способ прогнозирования развития репродуктивных нарушений

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития репродуктивных нарушений путем определения в биологических жидкостях параметров местного иммунитета, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости у мужчин исследуют эякулят, а у женщин - цервикальное отделяемое на десятый день менструального цикла, в качестве параметров местного иммунитета определяют уровни интерлейкина 1 бета и интерферона гамма и при одновременном содержании интерлейкина 1 бета больше (38,8±3,8) пг/мл и содержании интерферона гамма больше (8,1±0,5) пг/мл прогнозируют формирование репродуктивных нарушений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно, к урологии, дерматовенерологии, акушерству и гинекологии и может применяться для раннего прогнозирования бесплодия.

Актуальность прогнозирования репродуктивных нарушений при урогенитальных микробных воспалениях обусловлена тревожной ситуацией, связанной с увеличением частоты бесплодных браков во всем мире, достигшей 15%. В равной мере распространено как женское, так и мужское бесплодие, составляющее по (30-60) % (Лопаткин Н.А. 2009). Известно, что снижение качества спермы обусловливает вторичное, то есть вызванное приобретенными заболеваниями, мужское бесплодие. В последние 50 лет в большинстве развитых стран мира отмечено снижение качества спермы у мужчин фертильного возраста. Подобная статистика является следствием воздействия экологических, в том числе антропогенных (вредное производство, курение, алкоголь), факторов, гормональных дисфункций, травм. Женское вторичное бесплодие обусловлено, в основном, теми же причинами.

Наряду с указанными, одной из частых причин ухудшения состояния репродуктивной системы мужчин и женщин, являются воспалительные заболевания урогенитального тракта микробной этиологии, распространенные среди населения репродуктивного возраста (Семенов А.В. с соавт., 2009). Это в полной мере относится к микробным уретритам, простатитам, эндоцервицитам и аднекситам (Божедомов В.А. с соавт., 2005; Battaglia С. et all., 2000).

Современной особенностью течения воспалительных урогенитальных микробных заболеваний является доминирование латентных рецидивирующих вялотекущих форм, при которых, несмотря на наличие слабого болевого синдрома, умеренной дизурии и расстройства сексуальной функции, сохраняется относительное субъективное благополучие. Вместе с тем, отсутствие клинических симптомов не исключает, а иногда и способствует (из-за отсутствия явной необходимости обращения к врачу) прогрессированию заболевания и развитию осложнений, в частности, бесплодия.

Следует отметить, что этиологическими агентами урогенитальной патологии могут являться как облигатные патогены (такие, как возбудители гонореи, трихомоноза, урогенитального хламидиоза, генитального герпеса, аногенитальных бородавок), так и другие инфекционные агенты, которые также могут передаваться при половых контактах (микоплазмы, уреаплазмы, представители семейств Enterobacteriaceae, грибы рода Candida и т.д.). В последние годы появились новые данные о патогенности микробных агентов, вследствие чего к возбудителям инфекций, передаваемых преимущественно половым путем (ИППП) стали относить микроорганизмы, которые ранее рассматривались как условно-патогенные. Многими современными исследователями отмечается, что в настоящее время патологические состояния мочеполового тракта чаще всего носят полимикробный характер и связаны с участием в воспалительном процессе ассоциаций патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что влияет на характер и тяжесть течения воспалительного процесса. Поэтому, даже после проведения стандартного курса антимикробной терапии, сохраняется условно-патогенная микрофлора с измененными свойствами, которая участвует в поддержании воспаления, например, постгонорейного негонококкового уретрита.

В алгоритме обследования для установления диагноза «бесплодие» отсутствие микробиологически подтвержденного инфекционного процесса является основанием для исключения микробной этиологии инфертильности у пациентов. Это способствует тому, что ранние этапы формирования нарушений репродуктивной функции вследствие инфекционного агента остаются незамеченными, а применяемые методики фиксируют наличие уже имеющихся нарушений репродуктивной способности у пар, не имеющих успешного зачатия в течение 12 месяцев и более, при условии отсутствия контрацепции (Тиктинский О.Л., 1990).

Уровень техники

Известен традиционный способ диагностики мужского бесплодия путем макро- и микроскопической оценки качества спермы с определением количества сперматозоидов в 1 мл эякулята, с учетом подвижности сперматозоидов, доли морфологически измененных форм и концентрации лейкоцитов (SU 1330567, 15.08.1987).

Недостатком способа является то, что количественные и функциональные изменения в составе спермы являются достаточно поздним критерием сформировавшегося, зачастую малообратимого, бесплодия, что делает невозможным его применение для прогнозирования и ухудшает эффективность проводимой коррекции.

Известен способ диагностики нарушения репродуктивной функции у мужчин, включающий исследование биологической жидкости путем проведения иммуноферментного анализа, определения концентрации антител, специфических к компонентам мужских репродуктивных тканей, выраженной в единицах оптической плотности (ОП), при котором в качестве биологической жидкости исследуют сыворотку крови пациента, в качестве компонентов мужских репродуктивных тканей используют ядерный антиген пахитенных сперматоцитов грызунов и при значении ОП, равной или превышающей 0,37, диагностируют наличие нарушения репродуктивной функции у мужчин (RU 2419097, 20.05.2011).

Однако описанный способ позволяет поставить диагноз только при аутоиммунном бесплодии, что является его недостатком. Недостатком способа также является невозможность ранней диагностики бесплодия.

Известен способ диагностики патологии женской репродуктивной функции, включающий отбор и исследование околоплодных вод на провоспалительные цитокины ("Актуальные проблемы невынашивания беременности /Цикл клинических лекций под редакцией д.м.н., профессора, заслуженного деятеля науки РФ Сидельниковой В.М.", М, // Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, отделение терапии и профилактики невынашивания беременности, 2001, с.61).

Недостатками этого способа являются его длительность, опасность для развивающегося плода, применение для диагностики только у женщин уже имеющих беременность (невозможность применения для прогнозирования бесплодия).

В диагностике женского бесплодия известен способ диагностики генеративной потенции яичников, заключающийся в приготовлении гистологических срезов ткани яичников и определении доли половых клеток каждой стадии от числа всех подсчитанных гамет и сравнении с контрольными индексами (RU 2367949, 20.09.2009).

Недостатками данного способа являются травматичность (взятие биопсии), трудоемкость и необходимость операционной для выполнения метода. Недостатком способа является и то, что диагностируется уже сформировавшаяся патология ткани яичников, то есть этим способом невозможно осуществить прогнозирование репродуктивных нарушений..

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции (RU 2341799, 20.12.2008) путем определения в биологической жидкости уровня интерлейкина двенадцать (ИЛ-12), отличающийся тем, что в слизи цервикального канала определяют уровень ИЛ-12 и при его значениях 102,0 пг/мл и выше прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в 1 и 2 триместре.

Недостатком способа является то, что он разработан для прогнозирования нарушения репродуктивной функции уже у беременных женщин и не позволяет оценить риск раннего нарушения репродукции (зачатия).

Наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому эффекту к предлагаемому способу является способ диагностики мужского бесплодия по уровню лизоцима (SU 1601576, 23.10.1990). Способ заключается в том, что в эякуляте определяют уровень лизоцима и при содержании лизоцима в сперме 2,4 мкг/мл и менее диагностируют мужское бесплодие. Данный способ взят в качестве прототипа

В указанном способе также оценивается биологическая жидкость, в которой определяют концентрацию фактора местного иммунитета. Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков. Этот способ позволяет выявить только значительные изменения в составе эякулята, не регистрируя предикторов нарушения качества семенной жидкости, что является его недостатком. Лизоцим является бактерицидным фактором секрета слизистой оболочки и может служить показателем уже развившегося воспаления. Между тем, абсолютно необходимой является ранняя диагностика развивающихся репродуктивных нарушений, так как от этого напрямую зависит тактика и успешность лечения. Другим недостатком данного способа является то, что он не предназначен для оценки фертильной способности женщин.

Задача изобретения

Задача изобретения - обеспечение возможности прогнозирования развития вторичного бесплодия, как у мужчин, так и у женщин при урогенитальных заболеваниях микробной этиологии.

Новизной предлагаемого способа является то, что раннее прогнозирование достигается за счет одновременного оценивания содержания в биологической жидкости интерлейкина 1 бета (ИЛ-1 ) и интерферона гамма (IFN- ), поскольку они являются информативными критериями формирования инфертильности.

Предлагаемый способ неизвестен из уровня техники, следовательно, является новым.

Раскрытие изобретения

Существенным отличием предлагаемого изобретения является то, что в качестве биологической жидкости у мужчин исследуют эякулят, а у женщин - цервикальное отделяемое на десятый день менструального цикла, в качестве параметров местного иммунитета определяют уровни интерлейкина 1 бета и интерферона гамма и при содержании интерлейкина 1 бета больше 38,8±3,8 пг/мл и одновременном содержании интерферона гамма больше 8,1±0,5 пг/мл прогнозируют формирование репродуктивных нарушений.

Технический результат

Технический результат, достигаемый при решении поставленной задачи, выражается в раннем выявлении мужчин и женщин, относящихся к группе риска по формированию вторичного, инфекционно обусловленного, бесплодия при отсутствии выраженных клинических симптомов воспаления. С его помощью возможно прогнозирование нарушений репродуктивной функции, а не констатация уже развившегося бесплодия, а так же то, что прогнозирование нарушений репродуктивной функции возможно не только у мужчин, но и у женщин, при этом оценивается не один, а два диагностических маркера, причем оценивается не бактерицидный фактор, а регуляторы (ИЛ-1 и IFN- ) развития воспалительного процесса, при котором возможно принятие превентивных мер по обеспечению возможности успешной реализации репродуктивной функции. Этот способ позволяет заблаговременно выявить развивающуюся инфертильность, пока еще нарушения репродуктивной функции легче поддаются коррекции. Так же предложенный способ обеспечивает возможность скринингового обследования большого количества пациентов обоего пола, а именно раннее прогнозирование нарушений фертильности позволяет предпринять определенные мероприятия по предупреждению развития осложнений, запущенных форм заболевания и, следовательно, улучшить качество и своевременность лечения, уменьшив материальные затраты на терапию.

Новыми признаками заявляемого способа являются:

- прогнозируют развитие репродуктивных нарушений в ранние сроки;

- прогнозирование репродуктивных нарушений возможно как у мужчин, так и у женщин;

- оценивают регуляторы развития воспалительного процесса ИЛ-1 и IFN- ;

- определяют одновременное содержание ИЛ-1 и содержание IFN- в биологической жидкости;

- в качестве биологической жидкости используют не только эякулят у мужчин, но и цервикальное отделяемое на 10-й день менструального цикла у женщин;

- прогнозируют развитие репродуктивных нарушений у пациента при одновременном содержании ИЛ-1 больше 38,8±3,8 пг/мл и содержании IFN- больше 8,1±0,5 пг/мл.

Наличие первого признака в заявляемом способе позволяет осуществить раннее прогнозирование развития репродуктивных нарушений, что затем позволяет своевременно осуществить коррекцию нарушений, пока они не приобрели необратимый характер. Практика ведения пациентов показала, что раннее лечение патологии репродуктивной функции является более эффективным и позволяет избежать социальных и экономических потерь.

Второй новый признак позволяет использовать предлагаемый способ для прогнозирования репродуктивных нарушений у лиц обоего пола, расширяя, таким образом, область применения способа по сравнению со способом-прототипом.

Третий новый признак позволяет оценивать самые ранние из диагностических маркеров - регуляторы воспалительной реакции, что так же обеспечивает прогнозирование бесплодия в ранние сроки.

Четвертый новый признак в заявляемом способе позволяет выявить новые более информативные признаки для прогнозирования формирования бесплодия, что в итоге позволяет осуществить ранний прогноз. Наблюдения показали, что интерлейкин 1 бета и интерферон гамма коррелируют с развитием инфертильности.

Пятый новый признак в заявляемом способе позволяет осуществить второй новый признак.

Шестой новый признак позволяет уточнить третий и четвертый новые признаки, за счет установления одновременного наличия двух граничных значений: уровня интерлейкина 1 бета и уровня интерферона гамма. Каждый из этих факторов косвенно отражает формирование бесплодия у пациента, а вместе эти факторы в итоге позволяют при простой реализации осуществить ранний и точный прогноз.

Новая совокупность признаков позволяет при осуществлении заявляемого изобретения получить новый технический результат, который состоит в том что, выявив ранние прогностические признаки развивающегося бесплодия, можно осуществить адекватный индивидуальный подход к курации пациентов и вовремя провести полноценное лечение.

Осуществление изобретения

В основу предлагаемого способа положено новое знание, полученное в результате лабораторного исследования изменения содержания факторов местного иммунитета, а именно интерлейкина 1 бета и уровня интерферона гамма в секрете урогенитального тракта мужчин и женщин при воспалительных заболеваниях гениталий, вызывающих бесплодие.

Авторы впервые обнаружили, что у пациентов перенесших урогенитальную инфекцию или имеющих латентную урогенитальную инфекцию с формирующимся вторичным микробно обусловленным бесплодием, но не имеющих первичного, эндокринного, аутоиммунного или травматического-бесплодия, в секретах урогенитального тракта повышается уровень интерлейкина 1 бета и одновременно в секретах урогенитального тракта повышается уровень интерферона гамма по сравнению со здоровыми фертильными обследуемыми.

Исследования проведены у 86 пациентов перенесших урогенитальную инфекцию (контроль излеченности) или имеющих латентную урогенитальную инфекцию (46 мужчин и 40 женщин), проходивших обследование в Оренбургском областном центре планирования семьи, областном кожно-венерологическом диспансере и областном перинатальном центре. В исследование были включены женщины с ненарушенным 28-30 дневным менструальным циклом, цервикальное отделяемое забирали для исследования в первую фазу менструального цикла, а именно, на десятый день, чтобы избежать контаминации мукозы компонентами крови или тканей эндометрия, поскольку нормальное менструальное кровотечение может продолжаться до 7 суток. Забор материала во второй фазе менструального цикла не проводился так, как по данным литературы во второй фазе менструального цикла наблюдается закономерное повышение концентрации ИЛ-1 , IFN- и фактора некроза опухоли альфа (TNF ) связанное с физиологическим прорывом фолликула и не отражающего патологического процесса.

У пациентов в эякуляте или цервикальном отделяемом были зарегистрированы повышенные уровни интерлейкина 1 бета и интерферона гамма. В последующем у 37 мужчин и 31 женщины развилось вторичное, инфекционно обусловленное бесплодие.

На момент обследования пациентов не беспокоило отсутствие зачатия, но имелись жалобы на дискомфорт в половых органах, сухость слизистых оболочек, слабые непостоянные боли в паховой области и промежности.

Исследование эякулята и цервикального отделяемого на десятый день менструального цикла у пациентов включало определение ИЛ-1 , IFN- , определялся также уровень лизоцима по способу-прототипу и спермограмма.

С целью установления информативности показателей развития бесплодия была изучена корреляционная зависимость (Гланц С, 1998) между частотой развития в последующем бесплодия и некоторыми иммуноморфологическими показателей на момент первичного обследования (см. таблицу 1).

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о высокой информативности одновременно повышения концентрации ИЛ-1 и IFN- в эякуляте и цервикальном отделяемом для прогнозирования развития репродуктивных нарушений, так как другие рекомендуемые для диагностики бесплодия показатели достоверно не изменялись в столь ранние сроки обследования.

Таблица 1
Корреляция некоторых иммуноморфологических показателей с частотой развития вторичного бесплодия
Иммуноморфологические показатели	Коэффициент ранговой корреляции Спирмена
Лизоцим	0,39*
ИЛ-1	0,52**
IFN-	0,48**
ИЛ-1 и IFN-	0,72***
Спермограмма	0,30*
*** - сильная корреляционная связь ** - корреляционная связь средней силы * - слабая корреляционная связь

Были определены граничные значения интерлейкина 1 бета и интерферона гамма.

Таблица 2
Соответствие уровней исследуемых показателей в биологических жидкостях мужчин и женщин частоте развития бесплодия.
Показатели местного иммунитета
Уровень ИЛ-1 , пг/мл	Уровень IFN- , пг/мл
>38,8±3,8	>8,1±0,5
38,8±3,8	>8,1±0,5
38,8±3,8	8,1±0,5
>38,8±3,8	8,1±0,5

Из таблицы 2 видно, что точность прогнозирования при содержании ИЛ-1 больше 38,8±3,8 пг/мл и одновременном содержании IFN- больше 8,1±0,5 пг/мл составляет 92,65%. Изменение прогностического порога выше или ниже указанных величин нецелесообразно, ввиду снижения доли подтвержденных прогнозов.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для проведения раннего прогнозирования развития репродуктивных нарушений проводится забор исследуемого материала (эякулята у мужчин, отделяемого цервикального канала у женщин). Пробы центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отбирают супернатант (надосадочную жидкость) и проводят необходимые разведения образцов с использованием растворов для разведения проб из комплектов наборов для проведения иммуноферментного анализа (ИФА-набор), с получением рабочего разведения анализируемого образца. Для определения уровня интерлейкина 1 бета выполняют разведение 1/1000, а для определения уровня интерферона гамма - 1/50. В соответствующие лунки планшетов с иммобилизированныим на внутренней стороне поверхности моноклональными антителами к интерлейкину 1 бета или интерферону гамма вносят в дубликатах по 100 мкл каждой калибровочной пробы (стандартные, прилагаются к ИФА-набору, используются для построения калибровочного графика), по 100 мкл контрольного образца и по 100 мкл анализируемых образцов в рабочем разведении. Планшеты инкубируют в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации содержимое лунок удаляют и промывают рабочим промывочным раствором из ИФА-набора, после чего в каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата из того же набора и инкубируют в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. Затем содержимое лунок удаляют и промывают рабочим промывочным раствором из ИФА-набора. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина и инкубируют в темноте в течение 10-15 мин при температуре 18-25°С. Во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента при этом содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Затем проводят измерение величины оптической плотности растворов на фотометре вертикального сканирования на длине волны 450 нм. В соответствии с калибровочной зависимостью определяют массовую концентрацию интерлейкина 1 бета в пг/мл и массовую концентрацию интерферона гамма в пг/мл.

При содержании ИЛ-1 больше 38,8±3,8 пг/мл и одновременном содержании IFN- больше 8,1±0,5 пг/мл прогнозируют формирование репродуктивных нарушений.

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1. Больной А., 31 год, амбулаторная карта № 3105 (2008 г.). Состоит в браке 3 месяца.

В анамнезе перенесенные заболевания: уреаплазмоз, хламидиоз. Проходил контроль излеченности. Уреаплазмы, хламидии не обнаружены. Уровень лизоцима в эякуляте - 4,7 мкг/мл. Спермограмма: объем эякулята -3,5 мл, серовато-белый, срок разжижения 25 минут, рН - 7,4, количество сперматозоидов в 1 мл эякулята - 105-10 ⁶, общее количество сперматозоидов 402-10⁶, активноподвижных - 75%, живые сперматозоиды - 91%, нормальные сперматозоиды - 94%, патологические формы - 4%, клетки сперматогенеза 1,0, лейкоциты 0,4-10⁶.

ИЛ-1 - 40,1±2,9 пг/мл, INF- - 9,4±0,8 пг/мл.

Заключение: У пациента при отрицательных посевах на патогенную микрофлору, отсутствии отклонений от нормы в содержании лизоцима и в спермо-грамме обнаружено одновременное повышение уровней ИЛ-1 и INF- в эякуляте, превосходящее пороговые величины, указанные в предлагаемом способе прогнозирования развития репродуктивных нарушений. Больной оставался на курации. В 2009 году проходил обследование с жалобами на бесплодие - полтора гола. Женский фактор бесплодия исключен. У пациента обнаружено снижение уровня лизоцима до 2,1 мкг/мл, отклонения в сперматограмме-астенозооспермия.

Пример 2. Больной С, 36 лет, амбулаторная карта № 3112 (2008 г.). Состоит в браке 8 лет. Дети: 1 ребенок 5 лет.

В анамнезе - перенесенный трихомониаз, гонорея. Проходил контроль излеченности. Микробиологическое обследование дало отрицательный результат, спермограмма-нормоспермия, уровень лизоцима - 5,3±0,9 мкг/мл, ИЛ-1 -39,7±2,5 пг/мл, INF- - 8,9±0,7 пг/мл.

Заключение: у пациента отмечено одновременное повышение ИЛ- и INF- , превосходящее пороговые значения. Больной оставался на курации. В 2011 году пациент проходил обследование с жалобами на бесплодие в течение 3,5 лет. Женский фактор бесплодия исключен. У пациента в спермоплазме обнаружены антиспермальные антитела (АСАТ) и снижение уровня лизоцима до 1,7±0,2 мг/мл.

Пример 3. Больная Я., 27 лет, амбулаторная карта № 3207 (2008 г.). Разведена. Дети: 1 ребенок. В анамнезе перенесенные урогенитальные инфекции - урогенитальный хламидиоз, гонорея. На контроле излеченности микробиологическое обследование дало отрицательный результат. Уровень ИЛ-1 - 40,3±3,0 пг/мл, INF- - 9,2±0,2 пг/мл. Больная оставалась на курации.

С 2011 года состоит в браке. Во втором браке - жалобы на бесплодие в течение 2 лет.Мужской фактор бесплодия исключен.

Пример 4. Больной Ж. 42, лет, амбулаторная карта № 3121 (2008 г.). Состоит в браке 14 лет. Дети: 2 ребенка.

В анамнезе - перенесенный трихомониаз, гонорея, уреаплазмоз. Вызван для контроля излеченности. Микробиологическое обследование дало отрицательный результат, спермограмма - нормоспермия, уровень лизоцима 5,5±0,7 мкг/мл, ИЛ-1 - 37,2±2,8 пг/мл, INF- - 9,6±0,6 пг/мл. У пациента отмечено повышение INF- превосходящее пороговое значение, указанное в заявляемом способе, ИЛ-1 не был повышен. Больной находился на курации. В 2010 году в семье родился 3-й ребенок, т.е. фертильность мужчины не нарушена.

Пример 5. Больной В. 34 года, амбулаторная карта № 3119 (2008 г.). Состоит в браке 2 года.

В анамнезе перенесенный хламидиоз. Проходил контроль излеченности. Хламидии не обнаружены. Спермограмма - нормоспермия. ИЛ-1р 30,8±0,4 пг/мл, INF- 5,6±0,8 пг/мл, т.е. уровни ИЛ-1 и INF- не повышены. Больной находился на курации. В браке в течение 4 лет появилось двое своих детей.

Данный способ раннего прогнозирования развития репродуктивных нарушений является современным, объективным, легко воспроизводимым. При обследовании больных, перенесших урогенитальную инфекцию, явившихся на контроль излеченности, или имеющих латентную урогенитальную инфекцию, можно своевременно и правильно определить вероятность развития репродуктивных нарушений у пациентов обоего пола и произвести коррекцию дальнейшего ведения пациента, повысив качество лечения и улучшив его результаты.

Литература, принятая во внимание

1. Лопаткин Н.А. Урология. Национальное руководство. // ГЭОТРАР-Медиа.-2009.-1024 с.

2. Семенов А.В., Иванов А.В., Пацановская Т.М. Пути преодоления неэффективности антибактериальной терапии хронического простатита. // Врач. - 2009. - № 6. - С.63-65.

3. Божедомов В.А., Теодорович О.В. Эпидемиология и причины аутоиммунного мужского бесплодия. // Урология - 2005. - № 1. - С.35-44.

4. Battaglia С.et al., Seminal plasma nitrite/nitrate and intratesticular Doppler flow in fertile and infertile subjects. Hum. Reprod., 2000. - vol. 15, № 12. - P. 2554-2558.

5. Руководство по андрологии / под ред. О.Л.Тиктинского. - Л.: Медицина. - 1990.-416 с.

6. ₍₁₉₎SU ₍₁₁₎1330567, 15.08.1987 Способ диагностики мужского бесплодия

7. ₍₁₉₎RU ₍₁₁₎2419097, 20.05.2011 Способ диагностики нарушений репродуктивной функции у мужчин

8. Актуальные проблемы невынашивания беременности / Цикл клинических лекций под редакцией д.м.н., проф. Сидельниковой В.М. // Москва. -2001. -170 с.

9. ₍₁₉₎RU ₍₁₁₎2367949 20.09.2009 Способ диагностики генеративной потенции яичников

10. ₍₁₉₎RU ₍₁₁₎2341799 20.12.2008 Способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции

11. Прототип ₍₁₉₎SU ₍₁₁₎ 1601576 23.10.1990 Способ диагностики мужского бесплодия

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика. -1998. -459 с.