способ экспресс-диагностики отравлений гемолитическими ядами

Формула изобретения

Способ экспресс-диагностики отравлений гемолитическими ядами, включающий исследование плазмы крови, отличающийся тем, что при использовании 0,005-0,01% раствора додецилсульфата натрия в пробе плазмы периферической, в том числе капиллярной, крови все фракции гемоглобина трансформируют в течение нескольких секунд при соотношении проба:реагент 1:10, фотометрируют при длинах волн 540 и 700 нм, рассчитывают концентрацию внеэритроцитарного гемоглобина и при значении внеэритроцитарного гемоглобина более 1,0 г/л диагностируют отравление гемолитическими ядами.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для экспресс-диагностики отравлений гемолитическими ядами как в лабораториях стационаров, так и в военно-полевых условиях.

Особую актуальность проблема острых и хронических отравлений приобрела в последние десятилетия вследствие накопления в окружающей среде огромного количества химических веществ антропогенного происхождения. По данным Всемирной организации здравоохранения, в 60-х гг. в странах Западной Европы по поводу острых отравлений госпитализировали в среднем 1 человека на 1000 жителей, в 90-х гг. - почти вдвое больше. Эти больные составляют до 15-20% всех лиц, экстренно поступающих на стационарное лечение по неотложным показаниям. Всего в мире в 2000 г. от отравлений погибло около 250000 человек - 4,3% от общего числа умерших (Лужников Е.А., Суходолова Г.Н., 2008). Среди бытовых отравлений и суицидальных попыток лидирующее место занимают медикаменты, уксусная кислота и технические жидкости. При острых отравлениях поражение крови обычно вызвано токсическим воздействием гемотоксикантов на эритроциты с образованием патологических форм гемоглобина или гемолизом, что вызывает гемическую гипоксию. Быстрые и доступные методы диагностики химических отравлений имеют особую актуальность для клинической и военной токсикологии (Соколова Н.А., Витковский Ю.А., Говорин А.В., 2011; Кирюшин В.А. с соавт., 2004).

Как правило, диагноз отравления гемолитическими ядами устанавливают на основании лабораторного определения концентрации внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ), появляющегося в плазме крови в результате прямого токсического повреждения мембран эритроцитов (Лужников Е.А., Суходолова Г.Н., 2008).

Известен способ определения концентрации ВЭГ, как дополнительный способ диагностики. Исследование проводили с использованием гемиглобинцианидного метода при длине волны 540 нм (Левина Л.Д., Безуглова И.А., Безуглов Д.А., 1993). Для этого кровь в количестве 2-3 мл брали из вены сухой холодной иглой, «самотеком» собирая в сухую пробирку. После центрифугирования (10 минут при 1500 об/мин) в кювету спектрофотометра СФ-46 с длиной оптического пути 10 мм вносили 0,4 мл исследуемой сыворотки. Непосредственно перед спектрофотометрированием добавляли 1,6 мл стандартного трансформирующего реактива Драбкина. Оптическую плотность определяли при длине волны 540 нм против трансформирующего раствора. Для расчета концентрации ВЭГ использовали формулу ВЭГ=E _540*16,1_*5/11,0, где E₅₄₀ - экстинкция испытуемого раствора; 16,1 - относительная молекулярная масса гемоглобина; 5 - фактор разведения сыворотки крови; 11,0 - миллимолярный коэффициент экстинкции для гемиглобинцианида.

Недостатками способа являются: использование для анализа сыворотки, что увеличивает время исследования на 20-30 минут за счет свертывания крови, большой объем сыворотки (0,4 мл), токсичность реагента (цианид калия), и интерференция соединений, поглощающих на этой длине волны (билирубин, триглицериды). Исследование не натощак или у пациентов с желтухой приводит к ложноположительным результатам и гипердиагностике. Помимо этого, авторами не определена концентрационная дискриминанта, выше которой диагностируется внутрисосудистый гемолиз.

Известен способ, принятый за ближайший аналог, определения концентрации ВЭГ плазмы (сыворотки) крови гемиглобинцианидным методом (Тонкошкурова О.А., Дмитриев А.И., Дмитриева Р.Е., 1996), основанный на вышеописанной реакции с таким же реагентом, отличающийся фотометрией на дополнительной длине волны 670 нм. Способ осуществляли следующим образом: к 0,5 мл сыворотки (плазмы) крови добавляли 3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл трансформирующего раствора, перемешивали и через 1-2 минуты фиксировали оптическую плотность при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм) против воды в качестве холостой пробы. Затем, не вынимая кювет из фотоэлектроколориметра, регистрировали оптическую плотность при длине волны 670 нм. Концентрацию ВЭГ рассчитывали по формуле: ВЭГ (г/л)=(D540-D670)×K×8/251, где D540 и D670 - значения оптической плотности, измеренные при 540 и 670 нм; K - калибровочный коэффициент, найденный в соответствии с инструкцией к стандартному набору реактивов для определения гемоглобина гемиглобинцианидным методом; 8 - степень разведения сыворотки (плазмы) крови; 251 - разведение крови, рекомендуемое инструкцией к набору реактивов.

Недостатками способа являются: большой объем пробы (0,5 мл), токсичность реагента (цианид калия) и отсутствие конкретной величины, выше которой диагностируется гемолиз.

Задачи: исключение ядовитого компонента из состава реагента, сокращение времени проведения анализа, снижение интерференции компонентов пробы, минимизация количества биоматериала, необходимого для исследования, повышение эффективности диагностики.

Сущность изобретения: способ экспресс-диагностики отравлений гемолитическими ядами, включающий исследование плазмы крови, отличающийся тем, что при использовании 0,005-0,01% раствора додецилсульфата натрия в пробе плазмы периферической, в том числе капиллярной, крови все фракции гемоглобина трансформируют в течение нескольких секунд при соотношении проба:реагент 1:10, фотометрируют при длинах волн 540 и 700 нм, рассчитывают концентрацию внеэритроцитарного гемоглобина и при значении внеэритроцитарного гемоглобина более 1,0 г/л диагностируют отравление гемолитическими ядами.

Техническим результатом изобретения является повышение качества и своевременности диагностики отравлений гемолитическими ядами за счет снижения интерференции билирубина и триглицеридов в пробе, возможности использования для анализа плазмы капиллярной крови вместо венозной, уменьшения объема материала, необходимого для анализа в 5-10 раз, сокращения времени исследования в 4-5 раз, минимизации трудозатрат персонала, использования нетоксичного реагента без цианистых солей. Все это в целом способствует повышению уровня оказания токсикологической помощи и снижению летальности госпитализируемых больных.

Способ осуществляют следующим образом.

У пациента из любого доступного периферического сосуда (артерия, вена) или из капиллярного русла (дистальная фаланга пальца или мочка уха) берут кровь в количестве 0,2-0,5 мл. Кровь в пробирке смешивают с каплей раствора любого антикоагулянта для предотвращения свертывания и получения плазмы. Тип антикоагулянта не влияет на результат исследования, поэтому он может быть выбран исходя из возможностей лаборатории и стационара (гепаринат натрия, гепаринат лития, этилендиаминтетраацетат трикалия, цитрат натрия). Сразу же после взятия образец крови центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 2-5 минут.

0,1 мл плазмы смешивают с 1,0 мл 0,005-0,01% раствора додецилсульфата натрия, встряхивают в течение нескольких секунд, переливают в кювету фотометра и дважды фотометрируют при длинах волн 540 и 700 нм соответственно. Рассчитывают разницу оптических плотностей по формуле: E _Hb=E₅₄₀-E₇₀₀.

Расчет концентрации ВЭГ в пробе производят или умножением разницы оптических плотностей на коэффициент молярной экстинкции (К=10,16), или по калибровочному графику, построенному с использованием эталонных растворов гемоглобина - гемолизатов (Долгов В.В., Ованесов Е.Н., Щетникович К. А., 2004). При значении ВЭГ более 1,0 г/л диагностируют отравление гемолитическими ядами.

Предлагаемый способ апробирован на 162 симулянтных образцах человеческой крови с различными антикоагулянтами, осмотический гемолиз в которых был вызван добавлением дистиллированной воды в соотношении 10:1 соответственно. После часовой экспозиции в них определяли концентрацию ВЭГ гемиглобинцианидным и предлагаемым способом, а также общий билирубин по Ендрашику-Грофу и триглицериды энзиматическим фотометрическим методом. Сравнительная характеристика способов определения ВЭГ приведена в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная характеристика способов определения внеэритрицитарного гемоглобина.
	Ближайший аналог	Предлагаемый способ
Время инкубации	1-2 минуты	15-30 секунд
Объем пробы	0,5 мл	0,02-0,1 мл
Объем реагента	3,5 мл	0,2-1,0 мл
Соотношение проба/реагент	1/7	1/10
Наличие цианидов в составе реагента	Да	Нет

В результате экспериментальной части работы были определены аналитические характеристики предлагаемого способа:

- чувствительность - 0,02 г/л,

- линейность - до 28,00 г/л,

- коэффициент вариации - 7,0%.

При исследовании концентрации ВЭГ у 613 клинически здоровых добровольцев были получены следующие результаты: медиана - 0,16 г/л, 25^й и 75^й персентили - 0,09 и 0,19 г/л соответственно.

Результаты корреляционного анализа прототипа и предлагаемого способа приведены в приложении «Корреляционная связь между концентрацией ВЭГ, определенной двумя способами». График демонстрирует сильную положительную корреляционную связь между двумя методическими подходами (r=0,878 при p<<0,0001), что свидетельствует об аналитических качествах способа не хуже прототипа (см. чертеж).

Для оценки интерференции общего билирубина (С_бил) и триглицеридов (С_триг ) при использовании обоих способов также был применен регрессионный анализ для ВЭГ и, так называемой, «интерферирующей величины» (ИВ), рассчитанной как С_бил*С_триг*5. Коэффициент корреляции для ИВ и способа-прототипа составил 0,808, для ИВ и предлагаемого способа - 0,740, что говорит о меньшей интерференции билирубина и триглицеридов при определении ВЭГ предлагаемым способом.

Помимо этого, нами апробирована автоматизация предлагаемого способа для выполнения на биохимических анализаторах различной производительности («А-25», BioSystems, Испания; «AU-640», Olympus, Япония; «KoneLab-20», ThermoScientific, Финляндия). В качестве примера приведена аппликация методики (таблица 2), отражающей предлагаемый способ, для автоматического биохимического анализатора «А-25», BioSystems (Испания).

Таблица 2
Пример аппликации предлагаемого способа определения внеэритроцитарного гемоглобина для программирования автоматических биохимических анализаторов.
Внеэритроцитарный гемоглобин	Сыворотка/плазма
Общие параметры:
Режим анализа	Монореактив. Конечная точка
Турбидиметрический тест	Нет
Единицы измерения	г/л
Тип реакции	Возрастающая
Количество повторов	1
Десятичные знаки	2
Имя теста в отчете для пациента	ВЭГ
Процедура:
Считывание	Бихроматика
Основная длина волны	540 нм
Референтная длина волны	700 нм
Объем пробы	20 мкл
Объем реагента 1	200 мкл
Объем реагента 2	-
Объем промывки	1,0 мл
Время считывания 1	Циклы - 3/Секунды - 36
Время считывания 2	-
Время добавления реагента 2	-
Фактор предразведения	-
Фактор постразведения	-
Автоматический повтор	Нет
Калибровка:
Повтор бланка	2
Повтор калибратора	3
Тип калибровки	Монокалибратор
Фактор	-
Концентрация	0,6
Калибровочная кривая	Линейная
Контроли:
Количество контролей	2
Повтор контроля	1
Сигмы	3
Тип контроля	Водный. Моно.
Опции:
Бланк только с реагентом	Нет
Бланк с физраствором	Да
Предел абсорбции бланка	0,05
Предел бланка кинетики	-
Предел линейности	28,00 г/л
Предел чувствительности	0,02 г/л
Пределы фактора	-
Нормальные значения	0,00-0,30
Категории повторения	-

При соответствующих возможностях лаборатории автоматизация способа не только облегчает и повышает достоверность диагностики, снижая трудозатраты медицинского персонала, но и значимо уменьшает объем материала, необходимого для анализа (в нашем примере - всего 0,02 мл плазмы).

Клиническая часть апробации была проведена на 19 пациентах с верифицированным диагнозом «отравление уксусной кислотой», как наиболее часто встречающимся видом отравлений гемолитическими ядами в быту, госпитализированных в отделение анестезиологии и реанимации № 7 Краевой клинической больницы № 1 г.Краснодара в 2005-2011 гг.

Пример 1. Больная К., 28 лет (ИБ 2039). Поступила в отделение анестезиологии и реанимации № 7 Краевой клинической больницы № 1 г.Краснодара 04.02.2009 года с диагнозом: отравление уксусной эссенцией.

При поступлении отмечалось крайне тяжелое состояние пациентки. Помимо стандартных лабораторных исследований в первые и третьи сутки было проведено определение концентрации ВЭГ предлагаемым способом: у пациентки из кубитальной вены была взята кровь в количестве 0,5 мл, которую в пробирке смешали с каплей раствора гепарината натрия и центрифугировали 3 минуты при 2500 об/мин.

0,1 мл плазмы смешали с 1,0 мл 0,005% раствора додецилсульфата натрия, встряхивали нескольких секунд и дважды фотометрировали при длинах волн 540 и 700 нм соответственно. Рассчитали разницу оптических плотностей по формуле: E_Hb=E₅₄₀-E₇₀₀. По калибровочному графику определили концентрацию ВЭГ - 29,61 г/л.

Концентрация ВЭГ превышала 1,0 г/л почти в 30 раз. У пациентки было подтверждено отравление гемолитическими ядами (уксусной кислотой), сразу же была начата интенсивная терапия с применением эфферентных методов, на третьи сутки отмечалась положительная динамика показателей красной крови (таблица 3).

Таблица 3
Динамика результатов лабораторных исследований пациентки К., 28 лет.
Тесты	1 сутки	3 сутки
Гемоглобин цельной крови, г/л	92	103
Эритроциты, ×1012 /л	2,03	3,03
ВЭГ, г/л (предлагаемый способ)	29,61	10,92

Спустя 21 день пациентка была переведена в гастроэнтерологическое отделение для долечивания. В дальнейшем в ЛОР-центре было проведено бужирование пищевода для восстановление его проходимости. В удовлетворительном состоянии пациентка выписана домой.

Пример 2. Больная Л., 34 года (ИБ 39113). Поступила в отделение анестезиологии и реанимации № 7 Краевой клинической больницы № 1 г.Краснодара 08.07.2009 года с диагнозом: алкогольное опьянение, отравление уксусной кислотой?

При поступлении из-за алкогольного опьянения и отсутствия родственников сбор анамнеза был невозможен. Состояние пациентки было стабильным: не наблюдалось выраженных гемодинамических нарушений, в отделяемом желудка по зонду отсутствовала кровь, диурез был сохранен. Помимо стандартных лабораторных исследований при поступлении было проведено определение концентрации ВЭГ предлагаемым способом: у пациентки из кубитальной вены была взята кровь в количестве 0,5 мл, которую в пробирке смешали с каплей раствора этилендиаминтетраацетата трикалия и центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин.

0,1 мл плазмы смешали с 1,0 мл 0,01% раствора додецилсульфата натрия, встряхивали нескольких секунд и дважды фотометрировали при длинах волн 540 и 700 нм соответственно. Рассчитали разницу оптических плотностей по формуле: E_Hb=E₅₄₀ -E₇₀₀. По калибровочному графику определили концентрацию ВЭГ - 0,21 г/л.

Согласно предлагаемому способу концентрация ВЭГ не превышала 1,0 г/л, что исключает отравление гемолитическими ядами. Другие показатели красной крови также были в пределах нормы (таблица 4).

Таблица 4
Результаты лабораторных исследований пациент Л., 34 лет при поступлении в стационар.
Тесты	Результат
Гемоглобин цельной крови, г/л	123
Эритроциты, ×1012/л	3,96
ВЭГ, г/л (предлагаемый способ)	0,21

После купирования алкогольного опьянения больная призналась, что факта приема уксусной кислоты не было. В связи с нормализацией общего состояния пациентка была переведена в гастроэнтерологическое отделение и в дальнейшем выписана.

Выводы: предлагаемый способ позволяет улучшить качество и своевременность диагностики отравлений гемолитическими ядами за счет снижения интерференции билирубина и триглицеридов, возможности использования для анализа капиллярной крови вместо венозной, уменьшения объема материала, необходимого для анализа в 5-10 раз, сокращения времени исследования в 4-5 раз, использования нетоксичного реагента без цианистых солей. Все это, в целом, способствует повышению уровня оказания токсикологической помощи и снижению летальности при отравлениях гемолитическими ядами.

Источники информации

1. Лужников Е.А., Суходолова Г.Н. Клиническая токсикология. - 4-е изд., перераб., и доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - 578 с.

2. Соколова Н.А., Витковский Ю.А., Говорин А.В. Поражение сердечно-сосудистой системы при остром отравлении уксусной кислотой. - Томск; Чита: Изд-во «Иван Федоров», 2011. - 120 с.

3. Кирюшин В.А. с соавт. Токсикология химически-опасных веществ и мероприятия в очагах химического поражения. - Рязань, 2004. - 163 с.

4. Левина Л.Д., Безуглова И.А., Безуглов Д.А. Клиническое значение исследования свободного гемоглобина в сыворотке крови при вирусном гепатите // Лабораторное дело. - 1993. - № 3. - С.23-25.

5. Тонкошкурова О.А., Дмитриев А.И., Дмитриева Р.Е. Определение концентрации внеэритроцитарного гемоглобина плазмы (сыворотки) крови гемиглобинцианидным методом // Клиническая лабораторная диагностика. - 1996. - № 2. - С.21-22.

6. Долгов В.В., Ованесов Е.Н., Щетниковач К.А. Фотометрия в лабораторной практике. - СПб, 2004. - С.66-79.