7 вероятность развития лекарственно-устойчивого ТБ оценивается как низкая, 8-12 - умеренная, 13-19 - высокая [9]. Недостатками способа являются невысокая точность и информативность, а также возможность не вполне объективной оценки медико-социальных факторов риска, как самим пациентом, так и лечащим врачом.

Таким образом, перед нами стояла принципиально новая техническая задача - создание точного и информативного способа прогнозирования ТБ с МЛУ.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, заключающемся в исследовании пациента до начала проведения специфической химиотерапии противотуберкулезными препаратами, определяют содержание в крови CD45R0⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺CD4⁺CD25^+hi и CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов и вычисляют значения линейных классификационных функций по уравнениям:

d₁=-14,0015-0,0626×x₁+0,5181×x ₂+2,4285×x₃+0,2255×x₄

d₂=-22,6954-0,1710×x₁+0,6689×x ₂+3,1202×x₃+0,3229×x₄,

где x₁, x₂, x₃, x₄ - количество субпопуляций CD45R0⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺CD4⁺CD25^+hi и CD4 ⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов, соответственно, и при d₁<d₂ прогнозируют туберкулез, с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.

Способ осуществляют следующим образом. У больных с впервые выявленным туберкулезом легких до начала проведения специфической химиотерапии противотуберкулезными препаратами определяют факторы риска, такие как бактериовыделение, клиническую форму туберкулеза; распространенность туберкулезного процесса в легких; категорию; наличие контакта с больным туберкулезом, злоупотребление алкоголем; социальный статус пациента, пол; возраст; табакокурение; давность флюорографического обследования; тип структуропостроения фракций сыворотки крови, совокупность патологических маркеров некробиоза во фракциях сыворотки крови. Также, проводят иммунологическое исследовании е крови пациента, для чего производят забор периферической крови из вены, утром, натощак. Материалом исследования служат лимфоциты крови.

Для определения поверхностных молекул CD3, CD4, CD25, CD45R0 и внутриклеточного маркера иммуносупрессорной активности Foxp3 в лимфоцитах периферической крови применяли метод проточной лазерной трехцветной цитометрии с использованием моноклональных антител (МКАТ), меченных флуоресцентными метками. Процедуру окрашивания поверхностных (CD3, CD4, CD25, CD45R0) и внутриклеточного (Foxp3) маркеров проводят согласно протоколам фирмы производителя («Becton Dickmson (BD)», США).

Порядок выполнения исследования:

Определение количества CD4⁺ CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток в периферической крови

После выделения мононуклеарные лейкоциты дважды отмывают фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и стандартизируют количество клеток в суспензии до 10×10⁶ клеток/мл. Для окрашивания поверхностных маркеров (CD4, CD25) лимфоцитов периферической крови к суспензии мононуклеарных лейкоцитов добавляют по 20 мкл соответствующих специфических МКАТ, меченных флуоресцентными метками: МКАТ к CD4, меченные FITC (кат. № 345768), и МКАТ к CD25, меченные РЕ-Су5 (кат. № 555433) («Becton Dickinson (BD)», США). Пробы инкубируют 20 мин при комнатной температуре, защищая от света. Для окрашивания внутриклеточного маркера Foxp3 проводят процесс пермеабилизации лимфоцитов. Для этого в каждую пробирку поочередно вносят рабочие растворы стандартных буферов: Human Foxp3 Buffer А и Human FoxP3 Buffer С из набора BD Pharmingen Human Foxp3 Buffer Set (кат. № 560098). Буферы разводят согласно прилагаемой инструкции. Лейкоциты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темном месте. Затем клетки дважды отмывют 2 мл фосфатно-солевого буфера (PH=7,4). В ресуспендированный осадок вносят антитела к внутриклеточному маркеру Foxp3, меченные РЕ (кат. № 560046), в количестве 20 мкл и инкубируют 30 мин в темноте при комнатной температуре. Затем клетки дважды отмывают 2 мл фосфатно-солевого буфера (PH=7,4), к осадку добавляют 400 мкл фосфатно-солевого буфера, после чего пробы считают готовыми к измерению.

Измерение производят на цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. Анализ полученных данных осуществляют при помощи программного приложения BD CellQuest for Mac OS® X.

Анализ образцов клеточных суспензий проводят по пяти параметрам: прямому светорассеянию (FSC), характеризующему размер клетки, боковому светорассеянию (SSC), характеризующему цитоплазматические, а также мембранные особенности клетки, и трем показателям флуоресценции - зеленому (FITC - 530 нм), оранжевому (РЕ - 585 нм) и малиновому (Ре-Су5 - 610 нм), выявляемых на FL1-, FL2- и FL3-каналах (Фиг.1-3).

На Фиг.3 в нижнем правом квадранте находятся клетки, экспрессирующие одновременно антигены CD4, CD25 и не содержащие внутриклеточный маркер Foxp3 (CD4⁺CD25⁺ Foxp3^- регуляторные Т-лимфоциты).

На графике FSC против SSC выделяют гейт 1 - лимфоциты (Фиг.1). Гейт 1 прикладывают к событиям на графике SSC против FL-1 (CD4-FITC), гейтом 2 очерчивают популяцию клеток, экспрессирующих CD4 (Фиг.2). Гейт 2 прикладывают к графику FL-2 (Foxp3-PE) против FL-3 (CD25-РЕ-Су5) (Фиг. 3). Результаты выражают в процентах.

Определение количества CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов и CD3⁺CD4⁺CD25^+hi регуляторных Т-клеток в периферической крови

Для определения поверхностных рецепторов CD3, CD4 и CD25 на лимфоцитах периферической крови применяют метод лазерной проточной трехцветной цитометрии с использованием МКАТ, меченных флуоресцентными метками. Процедуру окрашивания маркеров CD3, CD4 и CD25 проводят согласно протоколу фирмы производителя («Becton Dickinson (BD)», США).

После выделения мононуклеарные лейкоциты дважды отмывают фосфатно-солевым буфером (pH=7,4), каждый раз при этом ресуспендируя и центрифугируя в течение 10 мин при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливают, а оставшийся осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере и стандартизируют количество клеток в суспензии до 10×10 ⁶ клеток/мл. Для окрашивания лимфоцитов в цитометрические пробирки вносят по 50 мкл суспензии мононуклеарных лейкоцитов и по 20 мкл конъюгированных МКАТ - CD3 (PerCP-Cy5,5)/CD4 (FITC)/CD25 (PE) («Becton Dickinson (BD)», США, кат. № 333170), перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.

Измерение производят на цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. Анализ полученных данных осуществляют при помощи программного приложения BD CellQuest for Mac OS® X.

Анализ образцов клеточных суспензий проводили по пяти параметрам: прямому светорассеянию (FSC), характеризующему размер клетки, боковому светорассеянию (SSC), характеризующему цитоплазматические, а также мембранные особенности клетки, и трем показателям флуоресценции - зеленому (FITC - 530 нм), оранжевому (РЕ - 585 нм) и малиновому (PerCP-Cy5,5 - 610 нм), выявляемых на FL1, FL2, FL3-каналах (Фиг.4).

Для анализа строят два промежуточных графика: FSC против SSC, на котором выделяют гейт 1 - лимфоциты. Гейт 1 прикладывают к событиям на втором графике SSC против FL-3 (CD3- PerCP-Су5,5), гейтом 2 очерчивают популяцию лимфоцитов, экспрессирующих CD3. Затем гейт 2 прикладывают к графику FL-1 (CD4-FITC) против FL-2 (CD25-PE) (Фиг.4).

На Фиг.4 в верхнем правом квадранте находятся лимфоциты, экспрессирующие одновременно CD3-, CD4- и CD25-молекулы. Клетки, находящиеся в этом квадранте и светящиеся по CD25 с интенсивностью более 10², считают субпопуляцией CD3⁺CD4⁺CD25^+hi (регуляторные Т-клетки с «высокой экспрессией» CD25-молекулы). В правом нижнем квадранте располагают лимфоциты с иммунофенотипом CD3⁺CD4⁺CD25^- (Т-хелперы). Результаты выражают в процентах.

Определение количества лимфоцитов крови, экспрессирующих CD45R0

Для определения в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD45R0, применяют метод лазерной проточной трехцветной цитометрии с использованием МКАТ к лимфоцитарным рецепторам Anti-CD45R0, меченных РЕ (кат. № 347967) («Becton Dickinson (BD)», США). Процедуру окрашивания лимфоцитов, экспрессирующих CD45R0-молекулу, проводят согласно протоколу фирмы производителя («Becton Dickinson (BD)», США).

Процедуры пробоподготовки, окрашивания и измерения проводят аналогично охарактеризованным выше. Анализ образцов клеточных суспензий проводят по трем параметрам: прямому светорассеянию (FSC), характеризующему размер клетки, боковому светорассеянию (SSC), характеризующему цитоплазматические, а также мембранные особенности клетки, и одному показателю флуоресценции - оранжевому (PE - 585 нм), выявляемому на FL2-канале (Фиг.5). Для анализа строили промежуточный график: FSC против SSC, на котором выделяют гейт 1 - лимфоциты. Гейт 1 прикладывают к событиям на графике SSC против FL-2 (Anti-CD45R0-PE) (Фиг.5). На Фиг.5 в нижнем правом квадранте находятся лимфоциты, экспрессирующие CD45R0-молекулу (Т-клетки памяти). Результаты выражают в процентах.

Прогноз множественной лекарственной устойчивости у больных туберкулезом легких

Для построения модели прогноза множественной лекарственной устойчивости и лекарственной чувствительности у пациентов с ТБ используют дискриминантный анализ [6]. Решающие правила (дискриминантные функции) представляют собой линейные классификационные функции вида

d_j(x₁,x₂, ,x_n)=b_0,j+b_1,jx₁ +b_2,jx₂+ +b_n,jx_n,

где d _j - линейная дискриминантная функция для j-й группы пациентов;

b_0,j - константа для j-й линейной дискриминантной функции;

b_1,j,b_2,j, ,b_n,j - коэффициенты для признаков х₁ ,х₂, ,x_n в j-й линейной дискриминантной функции;

x₁,x₂, ,x_n - значения признаков классифицируемого пациента.

Для решения задачи прогноза по измеренным у пациента иммунологическим показателям производят расчет дискриминантных функций, соответствующих верифицированным группам пациентов с лекарственно-чувствительным (ЛЧ) вариантом ТБ и МЛУ ТБ. Пациента относят к той группе, для которой линейная дискриминантная функция принимала максимальное значение.

При проведении расчетов используют пакет прикладных программ Statistica 6.0 [3].

Способ основан на анализе данных клинических исследований. Обучающую выборку составили 12 пациентов с МЛУ ТБ и 18 пациентов с ЛЧ ТБ. У каждого больного первоначально были определены 10 иммунологических показателей, характеризующих количественный состав иммунокомпетентных клеток крови в целом, а также субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток: CD4⁺CD25⁺ Foxp3^-, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ , CD4⁺CD25^-Foxp3⁺, CD3⁺ CD4^-CD25⁺, CD3⁺CD4⁺ CD25^+hi, CD3⁺CD4⁺CD25^- , Т-лимфоциты, CD45R0⁺ Т-клетки, общее количество лейкоцитов и относительное количество лимфоцитов. Выбор показателей был обусловлен, прежде всего, тем, что сбалансированность и завершенность этапов иммунного ответа на M. tuberculosis определяется преимущественно клетками-эффекторами и регуляторами адаптивного клеточного иммунитета. Кроме того, в последнее время появились новые данные в пользу подавляющего (супрессорного) действия клеток приобретенного иммунитета на врожденный иммунитет [4, 11]. В противоположность ранее сложившимся представлениям были получены факты, свидетельствующие о том, что недостаточное количество Т-лимфоцитов в организме приводит к утрате контроля раннего воспалительного ответа, чрезмерная активация (равно как и подавление) которого приводит к иммунопатологии и способствует прогрессирующему течению инфекционного процесса [11].

Лекарственную чувствительность M. tuberculosis к ПТП определяли методом абсолютных концентраций в среде Левенштейна-Йенсена. Клиническую форму ТБ устанавливали на основании данных рентгенологического исследования легких. При этом пациенты объединялись в группы с ЛЧ ТБ и МЛУ ТБ независимо от формы заболевания, поскольку риск развития МЛУ не зависит от клинической формы ТБ [2, 5].

В результате применения процедуры пошагового дискриминантного анализа из 10 исходных показателей были построены правила классификации, включающие 4 наиболее информативных показателя, представленных в табл. 1. Информативными показателями для прогноза МЛУ M. tuberculosis оказались количество CD45R0⁺ Т-клеток памяти, количество регуляторных Т-клеток с иммунофенотипами CD3⁺CD4 ⁺CD25^+hi и CD4⁺CD25⁺Foxp3 ^-, а также количество CD3⁺CD4⁺CD25 ^- Т-хелперов в периферической крови. Их определение позволяет прогнозировать вариант течения ТБ с вероятностью 83,3%. Качество прогноза состояния по построенным решающим правилам представлено в табл.2. Точность предсказания МЛУ ТБ на основе предложенного способа составила 83,3%.

Примеры на осуществление способа

Пример 1.

Больной Б., 37 лет.

Поступил во фтизиотерапевтическое отделение Томской областной клинической туберкулезной больницы 11.04.2011 г. Диагноз: подострый диссеминированный ТБ в фазе инфильтрации и распада, МБТ (+). Диагноз ТБ был установлен на основании анамнеза, клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

Данные анамнеза: со слов больного, туберкулезом ранее не болел. Установлен контакт с больными туберкулезом (находился в пенитенциарном учреждении). Больной курит и периодически злоупотребляет алкоголем. Флюорографическое обследование проходил в 2008 г. При поступлении предъявлял жалобы на слабость, утомляемость, потерю веса, повышение температуры тела до 38°-38,5°C, кашель с мокротой, одышку.

Объективный статус: состояние пациента средней степени тяжести. Симптомы интоксикации ярко выражены. Аускультативно дыхание везикулярное. Со стороны других органов и систем патологии не выявлено.

Рентгенологическое исследование от 12.04.2011 г.: в проекции верхних долей обоих легких на фоне обогащенного легочного рисунка множественные очаговые малой интенсивности, сливного характера тени, с участками просветления.

В анализе мокроты от 12.04.2011. МБТ обнаружены методом микроскопии и методом посева.

Общий анализ крови от 12.04.2011.: Нв - 114, Эр - 2,18, ЦП 0,8, Le - 12,5×109/л, Э - 5, П - 16, С - 60, Л - 14, М - 5, СОЭ - 34 мм/ч.

Общий анализ мочи без особенностей.

Биохимический анализ крови: общий белок - 61 г/л, АЛТ - 12, ACT - 18, тимоловая проба - 4,5, холестерин - 3,0, общий билирубин - 6,8, глюкоза - 6,6 ммоль/л.

Р. Манту - 24 мм (гиперергическая).

Описанные выше методы обследования пациента Б. позволяли косвенно прогнозировать лишь неблагоприятный характер клинического течения диагностированного туберкулеза легких, но не чувствительность/устойчивость возбудителя к основным противотуберкулезньм препаратам.

В связи с этим, дополнительно было проведено исследование согласно предлагаемому способу - произведен забор крови для определения иммунологических показателей: CD45R0⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺CD4⁺CD25^+hi и CD4⁺ CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3 ⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов. Относительное содержание CD45R0⁺ Т-клеток памяти составило 2,26%, CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов - 37,82%, CD3⁺CD4⁺CD25^+hi регуляторных Т-клеток - 0,85%, CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток/активированных Т-хелперов - 8%. Подставив эти значения в их дискриминантные функции, получили:

d₁=-14,0015-0,0626×2,26+0,5181×37,82+2,4285×0,85+0,2255×8=9,3197

d₂=-22,6954-0,1710×2,26+0,6689×37,82+3,1202×0,85+0,3229×8=7,4513

Так как значение первой функции было больше чем второй, то состояние пациента Б. прогнозировали как лекарственно-чувствительный (ЛЧ) ТБ, однако с учетом того, что региональный уровень первичной МЛУ микобактерий в Томской области превышает 5% и составляет 14,5%, а также учитывая анамнестические, клинические и социальные показания больному был назначен стандартный режим химиотерапии 116, включающий в себя ПТП резервного (2-го) ряда. Через 6 недель данными микробиологического исследования (непрямой метод абсолютных концентраций) была определена чувствительность МБТ к ПТП основного (1-го) ряда (изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину), после чего была проведена коррекция лечебного воздействия и больной был переведен на стандартный режим химиотерапии IIa.

Пример 2.

Больная П., 45 лет.

Поступила во фтизиотерапевтическое отделение Томской областной клинической туберкулезной больницы 15.05.2011 г. Диагноз: инфильтративный ТБ S₆ левого легкого в фазе распада и обсеменения, МБТ (+). Диагноз ТБ был установлен на основании анамнеза, клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

Данные анамнеза: Туберкулезом ранее не болела. Контакт с больным туберкулезом не установлен. Больная курит, алкоголем не злоупотребляет, проживает в общежитии, профессиональная деятельность связана с частым переохлаждением (работает продавцом на открытом рынке). Флюорографическое обследование проходила в 2010 г. При поступлении предъявляла жалобы на недомогание, слабость, повышение температуры тела до 37,5°-38,0°C.

Объективно: состояние ближе к удовлетворительному. Симптомы интоксикации умеренно выражены.

Рентгенологически от 16.05.2011 г. в S6 левого легкого малой интенсивности фокус с нечеткими контурами. Связь с корнем. Средостение нормальной конфигурации.

В анализе мокроты от 13.02.08. МБТ обнаружены методом микроскопии и методом посева.

Общий анализ крови от 16.05.2011.: Нв - 108, Эр - 3,5, ЦП 0,9, Le - 10,7×109/л, Э -4, П - 8, С - 62, Л - 21, М - 4, СОЭ - 22 мм/ч.

Общий анализ мочи без особенностей.

Биохимический анализ крови: общий белок - 72 г/л, АЛТ - 8, ACT - 11, тимоловая проба - 2,1, холестерин - 5,5, общий билирубин - 13,8, глюкоза - 4,7 ммоль/л.

Р. Манту - 12 мм.

Описанные выше методы обследования пациентки П. позволяли косвенно прогнозировать лишь характер клинического течения диагностированного туберкулеза легких, но не чувствительность/устойчивость возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам.

В связи с этим, дополнительно было проведено исследование согласно предлагаемому способу - наряду со стандартными методами лабораторных исследований был произведен забор крови для определения иммунологических показателей CD45R0⁺ Т-клеток памяти, CD3⁺ CD4⁺CD25^+hi и CD4⁺CD25⁺ Foxp3^- регуляторных Т-клеток, CD3⁺CD4 ⁺CD25^- Т-хелперов. Относительное содержание CD45R0⁺ Т-клеток памяти составило 9,35%, CD3⁺ CD4⁺CD25^- Т-хелперов - 55,37%, CD3 ⁺CD4⁺CD25^+hi регуляторных Т-клеток - 0,34%, CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток/активированных Т-хелперов - 23%. Подставив эти значения в их дискриминантные функции, получили:

d ₁=-14,0015-0,0626×9,35+0,5181×55,37+2,4285×0,34+0,2255×23=20,1126

d₂=-22,6954-0,1710×9,35+0,6689×55,37+3,1202×0,34+0,3229×23=21,2303

Так как значение первой функции было меньше чем второй, то состояние пациентки П. прогнозировали как множественно лекарственно-устойчивый (МЛУ) ТБ и больной был назначен стандартный режим химиотерапии 116, включающий в себя ПТП резервного (2-го) ряда. Через 6 недель данными микробиологического исследования (непрямой метод абсолютных концентраций) была определена множественная устойчивость МБТ к ПТП основного (1-го) ряда (изониазиду, рифампицину, этамбутолу и стрептомицину) и лечение было продолжено согласно стандартному режиму химиотерапии IIб.

Приведенные примеры наглядно иллюстрируют эффективность, информативность и высокую точность предложенного способа. Принципиальным является и то обстоятельство, что хотя непрямой метод абсолютных концентраций является универсальным в РФ для диагностики МЛУ МБТ, проблема существует и заключается в том, что данные этого метода поступают в клинику спустя 2,5-3 месяца после начала исследования за счет крайне медленного роста МБТ в питательной среде. Таким образом, предлагаемый способ, основанный на оценке количественных показателей иммунного статуса пациента, позволяет прогнозировать МЛУ МБТ у больных ТБ при выявлении заболевания и применять меры коррекции лечебного воздействия.

Приложение

Фиг.1. Гистограмма распределения мононуклеарных лейкоцитов по интенсивности прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Оценивается общее содержание лимфоцитов в смешанной суспензии мононуклеарных лейкоцитов.

Фиг.2. Гистограмма распределения CD4⁺-лимфоцитов, меченных FITC, по интенсивности SSC-светорассеяния и флуоресценции по первому каналу FL1.

Фиг.3. Гистограмма распределения регуляторных (Treg - Т regulatory) CD25⁺Foxp3 ⁺ Т-лимфоцитов в популяции CD4-позитивных лимфоцитов крови по интенсивности флуоресценции в FL2-, FL3-каналах (меченных РЕ и РЕ-Су5). Оценивается содержание CD4⁺CD25 ⁺Foxp3⁺ клеток (правый верхний квадрант), CD4 ⁺CD25⁺Foxp3⁺ клеток (левый верхний квадрант), CD4⁺CD25⁺Foxp3^- клеток (правый нижний квадрант).

Фиг.4. Гистограмма распределения CD4⁺CD25⁺ клеток в популяции CD3-позитивных лимфоцитов в крови по интенсивности флуоресценции в FL1-, FL2-каналах. Оценивается содержание CD3⁺CD4⁺CD25 ^+hi клеток (правый верхний квадрант) и CD3⁺CD4 ⁺CD25^- клеток (правый нижний квадрант).

Фиг.5. Гистограмма распределения лимфоцитов, меченных Anti-CD45R0-PE, по интенсивности SSC и флуоресценции по второму каналу FL2. Оценивается содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD45R0.

Табл.1. Коэффициенты линейных дискриминантных функций.

Табл.2. Классификационная матрица результатов дискриминантного анализа.

Табл. 1
Коэффициенты линейных дискриминантных функций (F(4,25)=4,50; p<0,0071)
Показатели	Коэффициенты bj,i
	d1 (группа ЛЧТБ)	d2 (группа МЛУ ТБ)
Константа, bj,0	-14,0015	-22,6954
Показатели, xi
CD45R0+ , %	-0,0626	-0,1710
CD3+CD4+CD25 -: Th, %	0,5181	0,6689
CD3+CD4+ CD25+hi, %	2,4285	3,1202
CD4+CD25 +Foxp3-, %	0,2255	0,3229

Табл. 2
Классификационная матрица результатов дискриминантного анализа
Вариант течения туберкулеза легких	Прогноз варианта течения туберкулеза легких по использованной модели		% правильного прогноза
	ЛЧ ТБ	МЛУ ТБ
ЛЧ ТБ	15	3	83,3
МЛУ ТБ	2	10	83,3
Всего	17	13	83,3

Источники информации

1. Комиссарова О.Г. Особенности течения процесса и эффективность лечения у больных лекарственно-устойчивым туберкулезом легких при различной интенсивности синдрома системного воспалительного ответа: Дис. докт. мед. наук. Москва, 2011. 290 с.

2. Маркелов Ю.М., Нарвская О.В. Циркуляция штаммов возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью на территории республики Карелия // Туберкулез и болезни легких. 2010. Т.87, № 2. С.54-57.

3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTCA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.

4. Фрейдлин И.С. Взаимосвязи врожденного и приобретенного иммунитета при инфекциях (ревизия классических догм) // Инфекция и иммунитет. 2011. T.1, № 3. С.199-206.

5. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. М.И. Перельмана. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2007. 512 с.

6. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

7. Патент RU № 2361212 «Способ прогнозирования течения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью у впервые выявленных больных», Н.А. Земляная, О.В. Филинюк, А.К. Стрелис, О.И. Уразова, Л.Н. Буйнова, О.В. Воронкова

8. Заявка RU № 2006136046/15 «Способ прогнозирования течения туберкулеза легких». Л.В. Бурухина, И.В. Перминова, М.С. Ждакаев, А.А. Шурыгин

9. Патент RU № 2434582 «Способ прогнозирования развития лекарственно-устойчивого туберкулеза легких». Е.Н. Стрельцова, Н.А. Степанова, С.А. Голубкина, опубликован 27.11.2011 (прототип).

10. Caminero J.A. Multidrug-resistant tuberculosis: epidemiology, risk factors and case finding // Intern. J. Tuberc. Lung Dis. 2010. V.14, No.4. P.382-390.

11. Do adaptive immune cells suppress or activate innate immunity? / J. Zhao, X. Yang, S. Aux [et al.] // Trends Immunol. 2008. V.30, No.1. P.8-12.

12. Multidrug and extensively drug-resistant ТВ (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response // WHO global report, 2010. 71 p.

13. Treatment outcome and mortality among patients with multidrug-resistant tuberculosis in tuberculosis hospitals of the public sector / D.S. Jeon, D.O. Shin, S.K. Park [et al.] // J. Korean Med. Sci. 2011. V.26, No.1. P.33-41.