тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга 14-го серотипа методом от-пцр в режиме реального времени

Формула изобретения

Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):

14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA

14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1

14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генодиагностики, а именно для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа.

Блютанг - инфекционная, неконтагиозная вирусная болезнь широкого спектра домашних и диких жвачных, в настоящее время определенная МЭБ как значительная социально-экономическая проблема, создающая большие трудности для международной торговли животными и продуктами животноводства [1].

Заболевание вызывает вирус блютанга, который является одним из видов рода Orbivirus, семейства Reoviridae [2]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерологии аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].

В настоящее время известно о существовании 26-ти генетических вариантов вируса, 25 из которых в антигенном отношении представляют различные серотипы вируса. Данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более трехсот вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.

С того момента как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Все тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью настоящего изобретения является создание тест-системы для РНК обнаружения вируса блютанга 14-го серотипа в пробах биологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система для обнаружения генома вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA

14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1

14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC

Техническим результатом изобретения является возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серотипспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить геном вируса блютанга 14-го серотипа. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение серотипспецифической системы олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ серотипспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.

Таблица 1
Серотипспецифические праймеры и ДНК-зонд для выявления генома вируса блютанга 14-го серотипа
ПЦР- мишень	праймер/ДНК-зонд	нуклеотидная последовательность 5'-3'	локализация (RSArrrr/14 ,AJ585135)
2 сегмент	14/2/qf	gCT gTC ggg TAT Agg TAg gA	854-873
	14/2/z	FAM - gTg AAC gTg ggg TCA TCT TCA С - BHQ1	967-988
	14/2/qr	ACg TgT CCg ATg CTg СТА TC	1037-1056

Пример конкретного выполнения

Обнаружение РНК вируса блютанга 14-го серотипа в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо заморозить смесь после денатурации, поместив пробирки в штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл (40 ед) MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки после денатурации вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30 минут. После окончания реакции препарат кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР в режиме реального времени

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры 95°С - 3 мин

2. Циклирование 95°С - 10 с

60°С - 20 с

72°С - 15 с

Цикл повторить 5 раз

3. Циклирование с детекцией 2

95°С - 10 с

60°С - 20 с - Детекция

72°С - 15 с

Цикл повторить 40 раз

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 60°С.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения Q в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов
№ № проб	Характеристика биоматериала	Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1	культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (A J5 8 5122) референтный штамм	-
2	культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм	-
3	культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм	-
4	культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм	-
5	культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм	-
6	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм	-
7	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм	-
8	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм	-
9	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм	-
10	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм	-
11	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм	-
12	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм	-
13	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм	-
14	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм	+
15	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ5 85136) референтный штамм	-
16	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ5 8 513 7) референтный штамм	-
17	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ5 85138) референтный штамм	-
18	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139) референтный штамм	-
19	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм	-
20	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (A J5 8 5141) референтный штамм	-
21	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142) референтный штамм	-
22	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм	-
23	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144) референтный штамм	-
24	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145) референтный штамм	-
25	культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642)	-
26	кровь ягненка, экспериментально инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа, 90-е сутки после заражения	+
27	кровь крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа	+
28	интактная культура клеток Vero	-
29	интактная культура клеток ВНК-21	-
30	кровь от интактного животного (корова)	-
31	кровь от интактного животного (овца)	-
32	культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип	-

Таким образом, разработана тест-система, позволяющая с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием системы обнаруживать вирус блютанга 14-го серотипа.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

высокая специфичность и чувствительность тест-системы для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга 14-го серотипа;

- быстрота проведения анализа благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации серотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe:

results of a two month longitudinal study/ C.Saegerman, A.Mauroy, H.Guyot// Renc. Rech. Ruminants.-2007.-Vol.l4.-P.215.

2. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiol Immunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens// J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode/ P. P. C. Mertens, F. Brown, D. V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. -P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments/ J. F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Methods. - 2007. -Vol.140. -P. 115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment I/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Journal ofVirological Methods. - 2007. -Vol.145. -P. 115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1 description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq// Transbound Emerg Dis. - 2009. - Vol,56(9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ В. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer// Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P. 2992-2994.