способ определения антител к mycobacterium leprae

Формула изобретения

Способ определения антител к Mycobacterium leprae на основе выявления в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae, включающий иммуноферментный метод, отличающийся тем, что в качестве тест-антигена в иммуноферментном анализе используют водную суспензию из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37°C Mycobacterium lufu, прогретую при 100°C в течение 1,5 часов на водяной бане.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и, в частности, может быть использовано для определения специфических антител к M.leprae.

Из практики медицины известен способ обнаружения антител к M.leprae в сыворотке крови больных лепрой с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве тест-антигена используются водорастворимые белки из лепром человека (Alonso S.M., Mangiaterra M.L., Szarfman A. La reaccion de immunoperoxidasias in directa aplicata a la lepra humana // Medicina (Argent). - 1978. - Vol.38. - № 63. - Р.541-544.)

Способ позволяет обнаруживать антитела к M.leprae и осуществлять контроль динамики гуморального ответа у больных лепрой.

Недостатком способа является сложность его осуществления, обусловленная травматичностью метода получения антигенного материала, путем взятия биоптатов из кожных поражений больных лепрой людей. Кроме того, даже при распространенных процессах концентрации M.leprae в кожных лепромах больных лепроматозной лепрой для получения диагностикума явно недостаточно, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Известен способ обнаружения антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови больных лепрой на основе твердофазного иммуноферментного анализа, где в качестве тест-антигена используется препарат из M.leprae, полученный из тканей экспериментально зараженных девятипоясных броненосцев (Stranford J.L., Rook G.A.W., Samuel N., Madlener F., Khamenei A.A., Nemati Т., Modabber F., Rees R.S.W. // Preliminary immunological studies in search of correlates of protective immunity carried out on some Iranian leprosy patients and their families-Lepr. Rev., 1980. - Vol.51. - № 4. - P.303-314). Способ позволяет выявлять специфические антитела к M.leprae в сыворотке крови у больных лепрой, а также у лиц, находящихся в тесном семейном контакте с больными лепрой. Недостатком способа является сложность, заключающаяся в необходимости воспроизведения на броненосцах экспериментальной лепрозной инфекции, которая развивается в течение 2-5 лет. Броненосцы имеют ограниченный ареал обитания (Южная Америка), не размножаются в неволе и требуют особых условий содержания. Получение M.leprae из тканей броненосца предусматривает использование многоэтапного метода очистки, что в свою очередь повышает стоимость и усложняет процесс получения антигенного препарата, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Существует способ обнаружения антител к M.leprae методом ИФА в сыворотке крови человека при лепре, где в качестве специфического тест-антигена используется препарат из M.leprae, пассируемых на мышах и крысах (Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Ющенко A.A. Диагностические тест-системы на основе иммуноферментного метода при лепре // Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиологии. - M., Медицина, 1985. - № 1. - С.64-68). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотках крови больных лепрой, причем уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса.

К недостаткам известного способа относятся сложность, заключающаяся в многоэтапности и трудоёмкости осуществления способа, длительность моделирования инфекционного процесса на экспериментальных животных (1,5-2 года), необходимость выделения возбудителя и его очистки от тканей организма животных для дальнейшего использования в качестве антигена, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Существует способ обнаружения антител к M.leprae методом ИФА в сыворотке крови человека при лепре, где в качестве специфического тест-антигена используется препарат из культивируемых M.lufu, разрушенных ультразвуком (Пат. № 2124730 Способ диагностики лепры / М.Ю.Юшин, М.Н.Дячина, О.В.Дегтярев, О.В.Калянина // Открытия. Изобретения. - 1999. - № 1). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотках крови больных лепрой, причем уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса.

Недостатком известного способа является наличие в полученном методом ультразвуковой дезинтеграции антигене M.lufu видоспецифических и группоспецифических компонентов микобактерий, что снижает специфичность метода определения антител к М.leprae, а также сложность, заключающаяся в необходимости использования метода ультразвуковой дезинтеграции микобактерий, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения антител к M.leprae в сыворотке крови с помощью Dis-BSA, который является синтетическим аналогом специфического углеводного эпитопа M.leprae - фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) (Cho S.N., Fujiwara Т., Hunter S.W., Rea Т.Н., Gelber R.H., Brennan P.J. Use of an artifical antigen containing the 3,6-di-O-methyl- -O-glycopyranosyl epitope for the serodiagnosis of leprosy // J. Infect. Dis, 1984. - Vol.140. - P.311-322). Способ позволяет выявлять в сыворотках крови больных лепрой антитела к видоспецифическому антигену M.leprae - ФГЛ-1. Уровень антител коррелирует с клиническими проявлениями болезни.

Недостатками способа являются:

- сложность осуществления органического синтеза искусственного антигена - Dis-BSA, поскольку требуется специальное оснащение и персонал соответствующей квалификации;

- ограниченные возможности тест-системы, связанные с выявлением антител лишь к ФГЛ-1, а антитела к данному антигену быстро исчезают под влиянием специфического лечения, через 1-1,5 года после начала химиотерапии они не определяются, в то время как у большинства больных лепрой в эти сроки отмечается присутствие M.leprae в коже и выявляются антитела в сыворотке крови к другим антигенным компонентам M.leprae.

Перечисленные недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известный способ принят авторами в качестве прототипа.

Сходство предлагаемого способа с известным заключается в том, что они оба относятся к медицине, а именно к лепрологии, и основаны на выявлении в сыворотках крови антител к M.leprae.

Задачей предлагаемого изобретения является упрощение способа определения антител к M.leprae.

Поставленная задача в изобретении достигается тем, что в иммуноферментном анализе используют водную суспензию из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37°С Mycobaterium lufu, прогретую при 100°С в течение 1,5 часов на водяной бане с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут и применяют надосадочную жидкость в качестве тест-антигена.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что в известных способах определения антител к M.leprae антиген из M.lufu, подвергнутых термической обработке, не применялся.

Применение M.lufu, подвергнутых термической обработке, в качестве тест-антигена является существенным отличием в подходе к определению антител к M.leprae, и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде упрощения способа. Кроме того, предлагаемый способ позволяет отказаться от использования в качестве антигена Dis-BSA, получение которого требует специальных методических приемов и персонала соответствующей квалификации.

Авторы исходили из уже известных фактов о том, что термическая обработка исходного материала для приготовления тест-антигена позволяет инактивировать группоспецифические белковые компоненты при сохранении видоспецифических компонентов, представленных полисахаридами, а также способствует повышению агрегационных свойств антигена (Фримель X. Иммунологические методы // М., «Мир» 1979. - 518 с.). Кроме того, известно, что белки теплового шока бактерий и белки теплового шока человека являются фактором, обуславливающим перекрестные иммунологические реакции между антигенами бактерий и человека. Следовательно, их присутствие в антигенных препаратах нежелательно (Баснакьян И.А., Михайлова Н.А., Мельникова В.А., Арзуманян А.О. Стрессовые белки бактерий при болезнях человека // Иммунология 2010. - Т.-31, № 6 - С.304-310).

Одной из основных задач современной лепрологии является разработка тестов, позволяющих диагностировать заболевание на ранней стадии его развития. Однако до настоящего времени не существует сертифицированных тест-систем, позволяющих осуществлять серологическую диагностику лепры. Диагностика лепры осуществляется на основании клинических проявлений заболевания и оценки гистологической картины кожных поражений.

Существующие тест-системы не используются для постановки диагноза лепры, а применяются лишь для оценки эффективности проводимой специфической терапии и доклинического определения возникновения рецидивов заболевания у больных лепрой. Это связано с тем, что не только у больных лепрой, но и у доноров крови определяются антитела к антигенам M.leprae. У доноров крови они определяются как к комплексным антигенам (соникатам M.leprae, M.lufu), так и к специфическим антигенам - фенольному гликолипиду-1 (ФГЛ-1) и его синтетическому аналогу - Dis-BSA.

Применение M.lufu, подвергнутых термической обработке, в качестве тест-антигена является существенным отличием в подходе к определению антител к M.leprae, и именно это отличие позволяет получить положительный эффект в виде упрощения способа. Кроме того, предлагаемый способ не требует использования в качестве тест-антигена Dis-BSA, специальных методических приемов и персонала соответствующей квалификации.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Используют тест-антиген - водную суспензию культивируемых M.lufu, прогретую при 100°C в течение 1,5 часов на водяной бане.

Используемый в качестве тест-антигена штамм M.lufu культивируют на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37°C. Бактериальную массу со среды снимают бактериологической петлей и переносят в пробирку с дистиллированной водой, тщательно перемешивают пипетированием для получения гомогенной взвеси. Термическую обработку бактериальной взвеси проводят на кипящей водяной бане в течение 1,5 часов. Прогретую микобактериальную суспензию охлаждают при комнатной температуре и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость собирают, определяют в ней концентрацию белка по методу Лоури и используют в качестве тест-антигена (Lowry O.H., Rosebrough N.J., FarrL., Randall R.J. Protein measure ment with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.193, № 1 - Р.265-275).

Штамм M.lufu предоставлен в 1981 году НИИ по изучению лепры проф. J.K.Seydel (ФРГ).

Известно, 410 М.lufu по ряду биологических свойств - сульфоночувствительности, наличию ДОФА-оксидазной активности и специфических антигенных детерминант, выявляемых моноклональными антителами к антигенам M.leprae, образованию во внутренних органах экспериментальных животных макрофагальных гранулем с наличием большого количества внутриклеточно расположенных кислотоустойчивых микобактерий и т.д., близки к M.leprae (Юшин М.Ю. Биологические параллели Mycobaterium leprae и Mycobaterium lufu // Вестник дерматологии и венерологии. - 2007. - № 6. - С.37-41).

Для выполнения иммуноферментного анализа используют тест-антиген из M.lufu, подвергнутых термической обработке при 100°C в течение 1,5 часов. Постановку ИФА осуществляют на полистироловых планшетах для иммунологических реакций однократного применения («Медполимер», г.Санкт-Петербург ТУ 64-2-375-86). Лунки полистиролового планшета сенсибилизируют прогретым антигеном из M.lufu в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,25±0,25 (1,18 г Na₂CO₃; 3,47 г NaHCO₃ и 0,2 г NaN₃ в 1 л дистиллированной воды) из расчета 80 мкг/мл прогретого антигена из M.lufu в объеме 0,1 мл на 1 лунку (18 часов при +4°C). Затем планшет отмывают 3 раза по 0,3 мл 0,02 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,4) с добавлением 0,05% твина-20 с помощью автоматического промывателя планшет (ПП2 428, г.Дубна). В лунки планшета вносят исследуемые сыворотки больных лепрой и доноров крови. Сыворотки разводят 1:3 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) с 0,05% твина-20. Каждый образец сыворотки в объеме 0,1 мл вносят в 2 лунки. Отрицательным контролем служат 4 лунки, в которые вносят 0,02 М фосфатно-солевой буфер (pH 7,4) с 0,05% твина-20. Планшет инкубируют при 37°C 1 час, после чего повторяют процесс отмывки 0,02 М фосфатно-солевым буфером с 0,05%) твина-20. Затем в каждою лунку добавляют по 0,1 мл конъюгата кроличьих антител к IgG человека, меченных пероксидазой хрена (Mere, Германия), в разведении 1:2000 и инкубируют 1 час при 37°C. После пятикратной отмывки 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) с 0,05% твина-20 и двукратной дистиллированной водой вносят субстратную смесь - 0,4 мг/мл ортофенилендимина (ОАО «Шосткинский завод химических реактивов») и 0,03% перекиси водорода. Планшет выдерживают при комнатной температуре в темноте 20 мин, после чего ферментативную реакцию останавливают внесением в каждую лунку 0,05 мл 2М H₂SO₄ .

Учет результатов осуществляют на фотометре иммуноферментном планшетном (ЭФОС 9305 ОАО «МЗ «Сапфир») при длине волны 492 нм.

За положительный результат считают образцы, показатель оптической плотности (ОП₄₉₂) которых в 2,1 и более раз превышает показатель отрицательного контроля.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России в 2010-2011 годах.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей, где представлены результаты ИФА сывороток крови доноров (с № 1 по № 88) и сывороток больных лепрой (с № 89 по № 133) при использовании тест-антигена из M.lufu, подвергнутых термической обработке, и для сравнения приводятся результаты исследования этих же сывороток методом ИФА с использованием в качестве тест-антигена Dis-BSA, как наиболее близкого способа.

Результаты ИФА сывороток крови доноров крови и больных лепрой при использовании предлагаемого способа с тест-антигеном из термически обработанных M.lufu и наиболее близкого способа с тест-антигеном Dis-BSA

п/п	№ сыворотки	ОП492 (АГ M.lufu)		M.lufu ср	ОП492 (АГ Dis-BSA)		Dis-BSA ср
1	2	3		4	5		6
1	102707	0,49	0,39	0,44	0,18	0,07	0,13
2	102722	0,12	0,08	0,1	0,09	0,13	0,11
3	102726	0,32	0,47	0,4	1,18	0,56	0,87
4	102717	0,32	0,34	0,33	0,14	0,13	0,14
5	102719	0,56	0,41	0,49	0,3	0,35	0,33
6	102718	0,72	0,7	0,71	0,34	0,33	0,34
7	102721	0,27	0,3	0,29	0,27	0,28	0,28
8	102724	1,78	1,66	1,72	0,91	0,88	0,9
9	102706	0,3	0,42	0,36	0,73	0,7	0,72
10	100529	0,78	0,74	0,76	0,26	0,19	0,23

1	2	3		4	5		6
11	200344	0,19	0,25	0,22	0,15	0,14	0,15
12	200341	0,4	0,36	0,38	0,15	0,16	0,16
13	100528	0,86	0,84	0,85	0,42	0,24	0,33
14	400170	0,55	0,7	0,63	0,24	0,27	0,26
15	102708	0,99	1,01	1	0,32	0,21	0,27
16	102711	0,52	0,52	0,52	0,42	0,44	0,43
17	202743	0,28	0,3	0,29	0,19	0,19	0,19
18	200345	0,75	0,7	0,73	0,46	0,45	0,46
19	202744	0,28	0,29	0,29	0,27	0,29	0,28
20	102713	0,44	0,44	0,44	0,51	0,47	0,49
21	102705	0,71	0,81	0,76	0,69	0,8	0,75
22	102710	0,45	0,42	0,44	0,66	0,66	0,66
23	202742	0,46	0,46	0,46	0,4	0,36	0,38
24	370861	0,08	0,07	0,08	0,08	0,08	0,08
25	370870	0,18	0,14	0,16	0,18	0,2	0,19
26	193542	0,22	0,18	0,2	0,26	0,25	0,26
27	370868	0,03	0,04	0,04	0,06	0,06	0,06
28	436155	0,11	0,1	0,11	0,07	0,08	0,08
29	436154	0,07	0,06	0,07	0,09	0,09	0,09
30	370874	0,21	0,2	0,21	0,48	0,53	0,51
31	193520	0,12	0,13	0,13	0,1	0,11	0,11
32	303090	0,19	0,2	0,2	0,06	0,01	0,04
33	290486	0,16	0,13	0,15	0,21	0,21	0,21
34	365808	0,06	0,06	0,06	0,15	0,13	0,14
35	193539	0,13	0,11	0,12	0,25	0,27	0,26
36	436159	0,04	0,05	0,05	0,13	0,16	0,15
37	370867	0,93	0,8	0,87	0,72	0,67	0,7
38	125005	0,04	0,08	0,06	0,08	0,06	0,07
39	424726	0,05	0,06	0,06	0,16	0,15	0,16
40	290475	0,18	0,19	0,19	0,13	0,14	0,14
41	370875	0,06	0,06	0,06	0,07	0,06	0,07
42	193543	0,1	0,1	0,1	0,12	0,1	0,11
43	205816	0,79	0,79	0,79	0,42	0,44	0,43
44	424722	0,06	0,06	0,06	0,09	0,08	0,09
45	125006	14	0,13	0,14	0,02	0,02	0,02
46	193534	0,06	0,06	0,06	0,04	0,05	0,05
47	436156	0,38	0,44	0,41	0,11	0,11	0,11
48	436113	0,27	0,22	0,25	0,41	0,44	0,43
49	436121	0,16	0,16	0,16	0,06	0,07	0,07
50	290377	0,04	0,04	0,04	0,11	0,08	0,01
51	370787	0,04	0,04	0,04	0,05	0,05	0,05
52	370800	0,09	0,09	0,09	0,07	0,07	0,07

1	2	3		4	5		6
53	290359	0,09	0,14	0,12	0,06	0,06	0,06
54	370792	0,16	0,11	0,14	0,1	0,08	0,09
55	370782	0,05	0,05	0,05	0,04	0,04	0,04
56	290371	0,16	0,16	0,16	0,06	0,06	0,06
57	370786	0,05	0,05	0,05	0,06	0,05	0,06
58	290388	0,05	0,04	0,05	0,04	0,04	0,04
59	370801	0,06	0,07	0,07	0,47	0,5	0,49
60	436119	0,06	0,05	0,06	0,09	0,09	0,09
61	370798	0,15	0,14	0,15	0,11	0,09	0,1
62	303067	0,05	0,06	0,06	0,22	0,21	0,22
63	436115	0,06	0,05	0,06	0,07	0,06	0,07
64	290367	0,05	0,05	0,05	0,08	0,08	0,08
65	290379	0,06	0,07	0,07	0,07	0,06	0,07
66	436112	0,26	0,23	0,25	0,25	0,24	0,25
67	370790	0,05	0,05	0,05	0,1	0,1	0,1
68	290370	0,09	0,09	0,09	0,05	0,05	0,05
69	290385	0,2	0,21	0,21	0,45	0,5	0,48
70	436114	0,09	0,09	0,09	0,06	0,06	0,06
71	290380	0,06	0,06	0,06	0,05	0,05	0,05
72	370791	0,36	0,36	0,36	0,43	0,41	0,42
73	370797	0,63	0,62	0,63	0,36	0,41	0,39
74	193413	0,69	0,58	0,64	0,65	0,6	0,63
75	193428	0,63	0,58	0,61	0,83	0,73	0,78
76	424711	0,49	0,5	0,5	0,53	0,42	0,48
77	290378	0,38	0,36	0,37	0,29	0,39	0,34
78	290358	0,84	0,83	0,84	0,35	0,33	0,34
79	290390	0,44	0,47	0,46	0,48	0,53	0,51
80	193424	0,93	0,93	0,93	1,1	0,82	0,96
81	193407	1,12	1,43	1,28	1,21	1,05	1,13
82	193411	0,39	0,35	0,37	0,25	0,28	0,27
83	193420	0,31	0,35	0,33	0,42	0,32	0,37
84	193422	0,27	0,25	0,26	0,31	0,33	0,32
85	290364	0,23	0,22	0,23	0,3	0,31	0,31
86	290362	0,29	0,33	0,31	0,37	0,35	0,36
87	370785	0,37	0,42	0,4	0,22	0,22	0,22
88	370789	0,37	0,37	0,37	0,37	0,36	0,37
89	8398	0,21	0,23	0,22	0,59	0,46	0,53
90	8399	0,57	0,57	0,57	1,22	1,19	1,21
91	8400	0,19	0,17	0,18	0,19	0,15	0,17
92	8366	0,42	0,48	0,45	0,1	0,14	0,12
93	8365	0,09	0,09	0,09	0,02	0,03	0,03
94	8377	0,08	0,09	0,09	0,17	0,1	0,14

1	2	3		4	5		6
95	8361	0,03	0,03	0,03	0,02	0,02	0,02
96	8331	0,05	0,05	0,05	0,01	0,01	0,01
97	8323	0,14	0,19	0,17	0,08	0,08	0,08
98	8374	0,12	0,13	0,13	0,02	0,02	0,02
99	8378	0,07	0,08	0,08	0,04	0,05	0,05
100	8356	0,11	0,13	0,12	0,12	0,12	0,12
101	8387	0,02	0,03	0,03	0,03	0,02	0,03
102	8388	0,05	0,04	0,05	0,05	0,04	0,05
103	8389	0,03	0,03	0,03	0,01	0,01	0,01
104	8390	0,01	0,02	0,02	0,04	0,05	0,05
105	8391	0,01	0,02	0,02	0,05	0,05	0,05
106	8392	0,01	0,01	0,01	0,01	0,02	0,02
107	8393	0,04	0,05	0,05	0,04	0,02	0,03
108	8394	0,03	0,03	0,03	0,02	0,02	0,02
109	8395	0,01	0,02	0,02	0,02	0,03	0,03
110	8385	0,1	0,09	0,1	0,39	0,35	0,37
111	8344	0,15	0,12	0,14	0,23	0,2	0,22
112	8363	0,07	0,07	0,07	0,04	0,02	0,03
113	8364	0,09	0,09	0,09	0,12	0,12	0,12
114	8367	0,13	0,19	0,16	0,12	0,13	0,13
115	8372	0,18	0,18	0,18	0,1	0,08	0,09
116	8375	0,12	0,08	0,1	0,04	0,05	0,05
117	8333	0,21	0,22	0,22	0,09	0,12	0,11
118	8334	0,09	0,09	0,09	0,06	0,08	0,07
119	8377	0,23	0,16	0,2	0,18	0,13	0,16
120	8339	0,41	0,5	0,46	0,12	0,09	0,11
121	8345	0,34	0,48	0,41	0,11	0,11	0,11
122	8347	0,14	0,08	0,11	0,07	0,09	0,08
123	8348	0,07	0,07	0,07	0,15	0,1	0,13
124	8350	0,19	0,2	0,2	0,04	0,04	0,04
125	8351	0,05	0,06	0,06	0,11	0,07	0,09
126	8352	0,11	0,16	0,14	0,06	0,07	0,07
127	8353	0,14	0,19	0,17	0,15	0,1	0,13
128	8354	0,17	0,13	0,15	0,4	0,42	0,41
129	8357	0,27	0,27	0,27	0,08	0,07	0,08
130	8358	0,08	0,08	0,08	0,14	0,15	0,15
131	8318	0,08	0,09	0,09	0,04	0,04	0,04
132	8325	0,18	0,25	0,22	0,43	0,39	0,41
133	8327	0,12	0,11	0,12	0,15	0,11	0,13
Примечание: № 1- № 88 - сыворотки доноров;
№ 89- № 133 - сыворотки больных лепрой.

Таким образом, из таблицы видно, что результаты ИФА с использованием в качестве тест-антигенов M.lufu, подвергнутых термической обработке, и Dis-BSA коррелируют между собой.

Коэффициент корреляции r=0,72.

Предлагаемый способ позволяет достичь упрощения определения в ИФА антител класса IgG к M.leprae, поскольку в качестве источника тест-антигена используют культивируемые M.lufu, и его приготовление не требует применения специального оборудования.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения.