способ определения летучих фитонцидов

Формула изобретения

Способ определения летучих фитонцидов, включающий подготовку пробы и дальнейшее количественное определение методом газожидкостной хроматографии с применением капиллярной колонки длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой в виде пленки толщиной 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, и масс-спектрометрический детектор, работающий при ионизации электронным ударом, отличающийся тем, что пропускают воздух со скоростью 40-100 мл/мин в течение 60-180 мин через склянку Дрекселя с этанолом, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм, анализируемую пробу вводят в испаритель хроматографа с капиллярной колонкой со стационарной фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилсилоксана, и масс-спектрометрическим детектором, работающим в режиме регистрации отдельных ионов (SIM-режиме), в качестве внутреннего стандарта используют -пинен.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к определению летучих фитонцидов в воздухе хвойного леса методом газожидкостной хроматографии.

В настоящее время существует ряд хроматографических методик анализа летучих веществ. В частности, известен способ определения содержания летучих хлорорганических соединений в сложных смесях [патент RU № 2219541, МПК G01N 30/02, опубл. 20.12.2003 г.], в котором анализируемую смесь пропускают в потоке газа-носителя через испаритель при 220-350°C, затем разделяют в капиллярной колонке хроматографа при 50-320°C, детектируют при 220-350°C в электронозахватном детекторе, в который дополнительно подают газ-носитель со скоростью 20 см /мин и регистрируют пики, далее определяют количественное и качественное содержание летучих хлорорганических соединений.

Недостатком данного способа является отсутствие предварительного концентрирования летучих хлорорганических соединений из сложных смесей, что не позволяет определять их состав при малых концентрациях.

Другим недостатком данного способа является то, что он применим лишь для хлорорганических соединений, так как электронозахватный детектор не регистрирует углеводороды, не имеющие в своем составе атомы хлора.

Известна двустадийная методика определения химического состава фитонцидов с использованием хромато-масс-спектрометрического анализа [Баженова СВ., Некрасова М.А. Физико-химические методы определения химического состава фитонцидов. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. - М., 2005. - С.62-66.]. Данная методика предусматривает определение фитонцидов, содержащихся в наземных частях растений (клеточный сок) и непосредственно выделяющихся в воздушную среду (вытяжка из воздуха). Отобранные пробы переводятся на сорбент и помещаются в хромато-масс-спектрометр. Результат исследования - хроматограммы химических веществ исследуемых растений.

Недостатком методики является отсутствие детального описания процесса концентрирования фитонцидов в воздухе на сорбент, отсутствует описание самого сорбента, нет данных о полноте такого концентрирования, а также отсутствуют данные о содержании отдельных фитонцидов в воздухе вышеуказанных растений. Кроме того низкая концентрация летучих фитонцидов может свидетельствовать о значительном проскоке фитонцидов через сорбент, а низкое качество хроматографического разделения может вносить значительную ошибку в количественном определении индивидуальных фитонцидов.

Техническим результатом изобретения является разработка способа идентификации и количественного определения летучих фитонцидов в воздухе.

Технический результат достигается тем, что в способе определения летучих фитонцидов, включающем подготовку пробы и дальнейшее определение методом газожидкостной хроматографии с применением капиллярной колонки длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой в виде пленки толщиной 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, и масс-спектрометрический детектор, работающий при ионизации электронным ударом, новым является то, что пропускают воздух со скоростью 40-100 мл/мин в течение 60-180 мин через склянку Дрекселя с этанолом, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм, анализируемую пробу вводят в испаритель хроматографа с капиллярной колонкой со стационарной фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилсилоксана, и масс-спеткрометрическим детектором, работающем в режиме регистрации отдельных ионов (SIM-режиме), в качестве внутреннего стандарта используют -пинен.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемый способ от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежных областей химии и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

Сущность способа заключается в следующем.

Летучие фитонциды являются одними из природных факторов, обуславливающих целебные свойства хвойного леса, его благоприятное воздействие на здоровье и самочувствие человека. Содержание фитонцидов составляет несколько мг/м³, что должно предполагать предварительное концентрирование воздуха в жидкие среды, например с использованием этанола, гексана или толуола, причем полнота улавливания летучих фитонцидов определяется объемом жидкой фазы, скоростью прокачки воздуха, и дальнейшее их определение с использованием очень чувствительного метода - газожидкостной хроматографии.

Хромато-масс-спектрометрическое определение фитонцидов в режиме регистрации полного ионного тока оказалось недостаточным для их надежной фиксации, однако при ионизации электронным ударом в режиме регистрации отдельных ионов (SIM-режиме) с использованием хроматографа типа «Agilent Technologies 7890А» с масс-спектрометрическим детектором «Agilent Technologies 5975 C» идентификация летучих фитонцидов оказалась весьма успешной.

Так, установлено, что в воздухе хвойного леса присутствуют: -пинен, камфен, сабинен, бета-пинен, 3-карен и лимонен + фелландрен. С использованием предварительной калибровки прибора по -пинену определена концентрация вышеуказанных фитонцидов.

Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 показана склянка Дрекселя с 50 мл этанола, через которую пропускают воздух хвойного леса; на фиг.2 - фрагмент хроматограммы спиртового концентрата, через который пропущено по 9 литров воздуха сосны обыкновенной (а) и пихты сибирской (б): 1 - -пинен, 2 - камфен, 3- сабинен, 4 - -пинен, 5-3 - карен, 6 - лимонен+фелландрен;

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 40-100 мл/мин в течение 60-180 мин при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) с внутренним диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм.

По окончании отбора раствор переносят в виалу объемом 1,5 мл, помещают в автосамплер хромато-масс-спектрометра, который автоматически вводит 1,0 мкл спиртового раствора фитонцидов в испаритель хроматографа с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором. Разделение фитонцидов осуществляется на капиллярной колонкой длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой в виде пленки толщиной 0,25 мкм, содержащей 5% дифенила и 95% диметилсилоксана, а регистрация фитонцидов осуществляется в масс-спектрометрическом детекторе Agilent Technologies 5975 С, работающем при ионизации электронным ударом в режиме регистрации отдельных ионов (SIM-режиме).

Режим работы хроматографа: начальная температура колонки 50°C в течение трех минут, затем программированный подъем температуры со скоростью 4°C в минуту до 270°C с выдержкой при конечной температуре 30 минут; температура испарителя 280°C; температура ионизационной камеры - 170°C; энергия ионизации - 70 эВ; газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин.

Обработку данных проводят известными методами [Ткачев А.В. Исследование летучих веществ растений. Новосибирск / А.В. Ткачев, 2008 - 969 с.]. Так, идентификацию летучих фитонцидов проводят сравнением времен удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными компонентов и чистых соединений, а также с использованием линейных индексов удерживания. Количественное содержание компонентов вычисляют по площадям пиков с использованием предварительной калибровке детектора хроматографа по альфа-пинену (альфа-пинен с чистотой 99,6 производства Sigma (фиг.2)).

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 40 мл/мин в течение 120 мин при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и 1 мкл анализируемой пробы вводят в испаритель хроматографа с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, снабженным капиллярной колонкой длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм со стационарной фазой в виде пленки толщиной 0,25 мкм, содержащей 5% дифенила и 95% диметилсилоксана, и работающем при ионизации электронным ударом в режиме регистрации отдельных ионов (SIM-режиме).

Режим работы хроматографа: начальная температура колонки 50°C в течение трех минут, затем программированный подъем температуры со скоростью 4°C в минуту до 270°C с выдержкой при конечной температуре 30 минут; температура испарителя 280°C; температура ионизационной камеры - 170°C; энергия ионизации - 70 эВ; газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин.

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 2. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 40 мл/мин в течение 180 мин при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 50 мл/мин в течение 60 минут при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 4. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 50 мл/мин в течение 120 минут при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 5. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 50 мл/мин в течение 180 минут при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 1,2.

Пример 6. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 100 мл/мин в течение 60 минут при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм). По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 7. Пропускают воздух хвойного леса со скоростью 100 мл/мин в течение 120 минут при помощи аспиратора АПВ-4-12 В-4 через склянку Дрекселя (фиг.1) диаметром 30 мм с 50 мл 96% этанола, для получения столба поглощающей жидкости не менее 40 мм. По окончании отбора раствор переносят в виалу и осуществляют хроматографирование согласно примеру 1.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 1
Индивидуальный состав летучих фитонцидов в воздухе хвойного леса, определенный непосредственно у дерева в феврале месяце 2012 года (скорость подачи воздуха через 50 мл этанола - 50 мл/мин в течение 180 минут)
№ п/п	Компонент воздуха	Состав воздуха пихты сибирской, мг/м3	Состав воздуха сосны обыкновенной, мг/м3	Состав воздуха сосны сибирской, мг/м3
1	-пинен	7,06	3,71	60,79
2	Камфен	12,27	0,13	3,07
3	Сибинен	1,56	1,41	19,50
4	-пинен	-*	0,77	2,93
5	3-карен	2,39	0,47	2,06
6	лимонен + фелландрен	2,30	1,88	40,14
ИТОГО:		25,58	8,37	128,49
* - не обнаружен (проведенные исследования показали, что нижний предел обнаружения в SIM-режиме составляет ~0,3 мкг/м3).

Таблица 2
Данные по хроматографическому анализу суммарного содержания фитонцидов в 50 мл этанола в зависимости от скорости и времени пропускания воздуха.
Скорость пропускания воздуха, мл/мин	Суммарное содержание фитонцидов, мг/м
	Время пропускания воздуха 60 мин.	Время пропускания воздуха 120 мин.	Время пропускания воздуха 180 мин.
40	16,66	25,62	25,39
50	23,66	24,45	25,58
100	12,35	14,62	14,87

Установлено, что оптимальной скоростью подачи воздуха через жидкий реагент является скорость порядка 50 мл/мин, которая не вызывает выноса жидкой фазы и является достаточной для полного улавливания всех летучих фитонцидов в воздухе хвойного леса.

Минимальный объем жидкой фазы, достаточный для полного улавливания фитонцидов в случае этанола, составляет 50 мл, обеспечивающий высоту поглощающей жидкости не менее 40 мм.

Использование заявляемого изобретения открывает возможность идентификации и количественного определения летучих фитонцидов как в лесном воздухе, так и в воздухе рабочих зон и закрытых помещений.

Способ отличается простотой технологического оформления методики, сокращает продолжительность и трудоемкость пробоподготовки, и позволяет определять концентрации отдельных летучих фитонцидов в присутствии любых дикорастущих или интрадуцированных растений древесного или недревесного происхождения.