способ получения бактериального препарата для профилактики послеродового эндометрита у крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ получения бактериального препарата для профилактики послеродового эндометрита у крупного рогатого скота, включающий использование культур лактобацилл и лактококков, отличающийся тем, что для приготовления препарата готовят питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) согласно инструкции по применению, к полученному бульону добавляют 3% крахмала, предварительно растворенного в небольшом количестве охлажденного полученного бульона, а затем смешивают с остальным бульоном СПБ, бульон доводят до кипения, кипятят до получения однородной прозрачной массы, после этого в среду добавляют 0,125% NaCl и 2% глюкозы до рН 6-7, затем вносят фосфатный буфер: однозамещенный 0,8% калий КН₂РО₄ и 0,18% двузамещенный калий или натрий К₂НРО₄, или Na₂HPO ₄, раствор кипятят в течение 15 мин и после остывания добавляют 0,5% восьмидесятипроцентной молочной кислоты, фильтруют и автоклавируют при 0,5 атм в течение 30-40 мин, после остывания в раствор в стерильных условиях вносят приготовленные культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ по 1 млрд микробных клеток на 100 мл среды, расфасовывают и термостатируют 48 ч при t=37°C.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено, в частности, для профилактики послеродовых эндометритов у коров. Заявители предлагают полученный препарат назвать «Гипролам».

Известны способы профилактики эндометрита у коров антибиотиками и комплексными препаратами, такими как эндометромаг, рихометрин, тетрасолвин, содержащими в своем составе различные антибиотические, сульфаниламидные и другие лекарственные средства. Однако широкое и продолжительное использование таких препаратов в ветеринарии и медицине приводит к появлению устойчивых штаммов микрофлоры к данным средствам и, как следствие, в дальнейшем отсутствие положительного эффекта. Также применение антибиотических, сульфаниламидных и нитрофурановых препаратов дорогостояще и их использование при профилактике послеродового эндометрита у коров ухудшает качество молока и молочной продукции (Гончаров В.П. Профилактика и лечение гинекологических заболеваний у коров. - М., 1981. - С.107-121; Коромыслов Г.Ф.).

Ближайшим аналогом по механизму действия к предложенному изобретению является препарат «Биосан», который представляет собой смесь культур Lactobacillus plantarum (Киров-1) и Lactobacillus buchneri (Киров-4), выращенных на жидкой питательной среде, представляющей собой мясопептонный бульон (МПБ) с экстрактом и кусочками печени крупного рогатого скота. Для приготовления "Биосана" берут свежую печень крупного рогатого скота, разрезают на кусочки, заливают равным количеством водопроводной воды и варят в течение часа. Экстракт фильтруют и смешивают с мясопептонным бульоном (МПБ) из расчета 1 часть печеночного экстракта на 3 части бульона. Туда же добавляют 0,125% поваренной соли NaCl и 2% глюкозы до рН 6-7, затем вносят фосфатный буфер: однозамещенный 0,8% калий KH₂PO₄ и 0,18% двузамещенный калий или натрий K₂HPO₄ или Na₂HPO ₄, раствор кипятят в течение 15 минут. Среду фильтруют, добавляют кусочки печени и автоклавируют. В готовую среду стерильно вносят по 1 мл маточной расплодки L. plantarum и L. Buchneri из расчета на 100 мл питательной среды. Флаконы термостатируют 48 часов при 37°С (Варганов А.И. Опекунов К.А. Патент № 2102075 «Способ получения бактериального препарата «Биосан»).

Технология приготовления «Биосана» является дорогостоящей, так как для изготовления 10 литров «Биосана» необходимо 2 кг мяса говядины, 3 кг печени, производство его занимает длительное время, которое необходимо на приготовление МПБ и самой среды для лактобактерий, также недостаток этого препарата в том, что он имеет малый срок хранения - 20 дней со дня изготовления.

Задача: разработать способ получения бактериального препарата, обеспечивающего достаточную эффективность профилактики послеродовых эндометритов у коров и свести к минимуму использование химиотерапевтических средств, а также снизить себестоимость и увеличить срок хранения препарата.

Сущностью изобретения получения бактериального препарата для профилактики послеродового эндометрита у крупного рогатого скота, включающего использование культур лактобацилл и лактококков, отличающегося тем, что для приготовления препарата готовят питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) согласно инструкции по применению, к полученному бульону добавляют 3% крахмала, предварительно растворенного в небольшом количестве охлажденного полученного бульона, а затем смешивают с остальным бульоном СПБ, бульон доводят до кипения, кипятят до получения однородной прозрачной массы, после этого в среду добавляют 0,125% NaCl и 2% глюкозы до рН 6-7, затем вносят фосфатный буфер: однозамещенный 0,8% калий KH₂PO ₄ и 0,18% двузамещенный калий или натрий K₂HPO ₄ или Na₂HPO₄, раствор кипятят в течение 15 мин и после остывания добавляют 0,5% восьмидесятипроцентной молочной кислоты, фильтруют и автоклавируют при 0,5 атм в течение 30-40 мин, после остывания в раствор в стерильных условиях вносят приготовленные культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ по 1 млрд микробных клеток на 100 мл среды, расфасовывают и термостатируют 48 часов при t=37°C.

Полученный препарат представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с сероватым осадком на дне флакона. Осадок легко разбивается при встряхивании.

Технический результат: предлагаемый способ позволяет снизить себестоимость его получения по сравнению с базовым препаратом (биосан) на 60%, исключить использование антибиотиков и их производных, сульфаниламидов, нитрофуранов и таким образом исключить побочное действие препарата на организм животных. Эффективность использования гипролама не уступает эффективности использования биосана.

В 1 см³ препарата содержится не менее 1×10 ⁸ КОЕ (колониеобразующих единиц) живых микроорганизмов и препарат имеет кислотность 120-140°Т.

Проведенные исследования показали, что культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ способны приживаться в родополовых путях у коров на 20 дней и проявлять антагонистическое действие на находящуюся в матке условно-патогенную микрофлору (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia) и др.

Экспериментальное обоснование

Для обоснования решаемых задач была проведена апробация на 56 коровах. Оплодотворилось 100% коров, сервис период составил 92 дня (см. таблицу).

Таблица сопоставительного анализа результатов использования предложенного средства для профилактики послеродовых эндометритов у коров
Показатели	Отрицательный контроль	Профилактика препаратом тетрасолвин	Предложенный способ
Количество коров	56	30	56
Заболеваемость	53,5%	33,3%	14,3%
Профилактический эффект	-	66,6%	85,7%
Оплодотворяемость	68%	79%	100%
Сервис период (дни)	125	112	92

Способ осуществляют следующим образом. Для приготовления новой среды берут питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) и готовят согласно инструкции, так как данная среда не требует большого расхода на 1 литр воды и является хорошей селективной средой для молочнокислых бактерий, в несколько раз дешевле МПБ (мясопептонного бульона) и, кроме того, не требует трудоемкого приготовления. Для образования молочной кислоты, необходимой для поддержания кислой среды во влагалище коров, лактобактериям необходим гликоген, в качестве источника гликогена берут его растительный аналог - крахмал. В полученный бульон добавляют 3% крахмала, предварительно растворенного в небольшом количестве охлажденного бульона. В полученный раствор добавляют 2% глюкозы, 0,125% NaCl поваренной соли. Раствор стабилизируется фосфатным буфером: однозамещенный 0,8% калий KH₂PO ₄ и 0,18% двузамещенный калий или натрий K₂HPO ₄ или Na₂HPO₄, раствор кипятят в течение 15 мин и после остывания добавляют 0,5% восьмидесятипроцентной молочной кислоты, фильтруют и автоклавируют при 0,5 атм в течение 30-40 мин, для создания базовой кислотности добавляют 0,5% восьмидесятипроцентной молочной кислоты. После остывания в раствор в стерильных условиях вносят приготовленные культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ по 1 млрд микробных клеток на 100 мл среды, расфасовывают и термостатируют 48 часов при t=37°C.

Пример 1:

Был взят селективный питательный бульон СПБ и приготовлен согласно инструкции. В него добавлено 3% крахмала, после стерилизации среды в нее внесли приготовленные культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ по 1 млрд микробных клеток на 100 мл среды, расфасовали и термостататировали 48 часов при t=37°C. Данный образец имел кислотность 34°Т, что недостаточно для обеспечения необходимой кислотности во влагалище и матке коровы. Для доведения кислотности раствора был добавлен фосфатный буфер: однозамещенный 0,8% калий KH₂PO ₄ и 0,18% двузамещенный калий или натрий K₂HPO ₄ или Na₂HPO₄, для обеспечения микроорганизмов дополнительными питательными веществами добавлено 2% глюкозы, 0,125% поваренной соли, после этого в среду внесены приготовленные культуры Lactobacillus fermentum 44/1 и Lactococcus lactis subsp. Lactis 57₄ no 1 млрд микробных клеток на 100 мл среды, расфасовывались и термостатировались 48 часов при t=37°C. Для увеличения уровня кислотности в препарат ввели 0,5% восьмидесятипроцентной молочной кислоты.

Пример 2:

Корова Зоря 2008 года рождения отелилась 18.06.2012. Сразу после отела корове двукратно ввели полученный бактериальный препарат внутриматочно с помощью шприца Жане. Корова не заболела послеродовым эндометритом, через 2 недели матка при ректальном исследовании находилась в тазовой полости, реагировала на массаж. Животное пришло в охоту через 87 дней и было оплодотворено осеменатором.

Апробация гипролама после отела для профилактики послеродового эндометрита выявила профилактический эффект 85,7%. Оплодотворилось 100%. Сервиспериод составил 92 дня

Препарат экологически чистый и в период его применения не требуется выбраковки молока.